新型兔抗體人源化方法和人源化的兔抗體的製作方法

2023-05-28 01:07:46

專利名稱：新型兔抗體人源化方法和人源化的兔抗體的製作方法
背景技術：
相關申請本申請涉及且要求臨時申請美國序列號60/924，550和60/924，551以及實用新 型專利申請美國序列號11/802，235的優先權，所述專利各自於2007年5月21日提交，並 且其內容通過引用整體合併入本文。此外，本申請要求下述PCT申請的優先權,並且通過 引用整體合併，該PCT申請於2008年5月21日提交，名稱為「IL-6antibodies and Use Thereof and TNF-Alpha Antibodies」，並且所述 PCT 申請以代理人案號 67858-701902 和 67858-701802 提交。本發明提供了基於胺基酸序列和同源性的新型和改良方法，用於修飾(人源化) 兔抗體胺基酸可變重鏈和輕鏈多肽序列或來自緊密相關的物種例如其他兔形目動物的抗 體。相對於親本抗體例如兔抗體,所得到的經修飾的抗體序列在人中具有更少免疫原性或 無免疫原性,並且相對於經修飾的(人源化)抗體序列所衍生來源的親本抗體,保留相同或 基本上相同的抗原結合親和力。本發明進一步提供了衍生自通過此種方法產生的兔抗體的人源化的可變輕鏈和 可變重鏈。如下文所示,本發明的方法可重現地產生保留原始兔抗體的抗原特異性和親和 力的人源化抗體。本發明的操作一般而言依賴於兔抗體互補決定區(CDR)中包含的特定氨 基酸殘基(「選擇性決定殘基」)從兔抗體轉移到同源的人抗體可變重鏈和輕鏈多肽序列 上。在更具體的實施方案中，本發明例示了對於白介素 6(IL 6)或腫瘤壞死因子 a (下文「TNF-a 」)具有結合特異性的人源化抗體及其人源化抗體片段和變體,其使用
。然而，應當理解本文提供的新型人源化方案可應用 目動物衍生抗體的人源化，所述抗體與任何所需抗原特異性結合。這包 染物(病毒、細菌、真菌、寄生蟲等)，變應原，人抗原例如酶、激素、自身 抗原、生長因子、細胞因子、受體、受體配體、免疫調整(immimoregularoty)和免疫調節 (immunomodulatory)分子等的抗原特異的抗體。本發明還涉及使用根據本發明產生的人源化抗體和抗體片段作為治療和用於診 斷用途例如用於體外和體內篩選測定法的方法,用於檢測與此種抗原相關的疾病和病症。 例如,這包括使用針對IL-6或TNF- a的抗體的體內成像篩選方法,和通過施用所述人源化 抗體或其片段治療與TNF-a 抗體在免疫應答中起關鍵作用。它們可以滅活病毒和細菌毒素，並且在召募補體 系統和各種類型的白血細胞以殺死侵入微生物和大型寄生蟲方面是必需的。抗體專有地通 過B淋巴細胞合成，並且以數百萬種形式產生，各種具有不同的胺基酸序列和對於抗原的 不同結合位點。抗體統稱為免疫球蛋白(Ig),屬於血液中最豐富的蛋白質組分。Alberts等人，Molecular Biology of the Cell,第 2 片反，1989, GarlandPublishing, Inc。
典型的抗體是具有2條相同的重(H)鏈(各自包含約440個胺基酸)和2條相同 的輕(U鏈(各自包含約220個胺基酸)的Y形分子。4條鏈通過非共價和共價(二硫) 鍵的組合結合在一起。蛋白水解酶例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶可以使抗體分子分成不同的 特徵片段。木瓜蛋白酶產生各自具有1個抗原結合位點的2個分開且相同的Fab片段,和 1個Fc片段。胃蛋白酶產生1個F(ab' )2片段。Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第 2 片反，1989，GarlandPublishing, Inc。 L和H:鏈都具有在其氨基末端處的可變序列但在其羧基末端處的恆定序列。L鏈具 有長約110個胺基酸的恆定區和相同大小的可變區。H鏈也具有長約110個胺基酸的可變 區，但H鏈的恆定區長約330或440個胺基酸，依賴於H鏈的種類。Alberts等人，Molecular Biologyof the Cell，第 2 版，1989，Garland Publishing, Inc.在第 1019 頁。僅部分可變區直接參與抗原的結合。研究已顯示L和H鏈的可變區中的可變性大 部分限制於每條鏈中的3個小高變區(也稱為互補決定區,或CDR)。可變區的其餘部分稱 為構架區(FR)是相對恆定的。Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第2版， 1989, GarlandPublishing, Inc.在第 1019-1020 頁。天然免疫球蛋白已在測定法、診斷和至更有限程度的治療中使用。然而，特別是在 治療中的此種用途已受天然免疫球蛋白的多克隆性質所阻礙。限定特異性的單克隆抗體的 出現增加用於治療用途的機會。然而，在用靶蛋白質免疫接種嚙齒類動物宿主動物，以及產 生目的抗體的嚙齒類動物脾細胞與嚙齒類動物骨髓瘤細胞的後續融合後，產生大多數單克 隆抗體。因此,它們基本上是嚙齒類動物蛋白質,並且像這樣在人中是天然免疫原性的，常 常產生不希望有的免疫應答稱為HAMA(人抗小鼠抗體)應答。許多團體已設計了減少治療性抗體的免疫原性的技術。傳統地，通過與供體抗體 的同源性程度選擇人模板,即將在可變區中與非人抗體最同源的人抗體用作模板用於人源 化。基本原理是構架序列用於使CDR保持在其正確的空間方向上用於與抗原相互作用，並 且構架殘基有時甚至可以參與抗原結合。因此,如果所選擇的人構架序列最類似於供體 構架的序列，那麼這將使親和力保留在人源化抗體的可能性達到最大。例如，Winter(EP No. 0239400)提出使用長寡核苷酸通過定點誘變產生人源化抗體，以便移植來自每個重鏈 和輕鏈可變區的3個互補決定區(CDR1、⑶R2和CDR3)。儘管這種方法已顯示出起作用，但 它限制了選擇支持供體CDR的最佳人模板的可能性。儘管人源化抗體在人中比其天然或嵌合配對物具有更少免疫原性，但許多團體發 現CDR移植的人源化抗體可能顯示顯著降低的結合親和力(例如，Riechmann等人，1988， Nature 3 32:323-327)。例如，Reichmann和同事發現CDR區單獨的轉移在CDR移植的產 物中不足以提供滿意的抗原結合活性，並且還必須使人序列在位置27處的絲氨酸殘基轉 變成相對應的大鼠苯丙氨酸殘基。這些結果指出對人序列在CDR區外的殘基的改變可能是 必須的，以獲得有效的抗原結合活性。即使如此，結合親和力仍顯著低於原始單克隆抗體的 那種。例如，Queen等人(美國專利號5, 530，101)描述了與白介素_2受體結合的人源 化抗體的製備，其通過使鼠類單克隆(抗Tac MAb)的CDR與人免疫球蛋白構架和恆定區相 組合。選擇人構架區以使與抗Tac Mab序列的同源性達到最大。此外，將計算機建模用於鑑定可能與CDR或抗原相互作用的構架胺基酸殘基,並且在人源化抗體中的這些位置處使 用小鼠胺基酸。據報告獲得的人源化抗Tac抗體具有對於白介素-2受體(p55)3xl0_9 M—1 的親和力，這仍僅是鼠類Mb的親和力的約三分之一。其他團體鑑定了在可變區的構架內的進一步位置(即，在可變區的a)R和結構環 外)，在其上殘基的胺基酸同注可能促成獲得具有滿意的結合親和力的CDR移植產物。參 見例如，美國專利號6，054，297和5，929，212。然而，可能無法預先了解特定CDR移植排列 對於任何給定目的抗體如何有效。l,eung(美國專利申請公開號US 2003/0040606)描述了構架修補(patching)方 法，其中將免疫球蛋白的可變區劃分成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4,並且通過非 人抗體和人抗體模板之間的最佳同源性選擇個別FR序列。然而，這種方法是勞動密集型 的，並且可能不容易鑑定最佳構架區。隨著更多治療性抗體被開發並且持有更有希望的結果，能夠減少或消除所施用的 抗體引起的機體的免疫應答是重要的。因此，允許有效和快速改造抗體成為人樣和/或允 許使抗體人源化的勞動減少的新方法提供極大的利益和醫學價值。本文參考文獻的引用或討論不應解釋為這是本發明的現有技術的承認。發明概述本發明部分基於用於產生人源化可變重區域和/或輕區域和包含此種人源化可 變重區域和輕區域的人源化抗體或抗體片段的新人源化策略，所述區域衍生自兔或其他兔 形目動物抗體。優選地,用於人源化的這些兔或其他兔形目抗體衍生抗體衍生自得自免疫 接種兔的克隆B細胞群體。更具體而言,本發明提供了用於人源化衍生自兔或另一種兔形目動物抗體的抗體 可變輕鏈的新型人源化策略，其依賴於選擇合適的同源人輕鏈可變序列和保留兔輕鏈CDR 中包含的特定選擇性決定殘基作為人源化策略的部分。「選擇性決定殘基」在下文中更詳細地定義，但基本上對應於兔a)R區中包含的特 定胺基酸殘基,與用於衍生人源化抗體的人種系CDR中包含的相對應胺基酸殘基比較,基 於其結構和/或化學性質，所述胺基酸殘基被認為對抗原識別和/或抗原結合具有顯著影 響。此外,更具體而言，本發明提供了用於人源化衍生自兔或另一種兔形目動物抗體 的抗體可變重鏈的新型策略,其依賴於選擇合適的同源重鏈可變序列和保留特定選擇性決 定殘基作為人源化策略的部分。此外，更具體而言，本發明提供了用於產生包含人源化可變重鏈和/或輕鏈的人 源化抗體和抗體片段的新型人源化策略,所述鏈衍生自兔或另一種兔形目動物抗體可變重 鏈和輕鏈多肽。更具體而言，本發明提供了用於產生衍生自兔形目動物(兔)輕鏈抗體序列的人 源化輕鏈抗體序列的人源化策略，其包括下述步驟(1)從與所需抗原特異性結合的兔抗體獲得兔輕鏈抗體序列，並且鑑定跨越所包 括的構架1(FR1)開始到構架3(FR3)結束的氨基殘基；(i i)使用跨越FR1幵始到FR3結束序列的所述兔輕鏈抗體胺基酸序列進行針對包 含人輕鏈抗體可變序列的文庫的同源性搜索，並且鑑定對其顯示基本序列同源性的人輕鏈抗體序列，即相對於文庫中的其他人輕鏈抗體可變序列，優選與其具有至少80% -90%同 一性和/或在胺基酸水平上顯示最大的序列同一性；(iii)在兔和人輕鏈可變序列中鑑定對應於FRl、TO2、ra3、CDRl、CDR2區域的排列 及其特定殘基,並且比對在兔和所選擇的人抗體輕鏈中的這些不連續區域；(iv)構建DNA或胺基酸序列,其中將所選擇的同源人輕鏈序列的CDR1和CDR2區 域中至少不同於兔輕鏈CDR1和CDR2中的相對應選擇性決定殘基的胺基酸殘基用兔CDR1 和CDR2區域中的相對應選擇性決定殘基替代；(v)將編碼或包含兔CDR3輕鏈抗體序列的相對應胺基酸殘基的DNA序列或多肽進 一步附著至通過步驟(iv)獲得的DNA或胺基酸序列；(vi)進一步選擇與兔輕鏈中包含的FR4同源且優選與其相差至多2-4個胺基酸殘 基的人輕鏈構架4區(FR4),並且使編碼所述人FR4的DNA序列或所述人FR4的相對應氨基 殘基附著至在步驟(v)後獲得的DNA或胺基酸序列上；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔輕鏈序列的DNA或氨 基酸序列。此外，更具體而言，本發明提供了用於產生來自兔重鏈抗體序列的人源化重鏈抗 體序列的人源化策略,其包括下述步驟(i)從與所需抗原特異性結合的兔抗體獲得兔重鏈抗體序列，並且鑑定跨越所包 括的構架1(FR1)幵始到構架3(FR3)結束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結束序列的所述兔重鏈抗體胺基酸序列進行同源性 搜索(例如，通過包含人種系抗體序列的文庫的BLAST搜索)，並且鑑定與其同源的人重鏈 抗體序列，即相對於文庫中的其他人重鏈抗體可變序列,優選在胺基酸水平上與其具有至 少80% -90%同一性和/或在胺基酸水平上顯示最大的序列同一性；(iii)在兔和人重鏈序列中鑑定對應於FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2區域的排列及其 特定殘基，並且針對所選擇的同源人抗體重鏈的相對應區域比對兔的這些不連續區域；(iv)構建DNA或胺基酸序列,其中將所選擇的同源人重鏈序列的CDR1和CDR2區 域中至少不同於兔重鏈CDR1和CDR2區域中的相對應選擇性決定殘基的胺基酸殘基用兔重 鏈序列的CDR1和CDR2區域中包含的相對應選擇性決定殘基替代，並且進一步任選用兔重 鏈FR1的相對應末端1-3個胺基酸替換人重FR1區的末端1 3個胺基酸；和/或任選用兔 重鏈構架2的相對應末端胺基酸殘基替換人重鏈構架2區域的末端胺基酸,和/或任選用 相對應人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替換來自兔重鏈CDR2的末端的第4個胺基酸(一般 是色氨酸)；(v)將編碼或具有兔重鏈⑶R3的相對應胺基酸殘基的DNA序列進一步附著至通過 步驟(iv)獲得的DNA或胺基酸序列,所述胺基酸殘基包含在相同的兔重鏈抗體序列中；並 且所述兔CDR3長度一般是5-19個胺基酸(並且其中所述CDR3 一般在殘基WGXG前並且進 一步其中X—般是Q或P)；(vi)進一步選擇與其同源的人重鏈構架4區域(FR4)(優選與人源化的兔抗體重 鏈序列中包含的FR4相差至多4個胺基酸殘基),並且使編碼所述所選擇的同源人FR4的 DNA序列或所述人FR4的相對應氨基殘基附著至在步驟(v)後獲得的DNA或胺基酸序列上 (通常這種人FR4 DNA或多肽序列將編碼或包含WGQGTLVTVSS)；和
(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔重鏈序列的DNA或氨
基酸序列。此外，更具體而言，本發明提供了用於產生人源化抗體或抗體片段的人源化策略， 所述人源化抗體或抗體片段包含衍生自兔輕鏈抗體序列的至少一種人源化輕鏈抗體序列 和/或衍生自兔抗體重鏈的至少--種人源化重鏈序列，其中此種人源化輕鏈和/或重鏈序 列根據下述步驟衍生自兔重鏈和輕鏈(i)從對所需抗原特異的兔抗體獲得兔輕鏈抗體序列，並且鑑定跨越所包括的構 架1 (FR1)開始到構架3(FR3)結束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR 3結束序列的所述兔輕鏈抗體胺基酸序列進行針對 包含人輕鏈抗體序列的文庫的同源性搜索，並且鑑定與其同源的人輕鏈抗體序列，即相對 於文庫中的其他人輕鏈抗體可變序列,優選在胺基酸水平上與其至少80% -90%等同和/ 或在胺基酸水平上顯示最大的序列同一性；(iii)在兔和人輕鏈序列中鑑定對應於FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2區域的排列及其 特定殘基，並且比對兔輕鏈的這些不連續區域與所選擇的同源人輕鏈區的相對應區域；(iv)構建DNA或胺基酸序列，其中將所選擇的同源人輕鏈序列的CDR1和CDR2區 域中至少不同於兔可變輕鏈CDR1和CDR2區域中的相對應選擇性決定殘基的胺基酸殘基用 兔輕鏈序列的兔CDR1和CDR2區域中的相對應選擇性胺基酸殘基替代；(v)將編碼或具有兔輕鏈抗體序列中包含的CDR3的相對應胺基酸殘基的DNA序列 進一步附著至通過步驟(iv)獲得的DM或胺基酸序列；(vi)進一步選擇與所述兔抗體輕鏈中包含的FR4同源且人FR4優選與兔抗體輕 鏈序列的FR4相差至多2-4個胺基酸殘基的人輕鏈構架4區(FR4),並且使編碼所述人FR4 的DNA序列或所述人FR4的相對應氨基殘基附著至在步驟(v)後獲得的DNA或胺基酸序列 上；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔輕鏈序列的DNA或氨 基酸序列；和/或進一步產生來自兔重鏈抗體序列的人源化重鏈抗體序列，其包括下述步(1)從對所需抗原特異的兔抗體獲得兔重鏈抗體序列，並且鑑定跨越所包括的構 架1 (FR1)開始到構架3(FR3)結束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結束序列的所述兔重鏈抗體胺基酸序列進行同源 性搜索，例如，通過包含人種系抗體序列的文庫的BLAST搜索，並且鑑定如下人重鏈抗體序 列，相對於文庫中包含的其他人重鏈抗體可變序列，所述人重鏈抗體序列在胺基酸水平上 與其至少85% -90%等同和/或在胺基酸水平上顯示最大的序列同--'性；(iii)在兔和人重鏈序列中鑑定對應於FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2區域的排列及其 特定殘基，並且針對所選擇的同源人重鏈比對兔抗體的這些不連續區域；(iv)構建DNA或胺基酸序列,其中所選擇的同源人重鏈序列的CDR1和CDR2區域 中至少不同於兔可變重鏈CDR1和CDR2區域中的相對應選擇性決定殘基的胺基酸殘基用兔 重鏈序列的CDR1和CDR2區域中的相對應選擇性決定殘基替代，和/或任選用兔重鏈FR1的 末端H個胺基酸替換人重FR1區域的最後個胺基酸；和/或任選用兔重鏈構架2末端胺基酸殘基替換人重鏈構架2區域的末端胺基酸；和/或進一步任選用相對應人CDR2 殘基(一般是絲氨酸)替換來自兔重鏈CDR2的末端的第4個胺基酸(一般是色氨酸)；(v)將編碼或相同兔重鏈抗體序列中包含的兔重鏈CDR3的相對應胺基酸殘基的 DKA序列進一步附著至通過步驟(iv)獲得的DNA或胺基酸序列；(所述CDR3長度一般是 5-19個胺基酸)(並且所述CDR3進一步一般在WGXG前)；(vi)進一步選擇與其同源的人重鏈構架4區域(FR4)(即，優選與人源化的兔抗體 重鏈序列中包含的FR4相差至多2-4個胺基酸殘基)，並且使編碼所述所選擇的同源人FR4
上(通常人FR4DNA或多肽序列將編碼或包含WGQGTLVTVSS)；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔重鏈序列的DNA或氨 基酸序列；並且使用如上所述產生的所述合成的人源化重鏈和輕鏈DNA或胺基酸序列，以產 生包含至少一條人源化的兔輕鏈和/或至少--條人源化的兔重鏈的人源化抗體或片段或 編碼DNA序列。此外,本發明提供了新型和改良的人源化抗體重鏈和輕鏈、以及包含通過主題人 源化方法產生的所述人源化重鏈和輕鏈的抗體、及其在治療和診斷方法中的用途。特別地,本發明提供了人源化抗體輕鏈,其包含下述(i)跨越FR1的第一個殘基 到FR 3的末端的胺基酸殘基，包括選擇自人種系序列文庫的人輕鏈種系序列的CDR1和 CDR2區域，所述選自基於其跨越FR1到FR3的胺基酸殘基(相對於文庫中的其他人輕鏈種 系序列，相對於跨越FR1到FR3的兔可變輕鏈中的所述區域，優選在胺基酸水平上具有最大 序列同一'性百分比的序列)在胺基酸水平上與待人源化的對所需抗原具有特異性的親本 兔抗體輕鏈的相對應胺基酸殘基的更大同源性(序列同一性)；和(ii)進一步其中對應於 相同親本兔抗體的輕鏈中的「選擇性決定殘基」的在CDR1和CDR2中的CDR殘基用相對應 兔選擇性決定殘基替換；(iii)包含相同親本兔抗體的整個CDR3區域的胺基酸殘基；(iv) 基於其與相同親本兔抗體的輕鏈中包含的相對應FR4區域的更大同源性(序列同-一性)，包 含衍生自人種系序列文庫的抗體輕鏈的整個FR4區域的胺基酸殘基；和(v)進一步其中將 所選擇的同源人FR區域中的人FR1、FR2, FR3和FR4區域的少數或無FR殘基用相對應兔 FR殘基替代(即，在人源化的親本兔輕鏈抗體序列中的一個或多個相對應位點處存在的殘 此外，本發明提供了人源化抗體重鏈多肽，其包含至少下述(i)跨越FR1的第一 個殘基到FR3的末端的胺基酸殘基，包括選擇自人種系序列文庫的人種系序列的CDR1和 CDR2區域，所述選擇基於其跨越FR1到FR3的所選擇的胺基酸殘基(相對於文庫中的其他 人種系序列)與待人源化的對所需抗原具有特異性的親本兔抗體重鏈的相對應胺基酸殘 基的更大同源性(在胺基酸水平上的序列同一性百分比)；和(ii)進一步其中對應於相同 親本兔抗體的重鏈的CDR1和CDR2區域中的「選擇性決定殘基」的在人重鏈的CDR1和CDR2 區域中的CDR殘基用兔重鏈的CDR1和CDR2區域中包含的相對應重鏈選擇性決定殘基替 換；(iii)包含相同親本兔抗體的整個CDR3區的胺基酸殘基；(iv)基於其與相同親本兔抗 體的重鏈中包含的相對應FR4區域的更大同源性(序列同一性)，衍生自人種系序列文庫 的FR4區域；和(V)其中人重FR1區域的最後1-3個胺基酸任選用相對應兔重鏈FR1殘基
14的末端1-3個胺基酸替換；和/或人重鏈構架2區域的末端胺基酸任選用兔重鏈構架2的 相對應末端胺基酸殘基替換；和/或來自兔重鏈CDR2的末端的第4個胺基酸(一般是色氨 酸)任選用相對應人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替換；和(Vi)其中所選擇的同源人FR區 域的少數或無其餘FR殘基用相對應兔冊殘基替代(即，在人源化的兔抗體重鏈中的一個 或多個相對應位點處存在的FR殘基)。此外，本發明提供了包含前述人源化重鏈和輕鏈多肽的新型和改良的人源化抗 體，和編碼所述人源化重鏈和輕鏈多肽的核酸序列，和包含所述人源化重鏈和輕鏈的人源 化抗體,和載體，以及包含所述載體和核酸序列的宿主細胞,及其在治療和診斷方法和組合 物中的用途。本發明進一步考慮了使所述人源化重鏈或輕鏈DNA或多肽與包含或編碼所需抗 體恆定結構域優選人抗體恆定結構域的DNA或多肽序列附著，和/或在抗體多肽或核酸序 列的羧酸或氨基末端處與所需效應物部分的附著(直接或間接)，所述效應物部分例如毒 素、藥物、放射性核素、螢光團、酶、細胞因子、或易位序列例如信號肽、和促進親和力分離的 多肽。發明簡要概述如討論的,本發明提供了用於獲得衍生自兔抗體的人源化可變輕鏈和可變重鏈的 新型和改良方法，和通過此種方法產生的人源化重鏈和/或輕鏈多肽和編碼DNA。本發明的 方法可重現地產生這樣的人源化抗體，其在人中應基本____丨二無免疫原性，並且保留親本兔抗 體的抗原特異性和基本上或完全地結合親和力。本發明的操作一般而言依賴於特定胺基酸 殘基從供體兔抗體(特別是假定在抗原識別和結合中起作用的選擇性決定殘基和必要時 少數構架殘基)轉移到同源的受體人抗體可變重鏈和輕鏈多肽序列上。更具體而言，本發明涉及用於人源化衍生自兔抗體的抗體可變輕鏈的新型人源化 策略，其將不連續數目的在本文中稱為「選擇性決定殘基」的兔輕鏈CDR殘基和任選地無或 極少數構架殘基摻入到同源的人抗體輕鏈序列上。此外，更具體而言,本發明提供了用於人源化衍生自兔抗體的抗體可變重鏈的新 型策略，其將無或極少數不連續數目的兔CDR摻入同源的人重鏈序列....丨二。此外，更具體而言，本發明涉及用於產生包含人源化可變重鏈和/或輕鏈的人源 化抗體和人源化抗體片段的新型和改良的人源化策略，所述可變重鏈和/或輕鏈衍生自兔 抗體可變重鏈和輕鏈多肽以及合適的同源人抗體可變重鏈和輕鏈多肽,從而使得在人重鏈 和輕鏈CDR中包含的至少不同於兔重鏈和輕鏈CDR(選擇性決定殘基)中的相對應選擇性 決定殘基的特定殘基保留在人源化重鏈和/或輕鏈區域中，並且其中人輕鏈中的極少數或 無構架殘基和人重鏈中的極少數構架殘基用相對應兔構架殘基替代。此外,更具體而言,本發明涉及用於產生衍生自供體兔輕鏈抗體序列和受體人輕 鏈抗體序列的人源化輕鏈抗體序列的人源化策略，其包括F述步驟(i)從與所需抗原特異性結合的兔抗體獲得兔輕鏈抗體序列，並且鑑定跨越所包 括的構架1 (FR1)開始到構架3(FR3)結束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結束序列的所述兔輕鏈抗體胺基酸序列進行針對包 含人輕鏈抗體可變序列的文庫的同源性搜索，並且鑑定對其顯示基本序列同源性的人輕鏈 抗體序列，即相對於包含人輕鏈抗體序列文庫中的其他序列，優選在胺基酸水平上與其具有至少80% -90%同--'性和/或優選在胺基酸水平上具有最大的序列同--'性百分比；(iii)在兔和人輕鏈序列中鑑定對應於FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2區域的方向及其 特定殘基，並且比對兔和所選擇的人抗體輕鏈中的這些不連續區域；(iv)構建DNA或胺基酸序列,其中所選擇的同源人輕鏈序列的CDR1和CDR2區域 中至少不同於兔輕鏈CDR1和CDR2區域中的相對應選擇性決定殘基的殘基用兔輕鏈序列的 CDR1和CDR2區域中包含的相對應選擇性決定殘基替代；(v)將編碼或包含兔CDR3輕鏈抗體序列的相對應胺基酸殘基的DNA序列或多肽進 一步附著至通過步驟(iv)獲得的DNA或胺基酸序列；(vi)進一步選擇與兔輕鏈中包含的FR4同源且優選與其相差至多2-4個胺基酸殘 基的人輕鏈構架4區域(FR4)，並且使編碼所述人FR4的DNA序列或所述人FR4的相對應氨 基殘基附著至在步驟(V)後獲得的DM或胺基酸序列上；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔輕鏈序列的DNA或氨 基酸序列。此外，更具體而言，本發明提供了用於產生來自兔重鏈抗體序列的人源化重鏈抗 體序列的人源化策略，其包括下述步驟(i)從與所需抗原特異性結合的兔抗體獲得兔重鏈抗體序列，並且鑑定跨越所包 括的構架1(FR1)開始到構架結束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1幵始到FR3結束序列的所述兔重鏈抗體胺基酸序列進行同源性 搜索(例如，通過包含人種系抗體序列的文庫的BLAST搜索)，並且鑑定與其同源的人重鏈 抗體序列，即相對於包含人重鏈抗體序列的文庫中的其他序列,優選在胺基酸水平上與其 具有至少85% -90%同--'性和/或優選在胺基酸水平上具有最大的序列同--'性百分比；(iii)在兔和人輕鏈序列中鑑定其對應於？1 1、[^2、？1 、001 1、0 2區域的殘基， 並且針對所選擇的同源人抗體重鏈的相對應區域比對兔的這些不連續區域；(iv)構建DNA或胺基酸序列，其中所選擇的同源人重鏈序列的⑶R1和CDR2區域 中至少不同於兔重鏈序列的CDR1和CDR2區域中的相對應選擇性決定殘基的胺基酸殘基由 兔重鏈序列的CDR1和CDR2區域中包含的相對應選擇性決定殘基替代，並且任選用兔重鏈 FR1的相對應末端1-3個胺基酸替換人重FR1區域的末端1-3個胺基酸；和/或任選用兔 重鏈構架2的相對應末端胺基酸殘基替換人重鏈構架2區域的末端胺基酸，和/或任選用 相對應人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替換來自兔重鏈CDR2的末端的第4個胺基酸(一般 是色氨酸)；(v)將編碼或具有兔重鏈CDR3的相對應胺基酸殘基的DNA序列進一步附著至通過 步驟(iv)獲得的DNA或胺基酸序列,所述胺基酸殘基包含在相同的兔重鏈抗體序列中；並 且所述兔CDR3長度一般是5-19個胺基酸(這個CDR3 —般在殘基WGXG前)；(vi)進一步選擇與其同源的人重鏈構架4區域(FR4)(優選與人源化的兔抗體重 鏈序列中包含的FR4相差至多1-4個胺基酸殘基)，並且使編碼所述所選擇的同源人FR4的 DKA序列或所述人FM的相對應氨基殘基附著至在步驟(v)後獲得的DNA或胺基酸序列上 (通常這種人FR4 DNA或多肽序列將編碼或包含WGQGTLVTVSS)；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔重鏈序列的DNA或氨 基酸序列。
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此外，更具體而言,本發明提供了用於產生人源化抗體或抗體片段的人源化策略, 所述人源化抗體或抗體片段包含衍生自兔輕鏈抗體序列的至少一種人源化輕鏈抗體序列 和/或衍生自兔抗體重鏈的至少一種人源化重鏈序列，其中此種人源化輕和重鏈序列根據 下述步驟衍生自兔重鏈和輕鏈(i)從對所需抗原特異的兔抗體獲得兔輕鏈抗體序列，並且鑑定跨越所包括的構 架1(FR1)幵始到構架3(FR3)結束的氨基殘基；(i i)使用跨越FR1開始到FR3結束序列的所述兔輕鏈抗體胺基酸序列進行針對包 含人輕鏈抗體序列的文庫的同源性搜索,並且鑑定與其同源的人輕鏈抗體序列，即相對於 包含人輕鏈抗體序列的文庫中的其他序列,優選在胺基酸水平上與其至少80% -90%等同 和/或優選在胺基酸水平上具有最大的序列同一性百分比；(iii)在兔和人輕鏈序列中鑑定對應於FRl、TO2、ra3、CDRl、CDR2區域的方向及其 特定殘基,並且比對兔輕鏈的這些不連續區域與所選擇的同源人輕鏈區域的相對應區域；(iv)構建DNA或胺基酸序列,其中所選擇的同源人輕鏈序列的CDR1和CDR2區域 中包含的至少不同於兔CDR1和CDR2區域中包含的相對應選擇性決定殘基的殘基用兔輕鏈 序列的相對應CDR1和CDR2區域替代；(v)將編碼或具有兔輕鏈抗體序列中包含的CDR3的相對應胺基酸殘基的DNA序 列(這個CDR3 --般包含9-15個胺基酸並且通常在FGGG殘基前)進一步附著至通過步驟 (iv)獲得的DNA或胺基酸序列；(vi)進一步選擇與所述兔抗體輕鏈中包含的FR4同源且人FR4優選與兔抗體輕鏈 序列的FR4相差至多2-4個胺基酸殘基的人輕鏈構架4區域(FR4)，並且使編碼所述人FR4 的DNA序列或所述人FR4的相對應胺基酸殘基附著至在步驟(v)後獲得的DNA或胺基酸序 列上；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔輕鏈序列的DNA或氨 基酸序列；和/或從兔重鏈抗體序列進一步產生人源化重鏈抗體序列,其包括下述步驟(i)從對所需抗原特異的兔抗體獲得兔重鏈抗體序列，並且鑑定跨越所包括的構 架1 (FR1)開始到構架3 (FR3)結束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結束序列的所述兔重鏈抗體胺基酸序列進行同源 性搜索,例如,通過包含人種系抗體序列的文庫的BLAST搜索,並且鑑定如下人重鏈抗體序 列，相對於包含人重鏈抗體序列的文庫中的其他序列，所述人重鏈抗體序列在胺基酸水平 上與其至少80% -90%等同和/或優選在胺基酸水平上最大的序列同一性百分比；(i i i)在兔和人重鏈序列中鑑定其對應於FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2區域的殘基， 並且針對所選擇的同源人重鏈比對兔抗體的這些不連續區域；(iv)構建DNA或胺基酸序列，其中所選擇的同源人重鏈序列的CDR1和CDR2區域 中包含的至少不同於兔重鏈CDR1和CDR2區域中包含的相對應選擇性決定殘基的殘基用兔 重鏈序列的相對應CDR1和CDR2區域替代，和/或任選用兔重鏈FR1的末端1-3個胺基酸 替換人重FR1區域的最後1-3個胺基酸；和/或任選用兔重鏈構架2的末端胺基酸殘基替 換人重鏈構架2區域的末端胺基酸；和/或進一步任選用相對應人CDR2殘基(一般是絲氨 酸)替換來自兔重鏈CDR2的末端的第4個胺基酸(一般是色氨酸)；
(v)將編碼或相同兔重鏈抗體序列中包含的兔重鏈CDR3的相對應胺基酸殘基的 DNA序列(所述CDR3長度一般是5-19個胺基酸並且一般在WGXG前)進一步附著至通過步 驟(iv)獲得的DNA或胺基酸序列；；(vi)進一步選擇與其同源的人重鏈構架4區域(FR4)(即，優選與人源化的兔抗體 重鏈序列中包含的FR4相差至多2-4個胺基酸殘基),並且使編碼所述所選擇的同源人FR4 的DNA序列或所述人FR4的相對應氨基殘基附著至在步驟(v)後獲得的DNA或胺基酸序列 上(通常人FR4DNA或多肽序列將編碼或包含WGQGTLVTVSS)；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔重鏈序列的DNA或氨 基酸序列；和產生包含所述人源化輕鏈和重鏈中至少一條的核酸序列或多肽；和合成編碼人源化抗體或抗體片段的DNA或包含人源化抗體或抗體片段的多肽，所 述人源化抗體或抗體片段包含編碼根據前述步驟產生的至少人源化輕鏈序列和/或至少 一條人源化重鏈的DNA,或包含根據前述步驟產生的至少人源化輕鏈序列和/或至少一條 人源化重鏈的多肽。本發明進一步考慮了使所述人源化抗體DNA或多肽與所需恆定結構域優選人恆 定結構域附著，和/或在羧酸或氨基末端處與所需效應物部分的附著(直接或間接)，所述 效應物部分例如毒素、藥物、放射性核素、螢光團、酶、細胞因子、易位序列例如信號肽、和促 進親和力分離的多肽。在更具體的實施方案中，本發明涉及對於TNF-a或IL_6具有結合特異性的特定 人源化抗體及其片段，特別是具有特定表位特異性和/或功能性質的人源化抗體。本發明的一個實施方案包含能夠與IL-6或TNF- a和/或TNF- a /TNFR或IL-6/ IL-6R複合物結合的特異性人源化抗體及其片段。本發明的另一個實施方案涉及具有小於50皮摩爾的結合親和力(Kds)和/或小 於或等於10 4 S 1的Km值的人源化抗體。在本發明的優選實施方案中，這些人源化抗體和人源化抗體片段和變體將衍生自 兔免疫細胞(B淋巴細胞)或較不優選地分泌對所需抗原特異的兔抗體的雜交瘤。此外，用 於人源化的兔抗體可以基於其與人種系抗體序列的同源性(序列同一性)進一步選擇。這 些抗體可以進一步促進在人源化後功能性質的保留，因為當使用主題人源化方法時,較少 的胺基酸被修飾。本發明的--個進一步實施方案涉及根據本發明產生的例如對IL-6或TNF- a特異 的人源化抗體片段，包含根據本發明產生的人源化VH、VL和CDR多肽，例如衍生自通過兔免 疫細胞分泌的抗體和編碼其的多核苷酸，以及這些抗體片段和編碼其的多核苷酸在製備能 夠識別所需抗原例如丨丄-6、TNF a和/或TNF- a /TNFR或IL-6/IL-6R複合物的新型抗體 和多肽組合物中的用途。本發明還考慮了與一種或多種功能或可檢測部分綴合的主題人源化的兔抗體和 片段，例如人源化抗TNF- a或抗IL-6抗體及其結合片段的綴合物。本發明還考慮了製備所 述人源化抗TNF- a、IL-6或抗TNF- a /TNFR或抗IL-6/IL-6R複合物抗體及其結合片段的 方法。在一個實施方案中，結合片段包括但不限於人源化Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv和scFv 本發明的實施方案進一步涉及對所需抗原特異的主題人源化抗體，例如人源化抗TNF-a或抗IL-6抗體用於診斷、評估和治療與特定抗原例如TNF_ a、IL-6或其異常表達 相關的疾病和病症的用途。本發明還考慮了根據本發明的人源化抗體片段，例如人源化抗 TNF-a或抗IL-6抗體用於診斷、評估和治療與特定抗原例如IL-6、TNF-a或其異常表達本發明的其他實施方案涉及在重組宿主細胞、優選二倍體酵母例如二倍體畢赤酵 母屬(Pichia)和其他酵母菌株中，衍生自兔抗體序列的根據新型和改良的人源化方案產 生的人源化抗體和人源化抗體片段的產生。附圖簡述

圖1包含示意性描述本發明兔抗體人源化方案的流程圖。圖2包含特定示例性可變輕鏈和可變重鏈多肽序列的比對，即，在人種系序列文 庫中鑑定的抗原特異性兔抗體可變輕鏈多肽和可變重鏈多肽序列和同源人序列，以及使用 本發明人源化方案產生的最終人源化序列。構架區在其中標識為FR1-FR4。互補決定區 (CDR)標識為CDR1-CDR3。胺基酸殘基如該圖中所示進行編號且符合Kabat編號方案。最 初兔序列在該圖和下文中對於兔可變輕鏈和可變重鏈多肽序列分別稱為RbtVL和RbtVh。 在人種系序列文庫中鑑定的跨越FR1開始到FR 3結束的最相似人種系抗體序列中的3個 在兔序列下進行比對。認為與兔序列最相似的人序列緊挨在兔序列下。在本發明人源化策 略的這個例證中，最相似的人種系序列對於輕鏈是L12A,並且對於重鏈是3-64-04。人CDR3 序列未顯示。最緊密的人構架4序列在兔構架4序列F進行比對。垂直短劃線指出其中兔 殘基與在相同位置處的一個或多個人殘基等同。粗體殘基指出在該位置處的人殘基與在相 同位置處的兔殘基等同。最終的人源化序列對於可變輕序列和可變重序列分別稱為VLh和 VHh。在該圖中，下劃線的殘基指出該殘基與在該位置處的兔殘基相同,但不同於在3個比 對的人序列中該位置處的人殘基。圖3相似地包含衍生自IL-6特異性抗體的相同親本兔可變重鏈和輕鏈序列、同 源人種系序列、以及使用主題人源化策略由其產生的2個人源化可變重鏈和輕鏈序列的比 對。特別地，該圖包含原始兔輕鏈和重鏈序列、3個同源人種系序列和2個人源化重鏈序 列和2個人源化輕鏈序列，在其中稱為「aggres」和「consrv」。從比對中可以看出人源化 「aggres"和「consrv 」序列在特定兔構架殘基的存在或不存在下彼此不同。圖4將衍生自對hIL 6和TNF-a特異的兔抗體的嵌合抗體與人源化抗體的解離 常數進行比較,其使用本發明的人源化操作產生。圖5包含比較通過不同人源化抗體的IL-6依賴性T1165細胞增殖的拮抗的實驗， 所述人源化抗體使用本發明的人源化操作產生、衍生自特異性兔抗IL4抗體。圖6包含比較通過不同人源化抗體的hIL-6依賴性T1165細胞增殖的拮抗的實 驗,所述人源化抗體使用本發明的人源化操作產生、衍生自特異性兔抗hIL-6抗體。圖7包含比較通過嵌合抗TNF- a抗體與針對人源化抗體的抗體的hTNF- a依賴 性細胞毒性的拮抗的實驗，所述嵌合抗TNF-a抗體衍生自兔抗hTNF-a抗體，所述所述人 源化抗體根據本發明的人源化操作由其產生。優選實施方案詳述定義為這些可以改變。還應當理解本文使用的術語僅用於描述特定實施方案，並且不意欲限制 僅受所附權利要求限制的本發明的範圍。如本文所使用的，除非上下文另有明確說明，單數形式「一」、「一個」和「一種」包 括複數指示物。因此』例如，提及「細胞」包括多個此種細胞,並且提及「蛋白質」包括提及 --種或多種蛋白質和本領域技術人員已知的其等價物，等等。除非另有明確說明，本文使用 的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。如本文所使用的，術語「受體」和「受體抗體」或「原始」或「親本」抗體指提供或編 碼用於根據本發明從兔抗體可變序列產生人源化抗體序列的序列的人抗體或核酸序列。一 般地,受體抗體將提供--個或多個構架區的至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至 少96、97、98、99或100%胺基酸序列。在某些實施方案中，術語「受體」指提供或編碼一個或 多個恆定區的抗體或核酸序列。在另外一個實施方案中，術語「受體」指提供或編碼一個或 多個構架區和恆定區的抗體或核酸序列。在一個具體實施方案中，術語「受體」指這樣的人 抗體或核酸序列，其提供或編碼一個或多個構架區的至少80%、優選至少85%、至少90%、 至少95%、至少96、97、98、99或100%胺基酸序列。依照這個實施方案，受體可以包含在人 抗體的一個或多個特定位置處不存在的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個 或至少10個胺基酸殘基。受體構架區和/或一個或多個受體恆定區可以例如衍生自或得 自種系抗體基因、成熟抗體基因、功能抗體(例如,本領域眾所周知的抗體、開發中的抗體、 或商購可得的抗體)。如本文所使用的，術語「抗體」指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、 駱駝化(caraelised)抗體、嵌合抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、單結構域抗體、Fab片段、 Fab'片段、F(ab ' )2片段、二硫鍵連接的Fvs (sdFv)、抗獨特型(抗Id)抗體和任何上述的 表位結合片段。特別地，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包 含抗原結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM, IgD、IgA 和IgY),種類(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類。如所述的,本發明一般 而言涉及通過使對所需抗原特異的兔供體抗體的特定殘基和同源人(受體)抗體序列相組 合產生的人源化抗體和人源化抗體片段。一般的抗體包含與2條輕鏈配對的2條重鏈。全長重鏈大小約50kD (長度約446 個胺基酸)，並且由重鏈可變區基因(約116個胺基酸)和恆定區基因編碼。在本發明中， 基本上將編碼人源化可變輕鏈序列和人源化可變重鏈序列的2個核酸或遺傳組分融合在 一起，以產生編碼人源化可變鏈的構建體，所述序列包含所需抗原特異性和功能性質的兔 抗體的特定CDR殘基並且可以簡稱為外顯子，當這個構建體在合適的表達系統中表達時， 所述構建體導致人源化可變區的表達。如果恆定區存在,那麼主題人源化抗體將包含人恆定區。存在編碼不同同種型例 如a、Y (IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、S、e和u序列的重鏈恆定區的不同恆定區基因。全 長輕鏈大小約25Kd (長度約214個胺基酸)，並且由輕鏈可變區基因(約110個胺基酸)和 k或、恆定區基因編碼。輕鏈和/或重鏈的可變區負責與抗原結合，並且恆定區負責抗體 -一般的效應子功能。如本文所使用的，術語「類似物」在蛋白質性質試劑(例如，蛋白質、多肽和肽，例 如抗體)的上下文中指這樣的蛋白質性質試劑，其具有與第二種蛋白質性質試劑相似或相同功能，但不一定包含第二種蛋白質性質試劑的相似或相同胺基酸序列，或具有第二種蛋 白質性質試劑的相似或相同結構。具有相似胺基酸序列的蛋白質性質試劑指滿足F述至少 一種的第二種蛋白質性質試劑(a)具有與第二種蛋白質性質的胺基酸序列至少30%、至 少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少96、97、98、99或100%相同的氨基 酸序列的蛋白質性質試劑；(b)由如下核苷酸序列編碼的蛋白質性質試劑，所述核苷酸序 列在嚴格條件下與編碼第二種蛋白質性質試劑的核苷酸序列雜交，所述第二種蛋白質性質 試劑具有至少5個鄰接胺基酸殘基、至少10個鄰接胺基酸殘基、至少15個鄰接胺基酸殘 基、至少20個鄰接胺基酸殘基、至少25個鄰接胺基酸殘基、至少40個鄰接胺基酸殘基、至 少50個鄰接胺基酸殘基、至少60個鄰接胺基酸殘基、至少70個鄰接胺基酸殘基、至少80個 鄰接胺基酸殘基、至少90個鄰接胺基酸殘基、至少100個鄰接胺基酸殘基、至少125個鄰接 胺基酸殘基或至少150個鄰接胺基酸殘基；和(c)由如下核苷酸序列編碼的蛋白質性質試 劑，所述核苷酸序列與編碼第二種蛋白質性質試劑的核苷酸序列至少30%、至少35%、至 少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少96、97、98、99或100%相同。具有與第二種蛋 白質性質試劑相似的結構的蛋白質性質試劑指具有與第二種蛋白質性質試劑相似的二級、 三級或四級結構的蛋白質性質試劑。蛋白質性質試劑的結構可以通過本領域技術人員已知 的方法進行測定，包括但不限於，肽測序、X射線晶體學、核磁共振、圓二色性和結晶學電子 顯微鏡檢查。為了測定2個胺基酸序列或2個核酸序列的同一性百分比,序列就最佳比較目的 進行比對(例如,可以將缺口引入第一個胺基酸或核酸序列的序列中用於與第二個胺基酸 或核酸序列的最佳比對)。隨後比較在相對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或 核苷酸。當第一個序列中的位置由與第二個序列中的相對應位置相同的胺基酸殘基或核苷 酸佔據時，那麼分子在那個位置處是相同的。2個序列之間的同一性百分比是由序列共享的 相同位置數目的函數(即，同-一性％ =相同重疊位置數目！位置總數目乘以100% )。在一 個實施方案中，2個序列是相同長度的。如所述的，本發明在其人源化策略中選擇與兔輕鏈 或重鏈可變區的相對應可變區具有高序列同一性或同源性的人可變區，所述兔輕鏈或重鏈 可變區用於衍生相對應「人源化」變體。一般地,所選擇的人可變區在包含⑶R1和CDR2區 域的可變區的特定部分上將與相對應兔可變序列具有至少80%或更大的序列同--'性。理想 地，如通過合適方法例如BLAST搜索測定的，與包含人抗體可變區編碼序列的人種系序列 群體或文庫的所有其他成員比較，所選擇的人可變區與兔可變區將具有最大的同源性或序 列同一性。此外，主題人源化策略中使用的優選或前導候選兔抗體可以基於其與人種系序 列的高同源性或序列同一性選自兔抗體群體(可比較親和力和/或功能特徵)。這可能是 因為本發明在優選實施方案中使用B細胞免疫接種方案產生其親本抗體，已發現所述B細 胞免疫接種方案產生對識別在抗原靶例如IL-6上的不同表位的靶特異的許多(例如，10種 或更多)高親和力抗體。在某些情況下,這個同一性可以基本上使得人源化抗體和親本抗 體可以在人受試者中具有相似的免疫原性性質，已知與一般用於人源化的其他動物例如齧 齒類動物和豚鼠比較，人和兔抗體之間的高序列同一性。2個序列之間的同一性百分比的測定也可以使用數學算法來完成。用於2個序列比較的數學算法的優選、非限制性例子是Karl in和Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87 2264-2268,如在 Karl in 和 Altschul, 1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 5873-5877中修飾的算法。將此種算法併入Altschul等人，1990』 J. Mol. Biol. 215 403的 NBLAST和XBLAST程序內。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序參數組來執行，例 如對於得分=100,字長=12獲得與本發明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質 搜索可以用XBLAST程序參數組來執行，例如對於得分-50，字長=3獲得與本發明的蛋白質 分子同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目的的缺口比對 ，可以利用如Altschul等人， 1997，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 中所述的 Gapped BLAST。備選地，PSI-BLAST 可 以用於執行檢測分子之間的距離關係的迭代搜索(同上)。當利用BLAST.GappedBLAST和 PSI-Blast程序時，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST的)預設參數(參見，例如 NCBI網站)。用於序列比較的數學算法的另一個優選、非限制性例子是Myers和Miller， 1988, CABI0S 4 :11-17的算法。將此種算法併入其為GCG序列比對軟體包的部分的ALIGN 程序(版本2.0)中。當利用ALIGN程序用於比較胺基酸序列時,可以使用PAM120權重殘 基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4。2個序列之間的同一性百分比可以使用類似於上文描述的技術進行測定，允許或 不允許缺口。在計算同一性百分比中，一般僅計數確切匹配。如本文所使用的,術語「CDR」指在抗體可變序列內的互補決定區。在重鏈和輕鏈 的每個可變區中存在3個CDR,對於每個可變區指定為CDR1、CDR2和CDR3。這些CDR的 確切邊界已根據不同系統進行不同限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immuno1ogicalInterest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)禾D (1991))描述的系統不僅提供可應用於抗體的任何可變區的明確殘基編號系統,還提供限 定3個CDR的精確殘基邊界。這些CDR可以稱為Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和 Leska,J. Mol Biol. 196 :901-917 (1987)和 Cho thia 等人，Nature 342:877-883(1989))發 現在Kabat CDR內的特定亞部分採用接近相同的肽主鏈構象,儘管在胺基酸序列水平上具 有很高的多樣性。這些亞部分指定為L1、L2和L3或H1、H2和H3,其中「L」和「H」分別指輕 鏈和重鏈區域。這些區域可以稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊的邊界。限定與 Kabat CDR重疊的 CDR 的其他邊界已由 Padlan(FASEB J. 9 :133-139 (1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5) :732-45 (1996))描述。另外的CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述系統之 --，但仍將與Kabat CDR重疊,儘管根據特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著影響抗原 結合的預測或實驗發現，它們可能縮短或延長。本文使用的方法可以利用根據任何這些系 統限定的CDR，儘管優選實施方案使用Kabat或Chothia限定的CDR。如下所述，這些CDR 包含稱為「選擇性決定殘基」被認為在抗原結合或識別中重要的不連續殘基。在本發明中的表達「選擇性決定殘基」指兔可變重鏈和輕鏈多肽中包含的特定氨 基酸殘基，其被認為明顯涉及抗原識別和/或抗原結合。在本發明的人源化策略中，兔CDR 區域中的這些選擇性決定殘基以經驗為主如下進行鑑定通過比較所有兔CDR殘基與所選 擇的同源人可變區中的相對應殘基，並且基於這個比較鑑定假定的「選擇性決定殘基」。如 果根據Kabat編號方案特定CDR殘基基本上不同於相對應人CDR殘基,那麼它基本上被視 為選擇性決定殘基。「基本上」在本文中指兔和人種系CDR胺基酸殘基之間的顯著化學或結 構差異，例如電荷、荷電對未荷電、大側鏈的存在或不存在中的差異等。例如,如果兔CDR胺基酸殘基包含大側鏈，並且相對應人CDR胺基酸殘基不包含,那麼兔CDR殘基將視為選擇性 決定殘基，並且將保留在人源化可變區中。此外，如果兔可變區中的CDR胺基酸殘基是鹼性 胺基酸，並且人CDR中的相對應胺基酸殘基是酸性胺基酸殘基,那麼兔CDR中的這個殘基將 被確定為選擇性決定殘基，並且將保留在人源化可變區中。相比之下,如果兔CDR中的CDR 殘基和人CDR中的相對應殘基都是酸性或都包含相似的大側鏈,那麼殘基將被確定為不是 選擇性決定殘基，並且人CDR殘基在人源化可變區中將不被修飾。使兔CDR區中的特定殘 基分類為在本人源化策略中使用的「選擇性決定」或「非選擇性決定」以便選擇應保留在人 源化可變區中的特定兔CDR殘基的這個方法，類似於在用於測定胺基酸置換修飾可以視為 保守還是非保守的蛋白質誘變中使用的標準。然而,應當理解儘管基於這些殘基中的每個 在抗原識別和/或結合中起作用的推測，本發明在人源化可變區多肽中一般保留所有此種 選擇性決定殘基，但在某些情況下，可以在不同人源化可變鏈變體合成後確定，特別假定的 選擇性決定殘基的保留就包含人源化可變區的抗體的抗原結合而言是非必需的。例如，如 果親本兔抗體對於靶抗原具有極高的抗原親和力，那麼所有假定的選擇性決定殘基的保留 可能對於衍生具有所需抗原結合識別和親和力的人源化抗體不是必需的。這可以通過合成 不同人源化可變區多肽以經驗為主進行確定。此外，特定CDR殘基作為選擇性決定或非選 擇性決定的鑑定可以依賴於所選擇的同源人可變區的一個或多個特定序列而變。表達「可變區」或「VR」指在抗體中的每對輕鏈和重鏈內直接涉及抗體與抗原結合 的結構域。每條重鏈在一個末端處具有可變結構域(VH)，隨後為多個恆定結構域。每條輕 鏈在一個末端處具有可變結構域(VJ且在其另一個末端處具有恆定結構域；將輕鏈的恆定 結構域與重鏈的第一個恆定結構域進行比對，並且將輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域 進行比對。表達「構架區」或「FR」指在抗體的輕鏈和重鏈的可變區內的一個或多個構架區 (參見 Kabat, E. A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. , (1.987))。構架區或FR包括插入抗體的輕鏈和重 鏈的可變區內包含的CDR之間的胺基酸序列區。如本文所使用的，表達「典型(canonical)」殘基指在限定如由Chothia等人 (J. Mol Biol. 196 :901-907 (1987) ；Chothia 等人，J. Mol. Biol. 227 799 (1992)，兩者都通 過引用合併入本文)限定的特定典型CDR結構的CDR或構架中的殘基。根據Chothia等人， 許多抗體的CDR的關鍵位置具有幾乎相同的肽主鏈構象,儘管在胺基酸序列水平上極大的 多樣性。每個典型結構主要描述了關於構成環的胺基酸殘基的鄰接區段的一組肽主鏈扭 如本文所使用的,在蛋白質性質試劑(例如，蛋白質、多肽和肽，例如抗體)上下 文中的表達「衍生物」指包含胺基酸序列的蛋白質性質試劑,所述胺基酸序列已通過引入氨 基酸殘基置換、缺失和/或添加而被改變。如本文所使用的，表達「衍生物」也指已被修飾 的蛋白質性質試劑，即,通過任何類型分子與蛋白質性質試劑的共價附著。例如,但不限於， 抗體可以例如通過去糖基化、糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、通過已知保護/ 阻斷基團的衍生化、蛋白質酶解切割、與細胞配體或其他蛋白質連接等衍生化進行修飾。優 選地，抗體是去糖基化的。蛋白質性質試劑的衍生物可以通過化學修飾來產生，氣質使用本 領域技術人員已知的技術，包括但不限於特定化學切割、乙醯化、甲醯化、衣黴素的代謝合成等。此外,蛋白質性質試劑的衍生物可以包含一個或多個非典型胺基酸。蛋白質性質試 劑的衍生物具有與它由其衍生的蛋白質性質試劑相似或相同的功能。如本文所使用的，表達「病症」或「疾病」對於受試者中的病狀可互換使用。如本文所使用的,表達「供體」或「供體抗體」指提供一個或多個CDR的抗體。在 --個優選實施方案中，供體抗體是來自不同於構架區由獲得或衍生來源的抗體的物種的抗 體。在人源化抗體的上下文中，術語「供體抗體」指 提供一個或多個CDR的非人(兔)抗體。如本文所使用的，表達「有效量」指如下治療量，其足以減少或改善病症或其一種 或多種症狀的嚴重度和/或持續時間，阻止病症的進展，引起病症消退，阻止與病症相關的 一種或多種症狀復發、發展、發作或進展,檢測病症，或者增強或改善另-一種治療 例如,預 防或治療劑)的一種或多種預防或治療效應。 如本文所使用的，表達「表位」指在動物中,優選在哺乳動物中，且最優選在人中具 有抗原或免疫原性活性的多肽或蛋白質的片段。具有免疫原性活性的表位是在動物中引發 抗體應答的多肽或蛋白質的片段。具有抗原活性的表位是如通過本領域技術人員眾所周知 的任何方法，例如通過免疫測定法測定的，抗體與之免疫特異性結合的多肽或蛋白質的片 段。抗原表位不一定是免疫原性的。如所述的，本發明優選產生針對特定靶抗原的兔抗體， 其中使用已發現產生對抗原靶上的一系列不同表位具有高親和力的抗體的克隆B細胞免 疫接種方法。如本文所使用的，表達「融合蛋白」指如下多肽或蛋白質(包括但不限於抗體)，其 包含第一種蛋白質或多肽或其功能片段、類似物或衍生物的胺基酸序列,和異種蛋白質、多 肽或肽(即，不同於第一種蛋白質或其片段、類似物或衍生物的第二種蛋白質或多肽或其 片段、類似物或衍生物)的胺基酸序列。在一個實施方案中，融合蛋白包含與異種蛋白質、 多肽或肽融合的預防或治療劑。依照這個實施方案，異種蛋白質、多肽或肽可以是或不是不 同類型的預防或治療劑。例如,具有免疫調節活性的2種不同蛋白質、多肽或肽可以融合在 一起，以形成融合蛋白。在一個優選實施方案中，相對於在與異種蛋白質、多肽或肽融合前 的原始蛋白質、多肽或肽的活性,融合蛋白保留或具有改善的活性。如本文所使用的，表達「片段」指包含如F胺基酸序列的肽或多肽(包括但不限於 抗體)，所述胺基酸序列具有另一種多肽或蛋白質的至少5個鄰接的胺基酸殘基、至少10 個鄰接的胺基酸殘基、至少15個鄰接的胺基酸殘基、至少20個鄰接的胺基酸殘基、至少25 個鄰接的胺基酸殘基、至少40個鄰接的胺基酸殘基、至少50個鄰接的胺基酸殘基、至少60 個鄰接的胺基酸殘基、至少70個鄰接的胺基酸殘基、至少鄰接的80個胺基酸殘基、至少鄰 接的90個胺基酸殘基、至少鄰接的100個胺基酸殘基、至少鄰接的125個胺基酸殘基、至少 150個鄰接的胺基酸殘基、至少鄰接的175個胺基酸殘基、至少鄰接的200個胺基酸殘基或 至少鄰接的250個胺基酸殘基。在--個具體實施方案中，蛋白質或多肽片段保留蛋白質或 多肽的至少一種功能。如本文所使用的，表達「功能片段」指包含如下胺基酸序列的肽或多肽(包括但不 限於抗體)，所述胺基酸序列具有第二種、不同多肽或蛋白質的胺基酸序列的至少5個鄰接 的胺基酸殘基、至少10個鄰接的胺基酸殘基、至少15個鄰接的胺基酸殘基、至少20個鄰接 的胺基酸殘基、至少25個鄰接的胺基酸殘基、至少40個鄰接的胺基酸殘基、至少50個鄰接 的胺基酸殘基、至少60個鄰接的胺基酸殘基、至少70個鄰接的胺基酸殘基、至少鄰接的80個胺基酸殘基、至少鄰接的90個胺基酸殘基、至少鄰接的100個胺基酸殘基、至少鄰接的 125個胺基酸殘基、至少150個鄰接的胺基酸殘基、至少鄰接的175個胺基酸殘基、至少鄰接 的200個胺基酸殘基或至少鄰接的250個胺基酸殘基，其中所述多肽或蛋白質保留第二種、 不同多肽或蛋白質的至少一種功能。在一個具體實施方案中，多肽或蛋白質片段保留蛋白 質或多肽的至少2、3、4或5種功能。優選地,與特定抗原免疫特異性結合的抗體片段保留 與抗原免疫特異性結合的能力。 如本文所使用的，表達「種系抗體基因」或「基因片段」指由非淋巴樣細胞編碼的 免疫球蛋白序列，所述非淋巴樣細胞未經歷導致用於表達特定免疫球蛋白的遺傳重排和 突變的成熟過程。(參見例如，Shapiro 等人，Crit Rev. Immunol. 22(3) 183-200 (2002)； Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol. 484 :13_30 (2001))。由本發明的各種實施方案所提 供的優點之一起源於下述認識種系抗體基因比成熟抗體基因更可能保存物種中個體的必 需胺基酸序列結構特徵，因此當在那個物種中在治療上使用時,更不可能識別為來自外來如本文所使用的，表達「關鍵」殘基指在可變區內的特定殘基，其對抗體特別是人 源化抗體的結合特異性和/或親和力具有更多影響。這包括前述選擇性決定殘基,並且進 一步包括但不限於下述一種或多種與CDR鄰近的殘基、潛在的糖基化位點(可以是N或0 聯糖基化位點)、罕見殘基、能夠與抗原相互作用的殘基、能夠與CDR相互作用的殘基、典型 殘基、在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接觸殘基、在Vernier帶內的殘基、和在可變重鏈 CDR1的Chothia定義和第一個重鏈構架的Kabat定義之間重疊的區域中的殘基。如本文所使用的，表達「腫瘤壞死因子-a 」或(TNF-cx )或TNF-a不僅包含可作 為GenBank蛋白質登記號CAA26669 (智人TNF- a )獲得的下述233胺基酸序列MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSL ISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCP STHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEK(;DRLSAEINRPDYLDFAES GQVYFGIIAL (SEQ ID NO 1),還包含這個TNF- a胺基酸序列的任何前原、原、成熟、可溶和/ 或膜結合形式，以及這個序列的突變型(突變蛋白質(mutien))、剪接變體、直向同源物、同 系物和變體。表達「白介素-6」或(IL-6)在本文中不僅包含可作為GenBank蛋白質登記號 NP_00591獲得的下述212胺基酸序列MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRK
ETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMS TKVLIQFLQKKAKNIJ)AITTPI)PTTNAS]J.;ilLID NO
2),還包含這個IL-6胺基酸序列的任何前原、原和成熟形式，以及這個序列的突變型和變 體包括等位變體。表達「交配感受態酵母物種」在本文中意欲廣泛地包含可以在培養中穩定維持的 任何二倍體酵母。此種酵母物種以單倍體和二倍體形式存在。在合適條件下,二倍體細胞 可以以二倍體形式增殖無限代。二倍體細胞還可以形成孢子以形成單倍體細胞。此外，順 次交配通過營養缺陷型二倍體的進一步交配可以產生四倍體菌株。在本發明中，二倍體或 多倍體酵母細胞優選通過交配或質體融合產生。
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在本發明的--個實施方案中，交配感受態酵母是酵母菌科(Saccharomycetaceae) 成員，所述酵母菌科包括Arxiozyma ；Ascobotryozyma ；固囊酵母屬(Citeromyces)；德 巴利酵母屬(Debaryomyces)；德克酵母屬(Dekkera)；假囊酵母屬(Eremothecium)；伊 莎酵母屬(Issatchenkia) ；Kazachstania ；克魯維酉孝母屬(Kluyveromyces) ；Kodamaea ； 婁德羅酵母屬(Lodderomyces)；管囊酵母屬(Pachysolen)；畢赤酵母屬(Pichia)；酵母 屬(Saccharomyces) ；Saturnispora ；Tetrapisispora ； WillBf ^M (Torulaspora)；擬 威爾酵母屬(Williopsis)和接合酵母屬(Zygosaccharomyces)。在本發明中潛在有用 的其他類型的酵母包括子囊菌酵母屬(Yarrowia)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、假 絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、Filobasium、Filobasidellla、鎖擲酵母 屬(Sporidiobolus)、布勒擲孢酵母屬(Bullera)、白冬孢酵母屬(Leucosporidium)和 Filobasidella。在本發明的一個優選實施方案中，交配感受態酵母是畢赤酵母屬成員。在本發 明的一個進一步優選的實施方案中，畢赤酵母屬的交配感受態酵母是下述物種之一巴斯 德畢赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、和多形漢遜酵母 (IlansMulapolymorpha)(安格斯畢赤酵母(Pichia angusta))。在本發明的一個特別優選 的實施方案中，畢赤酵母屬的交配感受態酵母是物種巴斯德畢赤酵母。表達「單倍體酵母細胞」在本文中指具有其通常基因組(染色體)互補體的每個 基因的單個拷貝的酵母細胞。表達「多倍體酵母細胞」在本文中指具有其通常基因組(染色體)互補體的超過 一個拷貝的酵母細胞。表達「二倍體酵母細胞」在本文中指具有其通常基因組互補體的每個基因的二個 拷貝(等位基因)的酵母細胞，通常通過2個單倍體細胞的融合(交配)過程形成。表達「四倍體酵母細胞」在本文中指具有其通常基因組互補體的每個基因的四個 拷貝(等位基因)的細胞,通常通過2個單倍體細胞的融合(交配)過程形成。四倍體可 以攜帶2、3或4個不同盒。此種四倍體可以在釀酒酵母(S. cerevisiae)中通過選擇性交 配純合異宗配合的a/a和a/a或a/a 二倍體獲得，以及在畢赤酵母屬中通過單倍體的順 次交配以獲得營養缺陷型二倍體。例如[met his]單倍體可以與[ade his]單倍體交配， 以獲得二倍體[his]；並且[met arg]單倍體可以與[ade arg]單倍體交配，以獲得二倍體 [arg]；隨後二倍體Diis]X 二倍體[arg],以獲得四倍體原養型。本領域技術人員應當理解 提及二倍體細胞的優點和用途也可以應用於四倍體細胞。表達「酵母交配」指通過其，2個單倍體酵母細胞天然融合以形成1個二倍體酵母 細胞的過程。表達「減數分裂」在本文中指通過其,二倍體酵母細胞經歷減少的分裂以形成4個 單倍體孢子產物的過程。每個孢子隨後可以出芽並形成單倍體營養生長細胞系。表達「可選標記」在本文中指可選標記是對由於例如通過轉化事件對接受那種基 因的細胞賦予生長表型(物理生長特徵)的基因或基因片段。可選標記允許細胞在選擇性 生長培養基中在其中未接受那種可選標記的細胞無法生長的條件下存活且生長。可選標記 基因一般歸為幾個類型，包括陽性可選標記基因例如當2個ts突變型雜交或ts突變型轉 化時，賦予細胞針對抗生素或其他藥物，溫度的抗性的基因；陰性可選標記基因例如賦予細胞在不含特定營養素的培養基中生長的能力的生物合成基因,所述特定營養素是沒有那種 生物合成基因的所有細胞所需要的，或賦予細胞沒有野生型基因的細胞無法生長的誘變的 生物合成基因。合適標記包括但不限於:ZE0 ；G418 ；LYS3 ；MET1 ；MET3a ；ADE1 ；ADE3 ；URA3 ；表達「表達載體」在本文中指包含有助於靶宿主細胞內表達外源蛋白質的操作的 元件的DNA載體。方便地，序列操作和用於轉化的DNA產生首先在細菌宿主例如大腸桿菌 (E. coli)中執行，並且通常載體將包括有助於此種操作的序列，包括細菌的複製起點和合 適的細菌選擇標記。選擇標記編碼對於在選擇培養基中生長的轉化宿主細胞的存活或生長 所需的蛋白質。未用包含選擇基因的載體轉化的宿主細胞在培養基中將不存活。一般的選 擇基因編碼如下蛋白質其(a)賦予針對抗生素或其他毒素的抗性，(b)補充營養缺陷型缺 陷，或(c)供應從複合培養基中無法獲得的關鍵營養素。適合於在本發明的方法中使用的表達載體進一步包括酵母特異性序列，包括用於 鑑定轉化的酵母菌株的可選營養缺陷型或藥物標記。藥物標記可以進一步用於擴增載體在 酵母宿主細胞中的拷貝數。目的多肽編碼序列與提供多肽在酵母細胞中表達的轉錄和翻譯調節序列可操作 地連接。這些載體組分可以包括但不限於下述一種或多種增強子元件、啟動子和轉錄終止 序列。還可以包括用於多肽分泌的序列,例如信號序列等。酵母複製起點是任選的，因為表 達載體通常整合到酵母基因組內。在本發明的一個實施方案中，目的多肽與提供多肽從酵母二倍體細胞中的優化分 泌的序列可操作地連接或融合。與核酸序列結合的表達「可操作地連接」指這些序列放置在彼此的功能關係內。 例如，編碼信號序列的DNA可以與關於多肽的DNA可操作地連接，如果它表達為參與多肽 分泌的前蛋白質；啟動子或增強子與編碼序列可操作地連接，如果它影響序列的轉錄。一 般地，「可操作地連接」指被連接的DNA序列是鄰接的，並且在分泌前導區的情況下,鄰接且 在讀碼框中。然而,增強子不一定是鄰接的。連接通過在方便的限制位點處連接或備選地 經由本領域技術人員熟悉的PCR/重組方法(Gateway^ Technology ；Invitrogen, Carlsbad California)來完成。如果此種位點不存在，那麼依照常規實踐使用合成寡核苷酸連接物或 接頭。表達「啟動子」指位於結構基因(一般在100-1000bp內)的起始密碼子上遊(5』) 的非翻譯序列，其控制與它們可操作地連接的特定核酸序列的轉錄和翻譯。此種啟動子歸 為幾個種類誘導型、組成型和阻遏型啟動子(其響應阻遏物的不存在而增加轉錄水平)。 誘導型啟動子可以響應培養條件中的某些變化,例如營養素的存在或不存在或溫度中的改 變，起始來自在其控制下的DNA的轉錄水平增加。酵母啟動子片段也可以充當用於同源重組和表達載體整合到酵母基因組中的相 同位點內的位點；備選地，可選標記用作用於同源重組的位點。畢赤酵母屬轉化在Cregg等 人(1985)Mo 1. Cell. Biol. 5 3376-3385 中描述。來自畢赤酵母屬的合適啟動子的例子包括A0X1和啟動子(Cregg等人(1989)joL Cell. Biol. 9 1316-1323) ；ICL1 啟動子(Menendez 等人(2003) Yeast 20(13) 1097-108)； 甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(GAP) (Waterham 等人(1997)Genel86 (1) :37-44)；和 FLD1啟動子(Shen等人(1998)_ 216(1) :93_102)。GAP啟動子是強組成性啟動子,並且A0X 和FLD1啟動子是誘導型的。其他酵母啟動子包括ADIII、乙醇脫氫酶II、GAL4、PH03、PH05、Pyk和由以上衍生的 嵌合啟動子。此外，可以在本發明中使用非酵母啟動子，例如哺乳動物、昆蟲、植物、爬行動 物、兩棲動物、病毒和禽類啟動子。最一般地，啟動子將包含哺乳動物啟動子(對表達的基 因潛在內源的)，或將包含提供在酵母系統中的有效轉錄的酵母或病毒啟動子。目的多肽不僅可以直接重組產生，還可以作為與異源多肽的融合多肽產生，所述 異源多肽例如信號序列或在成熟蛋白質或多肽的N末端處具有特定切割位點的其他多肽。 一般而言，信號序列可以是載體的組分,或它可以是插入載體內的多肽編碼序列的部分。選 擇的異源信號序列優選地是通過宿主細胞內可用的標準途徑之一被識別且加工的信號序 列。已證明釀酒酵母a因子前原信號在從巴斯德畢赤酵母中分泌各種重組蛋白質中有效。 其他酵母信號序列包括交配因子a信號序列、轉化酶信號序列和衍生自其他分泌的酵母 多肽的信號序列。此外,這些信號肽序列可以經改造以在二倍體酵母表達系統中提供增強 的分泌。其他目的分泌信號還包括哺乳動物信號序列，這可以對於被分泌的蛋白質是異源 的，或可以是關於被分泌蛋白質的天然序列。信號序列包括前肽序列，並且在某些情況下可 以包括原肽序列。許多此種信號序列是本領域已知的,包括在免疫球蛋白鏈上發現的信號 序列,例如K28前原毒素序列、PHA-E、FACE、人MCP-1、人血清白蛋白信號序列、人Ig重鏈、 人 Ig 輕鏈等。例如，參見 Hashimoto 等人 ProteinEng 11(2)75(1998)；和 Kobayashi 等人 Therapeutic Apheresis2(4)257(1998)。轉錄可以通過將轉錄激活子序列插入載體內得到增加。這些激活子是DNA的順式 作用元件，通常為約10-300bp,這作用於啟動子以增加其轉錄。轉錄增強子是相對方向和位 置獨立的，已經對於轉錄單位5』和3』、在內含子內、以及在編碼序列其自身內發現。增強子 可以在對於編碼序列5』或3』的位置處剪接到表達載體內，並且優選位於來自啟動子5』的 位點處。在真核宿主細胞中使用的表達載體也可以包含轉錄終止和穩定mRNA所需的序 列。此種序列通常在來自翻譯終止密碼子的3』、在真核或病毒DNA或cDNA的非翻譯區中獲 得。這些區域包含在mRNA的非翻譯部分中轉錄為多腺苷酸化片段的核苷酸區段。包含一個或多個上述組分的合適載體的構建採用標準連接技術或PCR/重組方 法。對分離的質粒或DNA片段以所需形式進行切割、加尾和連接，以產生所需質粒,或經由 重組方法。為了分析以證實在構建質粒中的正確序列，連接混合物用於轉化宿主細胞，並且 合適時通過抗生素抗性(例如，氨苄青黴素或Zeocin)選擇成功的轉化體。製備來自轉化 體的質粒，並且通過限制性核酸內切酶消化分析和/或測序。作為片段限制和連接的備選方案,基於att位點和重組酶的重組方法可以用於將 DNA序列插入載體內。此種方法例如由Landy (1989)Ann. Rev. Biochem. 58 :913_949描述； 並且是本領域技術人員已知的。此種方法利用由X和大腸桿菌編碼的重組蛋白質的混 合物介導的分子間DNA重組。重組在相互作用DNA分子上的特定附著(att)位點之間發 生。關於 att.位點的描述，參見 Weisber g 禾口 Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II，Weisberg，編輯(Cold Spring Harbor, NY :Cold Spring Harbor Press),第211—250頁。交換重組位點側面的DNA區段，從而使得在重組後，att位
att位點可以通過如下方式引入目的序列內使目的序列連接到合適載體內；通 過使用特定引物產生包含att B位點的PCR產物；產生克隆到包含att位點的合適載體內 的cDNA文庫；等。如本文所使用的，摺疊指多肽和蛋白質的三維結構，其中胺基酸殘基之間的相互 作用用於穩定結構。儘管非共價相互作用在確定結構中是重要的,但通常目的蛋白質將具 有由2個半胱氨酸殘基形成的分子內和/或分子間共價二硫鍵。對於天 然存在的蛋白質和 多肽或其衍生物和變體，正確摺疊一般是導致最佳生物活性的排列，並且可以通過關於活 性例如配體結合、酶促活性等的測定法方便地監控。在某些情況下，例如當所需產物是合成起源時，基於生物活性的測定法意義較小。 此種分子的正確摺疊可以基於物理性質、能量考慮、建模研究等進行測定。表達宿主可以通過引入編碼--種或多種酶的序列而進一步修飾,所述酶增強摺疊 和二硫鍵形成，即摺疊酶、伴侶蛋白等。此種序列可以如本領域已知的，使用載體、標記等在 酵母宿主細胞中組成性或誘導性表達。優選地，序列包括對於所需表達模式足夠的轉錄調 節元件,將其通過靶向方法穩定整合到酵母基因組中。例如,真核PDI不僅是蛋白質半胱氨酸氧化和二硫鍵異構化的有效催化劑,還顯 示伴侶蛋白活性。PDI的共表達可以促進具有多個二硫鍵的活性蛋白質的產生。還感興趣 的是BIP(免疫球蛋白重鏈結合蛋白)；環孢素；等的表達。在本發明的一個實施方案中，單 倍體親代菌株各自表達不同的摺疊酶,例如一種菌株可以表達BIP,並且另一種菌株可以表 達PDI或其組合。術語「所需蛋白質」或「靶蛋白質」可互換使用，並且一般指本文描述的人源化抗體 或其結合部分。在本發明中,用於產生抗體用作根據本發明的原材料的來源是兔。眾多抗體 編碼序列已得到描述；並且其他可以通過本領域眾所周知的方法產生。其例子包括嵌合抗 體、人抗體和其他非人哺乳動物抗體、人源化抗體、單鏈抗體(scFvs)、駱駝科抗體、SIMPS、 和抗體片段例如Fabs、Fab'、F(ab' )2等。例如，抗體或抗原結合片段可以通過基因工程產生。在這種技術中，與其他方法一 樣，使抗體生成細胞對所需抗原或免疫原致敏。從抗體生成細胞中分離的信使RNA用作模 板，以使用PCR擴增製備cDNA。通過將擴增免疫球蛋白cDNA的合適部分插入表達載體內， 產生保留起始抗原特異性的各自包含一種重鏈基因和一種輕鏈基因的載體文庫。通過使重 鏈基因文庫與輕鏈基因文庫相組合構建組合文庫。這導致共表達重鏈和輕鏈(類似抗體分 子的Fab片段或抗原結合片段)的克隆文庫。將攜帶這些基因的載體共轉染到宿主細胞 內。當抗體基因合成在轉染宿主中誘導時，重鏈和輕鏈蛋白質自我裝配，以產生可以通過用 抗原或免疫原篩選檢測的活性抗體。目的抗體編碼序列包括由天然序列編碼的核酸，以及由於遺傳密碼的簡併性在序 列中不同於公開核酸的核酸,及其變體。變體多肽可以包括胺基酸(aa)置換、添加或缺失。 胺基酸置換可以是保守胺基酸置換或消除非必需胺基酸的置換,例如以改變糖基化位點、 或通過置換或缺失對於功能不必需的一個或多個半胱氨酸殘基使錯誤摺疊降到最低。可以 設計變體，以便保留或具有蛋白質的特定區域(例如，功能結構域、催化胺基酸殘基等)的增強生物活性。變體還包括本文公開的多肽的片段,特別是生物活性片段和/或與功能結 構域相對應的片段。用於克隆基因的體外誘變的技術是已知的。在本發明中還包括已使用 普通分子生物學技術修飾的多肽，以便改善其對蛋白酶解降解的抗性或優化可溶性質或使 得它們更適合於作為治療劑。嵌合抗體可以通過重組方法通過使從一個物種的抗體生成細胞獲得可變輕鏈和 重鏈區域0MnvH)相組合進行製備，其具有來自另一個物種的恆定輕和重鏈區域。一般 地，嵌合抗體利用嚙齒類動物或兔可變區和人恆定區，以便產生具有佔優勢地人結構域的 抗體。此種嵌合抗體的產生是本領域眾所周知的,並且可以通過標準方法(如例如美國專 利號5, 624, 659中描述的,其通過引用整體合併入本文)來實現。進一步考慮本發明的嵌 合抗體的人恆定區可以選自 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgGlO、 IgGll、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18 或 IgG19 恆定區。「以延長時間穩定表達或表達所需分泌異源多肽的多倍體酵母」指如下酵母培養 物，其在--般至少10-25mg/升和優選基本上更大的閾值表達水平下，分泌所述多肽至少數 天到一周、更優選至少一個月、更加優選至少1-6個月、且甚至更優選超過一年。表達「分泌所需量重組多肽的多倍體酵母培養物」指以穩定或延長時期分泌至少 10 25mg/升異源多肽、更優選至少50-500rag/升、且最優選500-lOOOmg/升或更多的培養 物。如果多核苷酸序列依照遺傳密碼的翻譯產生多肽序列(即，多核苷酸「編碼」多肽 序列)，那麼多核苷酸序列與多肽序列「相對應」，如果2個序列編碼相同的多肽序列，那麼 一個多核苷酸序列與另一個多核苷酸序列「相對應」。表達DNA構建體的「異源」區域或「異源結構域」指在自然界中未發現與較大分子 相關的在較大DNA分子內的DNA可鑑定區段。因此，當異源區域編碼哺乳動物基因時，基因 通常側面是如下DNA,所述DNA不在來源生物體的基因組中的哺乳動物基因組DNA的側面。 異源區域的另一個例子是其中編碼序列本身在自然界中未發現(例如,其中基因組編碼序 列的cDNA包含內含子,或具有不同於天然基因的密碼子的合成序列)的構建體。等位基因 變體或天然存在的突變事件不產生如本文定義的DNA的異源區。表達「編碼序列」指(就遺傳密碼而言)對應於或編碼蛋白質或肽序列的密碼子 的框內序列。如果序列或其互補序列編碼相同的胺基酸序列,那麼2個編碼序列彼此相對 應。與合適調節序列結合的編碼序列可以轉錄且翻譯成多肽。多腺苷酸化信號和轉錄終止 序列通常將位於編碼序列3』。表達「載體」在本文中指用於將外源物質例如DNA、RNA或蛋白質引入生物體或宿 主細胞內的材料。一般的載體包括重組病毒(對於多核苷酸)和脂質體(對於多肽)。「DNA 載體」是另一個多核苷酸區段可以與之附著以便造成附著區段的複製的複製子,例如質粒、 噬菌體或粘粒。在本文中，「表達載體」是如下DNA載體，其包含將指導通過合適宿主細胞的 多肽合成的調節序列。這通常指結合RNA聚合酶且起始mRNA轉錄的啟動子，以及核糖體結 合位點和起始信號以指導mRNA翻譯成一種或多種多肽。多核苷酸序列在合適位點處和在 正確讀碼框中摻入表達載體內，隨後通過載體轉化合適宿主細胞,使得能夠生產由所述多 核苷酸序列編碼的多肽。在多核苷酸序列上下文中的術語「擴增」是特定核酸序列的多個拷貝的體外產生。
30擴增的序列通常為DNA的形式。用於執行此種擴增的多種技術在Van Brunt (1990, Bio/ Techno 1. ,8(4) 291-294)的綜述文章中描述。聚合酶鏈反應或PCR是核酸擴增的典型，並 且PCR在本文中的使用應視為其他合適擴增技術的示例。發明詳述主題人源化方法--般可應用於人源化任何兔抗體或其可變區，即這些抗體可以與 不同所需抗原特異性結合。此外，主題人源化方法可以應用於人源化其他物種抗體，例如來 自與兔緊密相關的動物例如在兔形目或兔科中的其他哺乳動物(其包括不同的兔和野兔) 的抗體。因為它們與馴養兔緊密相關,所以這些哺乳動物應具有與本文用作人源化的來源 或兔抗體的馴養兔物種緊密相關的可變序列。因此,下文與人源化抗TNF-a或抗IL-6抗 體合成相對應的描述是示例性的。本發明人源化方案在圖1中示意性描述並且在F文中詳 細描述。對下文公開的方法的描述提供通常應用的規則以及這些規則對作為例子在圖2中 所示的特定序列的應用。本發明考慮了主題人源化策略產生人源化重鏈和輕鏈以及包含對任何所需抗原 特異的抗體和抗體片段的用途。合適抗原的例子包括人蛋白質例如生長因子，細胞因子， 酶，激素，腫瘤特異性抗原,癌基因等，變應原，來自傳染物例如細菌、病毒、真菌、酵母、寄生 蟲等的抗原,毒素等。下文的例子例示用於獲得對TNF-a和IL-6特異的人源化兔抗體的 方法,並且舉例說明本發明方法及其固有優點。本發明還考慮了包括根據本發明產生的一條或多條人源化重鏈或輕鏈的抗體片 段。本發明特別考慮了對於TNF-a或IL-6具有結合特異性的人源化抗體片段。此種抗體 片段可以以一種或多種下述非限制性形式存在Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv和單鏈Fv抗體如先前所述，在本發明的一個優選和示例性實施方案中，在本文提及的人源化過 程起始前，用於人源化的抗體起始於或選自一種或多種克隆抗原特異性兔B細胞群體。如上所述,抗體及其片段可以進行翻譯後修飾，以添加效應物部分，例如化學接 頭,可檢測部分例如螢光染料、酶、底物、生物發光材料、放射性材料和化學發光部分,或功 能部分例如鏈黴親和素、抗生物素蛋白、生物素、細胞毒素、細胞毒素劑和放射性材料。關於可檢測部分，進一步的示例性酶包括但不限於，辣根過氧化物酶、乙醯膽鹼酯 酶、鹼性磷酸酶、卩-半乳糖苷酶和螢光素酶。進一步的示例性螢光材料包括但不限於,羅 丹明、螢光素、異硫氰酸螢光素、傘形酮、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)、藻紅蛋 白和丹醯氯。進一步的示例性化學發光部分包括但不限於魯米諾。進一步的示例性生物發 光材料包括但不限於，螢光素和水母螢光素。進一步的示例性放射性材料包括但不限於，碘 125 (1251)、碳 14 (14C)、硫 35 (35S)、氘(3H)和磷 32 (32P)。關於功能部分，示例性細胞毒素劑包括但不限於，氨甲蝶呤、氨基蝶呤、6-巰嘌 呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺；烷化劑例如氮芥、thioepa苯丁酸氮 芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)、絲裂黴素C、羅莫司汀(CCNU)、1 甲基亞硝脲、環磷醯胺 (cyd.othospharai.de)、氮芥、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C、順鉬(II) (DDP)順 鉬和卡鉬(伯爾定)；蒽環類包括柔紅黴素(以前的道諾黴素)、多柔比星(doxorubicin) (阿黴素)、地託比星、洋紅黴素、伊達比星、表柔比星、米託蒽醌和比生群；抗生素包括更生 黴素(放線菌素D)、博來黴素、卡奇黴素、光輝黴素和氨茴黴素(AMC)；和抗有絲分裂試劑例如長春花生物鹼、長春新鹼和長春鹼。其他細胞毒素劑包括紫杉醇(泰素)、蓖麻蛋白、假 單胞菌外毒素、吉西他濱、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、依米丁、依託泊苷、替尼泊 苷(tenoposide)、秋水仙鹼、二羥基蒽二酮、1-脫氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、 利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素、丙卡巴胼、羥基脲、天冬醯胺酶、皮質類固醇、mytotane(0, P' _(DDD))、幹擾素、和這些細胞毒素劑的混合物。進一步的細胞毒素劑包括但不限於，化學治療劑例如卡鉬、順鉬、紫杉醇、吉西他 濱、卡奇黴素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、絲裂黴素C、放線菌素D、環磷醯胺、長春新鹼和博來 黴素。來自植物和細菌的毒性酶例如蓖麻蛋白、白喉毒素和假單胞菌毒素可以與人源化 抗體或其結合片段綴合，以產生細胞類型特異性殺死試劑(Youle等人，Proc. Natl Acad. Sci.USA 77 =5483(1980) ;Gilliland 等人，Proc. Nat ' lAcad. Sci. USA 77:4539(1980); Krolick 等人，Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 77:5419(1980))。其他細胞毒素劑包括細胞毒性核糖核酸酶，如由Go 1 denberg在美國專利號 6,653, 104中描述的。本發明的實施方案還涉及其中發出a或粒子的放射性核素與 抗體或其結合片段穩定偶聯的放射免疫綴合物，其中使用或不使用複合物形成試劑。此 种放射性核素包括0 -發射體例如磷-32 (32P)、鈧-47 (47Sc)、銅-67 (67Cu)、鎵-67 (67Ga)、 釔-88 (88Y)、釔-90(9°Y)、碘-125 (1251)、碘-131 (1311)、釤-153 (153Sm)、鐠-177(mLu)、 錸-186 (186Re)或錸-188 (188Re)，以及 a -發射體例如砹-211 (21lAt)、鉛-212 (212Pb)、 鉍-212(212Bi)或-213(213Bi)或錒-225 (225Ac)。用於使抗體或其結合片段與可檢測部分等綴合的方法是本領域已知的，例如 由 Hunter 等人，Nature 144 945(1962) ；David 等人，Biochemis try 13 1014(1974)； Pain 等人,J. Immunol. Met.h. 40 219(1981)；禾口 Nygren, J. , Histochem. and Cytochem. 30 407(1982)描述的那些方法。本文描述的實施方案進一步包括與本文闡述的抗體、抗體片段、多肽、可變區和 CDR基本上同源的變體和等價物。這些可以包含例如保守置換突變(即，一個或多個氨基 酸被相似胺基酸置換)。例如,保守置換指胺基酸由在相同一般種類內的另一個置換,例如 一個酸性胺基酸由另一個酸性胺基酸置換，一個鹼性胺基酸由另一個鹼性胺基酸置換，或 一個中性胺基酸由另一個中性胺基酸置換。保守胺基酸置換的所指內容是本領域眾所周知 的。在另一個實施方案中，本發明考慮了與本文闡述的抗體片段、可變區和CDR的任 何一個或多個人源化多肽序列具有至少90%或更大序列同源性的多肽序列。更優選地，本 發明考慮了與根據本發明產生的任何一個或多個人源化抗體片段具有至少95%或更大序 列同源性、更加優選至少98%或更大序列同源性、並且更加優選至少99%或更大序列同源 性的人源化多肽序列。本發明人源化方案的顯著優點是根據本發明產生的包含人源化可變序列的抗體 的結合親和力相對於親本兔抗體的結合親和力保持基本上完整(未改變的)。優選地，通過 本發明產生的人源化抗體例如人源化抗IL-6或TNF a抗體及其片段將對於IL 6、TNF_ a 或在人治療中有用的另一種抗原具有結合特異性，並且將以小於或等於SxlO—V^lCTV、 SxlO—SM—^lO—SM—^SxlO—ll—^lOll—^SxlO—iaM—^lCn—^SxlO—nM—^lO—nM—^SxlOmM—^lO—WM—1、 5x10 10 ^^^SxlO 10 ^^^SxlO 15M 1 it 10 15M 1 的解離常數(KD)與其抗原結合優選地,主題人源化抗體將以小於或等於SxlO^M—1的解離常數結合其抗原靶例如IL-6或 TNF- a抗體。在本發明的另一個實施方案中，由兔抗體產生的人源化抗體和片段將對於抗原 例如IL-6或TNF-a具有結合特異性，其離開速率小於或等於lO-nS-yxlO—S-1、 l(T6S]、5xl(T7S-1 或 1(T7S-1。在本發明的一個進一步的實施方案中，本發明的主題人源化抗體及其片段的活性 將對於抗原例如TNF-a具有結合特異性，並且顯示激動或拮抗特定抗原的功能的活性。優 選地抗原將是治療靶,並且人源化抗體將改善或減少與特定抗原例如IL-6或TNF或另一種 治療靶例如人腫瘤多肽、自身抗原、變應原或對傳染物特異的抗原相關的疾病和病症的症B細胞篩選和分離如所述的,本發明提供了可應用於有效人源化任何兔抗體，即對任何所需抗原特 異的--般方法。這些抗體可以衍生自雜交瘤細胞、血清、或衍生自分泌兔抗體或緊密相關物 種例如其他兔形目動物的抗體的免疫細胞。如果使用免疫細胞，那麼優選這些細胞構成分 泌對所需靶抗原特異的抗體的B細胞,所述B細胞通過下述B細胞分離方案衍生。已發現 這個方案提供如下B細胞群體,其產生具有良好結合親和力的抗體的選擇,並且此外產生 抗體的完全儲庫或多樣性，即包括與廣泛多樣的不同表位結合的那些的抗體群體。在這個 優選實施方案中，本發明提供了分離得自免疫兔的抗原特異性B細胞的克隆群體的方法， 所述免疫兔可以用於分離至少一種抗原特異性細胞。如所述和下文例示的,這些方法包含 可以分開、組合、順次、重複或周期使用的一系列培養和選擇步驟。優選地，這些方法用於分 離至少一種抗原特異性細胞,其可以用於產生對所需抗原特異的單克隆抗體，或與此種抗 體相對應的核酸序列。基本上，這些方法包括下述步驟a.製備包含至少一種抗原特異性B細胞的細胞群體；b.例如通過層析法富集細胞群體，以形成包含至少一種抗原特異性B細胞的富集 細胞群體；c.從富集的B細胞群體中分離單個B細胞；和d.測定單個B細胞是否產生對抗原特異的抗體。這些方法提供對分離單個、抗體生成B細胞的方法的改善,所述改善包括富集得 自宿主的B細胞群體，所述宿主已免疫接種或天然暴露於抗原，其中富集步驟在任何選擇 步驟前進行，包括至少一個培養步驟，且得到產生對所述抗原特異的單個單克隆抗體的B 細胞的克隆群體。就優選用於衍生分泌本申請自始至終的本發明人源化方法中使用的抗體的兔B 細胞的此種方法而言，「B細胞的克隆群體」指僅分泌對所需抗原特異的單個抗體的B細胞 群體。這就是說這些細胞僅產生對所需抗原特異的一個類型的單克隆抗體。在描述此種方法中，表達「富集」細胞群體的細胞指增加在混合細胞群體,例如衍 生自針對所需抗原免疫接種的宿主的含B細胞分離物中包含的所需細胞一般是抗原特異 性細胞的頻率。因此，富集的細胞群體包含由於富集步驟具有更高頻率的抗原特異性細胞 的細胞群體，但這個細胞群體可以包含並產生不同抗體。
在進一步描述此種方法中，一般表達「細胞群體」包含富集前和後細胞群體,應記 住當執行多個富集步驟時，細胞群體可以是富集前和後的。更優選地，用於衍生抗原特異性 B細胞的克隆群體的這些方法將包括a.從免疫接種的宿主中收穫細胞群體，以獲得收穫的細胞群體；b.由收穫的細胞群體製備至少一種單細胞懸浮液；c.富集至少一種單細胞懸浮液，以形成第一種富集的細胞群體；d.富集第一種富集的細胞群體，以形成第二種富集的細胞群體；e.富集第二種富集的細胞群體，以形成第三種富集的細胞群體；和f.選擇由第三種富集的細胞群體的抗原特異性細胞產生的抗體。每種細胞群體可以在F—個步驟中直接使用，或它可以部分或完全冷凍用於長期 或短期貯存或用於稍後步驟。此外，來自細胞群體的細胞可以個別懸浮，以產生單細胞懸浮 液。單細胞懸浮液可以進行富集,從而使得單細胞懸浮液充當富集前細胞群體。隨後,一種 或多種抗體特異性單細胞懸浮液一起形成富集的細胞群體；抗原特異性單細胞懸浮液可以 集合在一起，例如再鋪板用於進一步分析和/或抗體產生。抗原特異性可以就任何抗原而言進行測量。抗原可以是抗體與之結合的任何物 質,包括但不限於,肽、蛋白質或其片段；碳水化合物；有機和無機分子；通過動物細胞、細 菌細胞和病毒產生的受體；酶；生物途徑的激動劑和拮抗劑；激素；和細胞因子。示例性抗 原包括但不限於，IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、IFN-a、IFN- y , BAFF、 CXCL13、IP-10、VEGF、EPO、EGF、HRG、MIF、和集落刺激因子、TPAs、幹擾素、腫瘤相關抗原、 HIV抗原例如env和gag和po:[、流感抗原、禽流感抗原等。優選的抗原包括IL-6、]丄-13、 TNF-a、VEGF-a、海帕西啶(hepcidin)和肝細胞生長因子以及對特定人癌症特異的腫瘤 抗原。在利用超過一個富集步驟的方法中，在每個富集步驟中使用的抗原可以彼此相同或 不同。使用相同抗原的多個富集步驟可以產生抗原特異性細胞的大型和/或分散群體；使 用不同抗原的多個富集步驟可以產生對不同抗原具有交叉特異性的富集細胞群體。富集細胞群體可以通過本領域已知用於分離抗原特異性細胞的任何細胞選擇方 法來執行。例如，細胞群體可以通過層析技術進行富集，例如Miltenyi珠或磁珠技術。珠 可以與目的抗原直接或間接附著。在一個優選實施方案中，富集細胞群體的方法包括至少 一個層析富集步驟。細胞群體還可以通過本領域已知的任何抗原特異性測定技術進行富集,例如 ELISA測定法或暈圈測定法(halo assay) 0 ELISA測定法包括但不限於，選擇性抗原固定 (例如，使用鏈黴親和素、抗生物素蛋白或中性鏈親和素包被平板的生物素化抗原捕獲)、 非特異性抗原平板包被、和通過抗原疊加策略(例如，選擇性抗原捕獲隨後結合配體添加， 以產生異聚蛋白質-抗原複合物)。抗原可以與固體基質或支持物例如柱直接或間接附著。 暈圈測定法包括使細胞與抗原裝載的珠和對用於收穫B細胞的宿主特異的標記抗宿主抗 體接觸。標記可以是例如螢光團。在一個實施方案中，對至少一種單細胞懸浮液執行至少 一個測定富集步驟。在另一個實施方案中，富集細胞群體的方法包括至少一個層析富集步 驟和至少--個測定富集步驟。通過大小或密度「富集」細胞群體的方法是本領域已知的。這些步驟可以在本方 法中另外用於通過抗原特異性富集細胞群體。
在這些方法中使用的細胞群體將包含能夠識別抗原的至少--種細胞。抗原識別細 胞包括但不限於B細胞、漿細胞及其後代。一般地，這些方法將在產生包含單個類型的抗原 特異性B細胞的克隆細胞群體的條件下實現，即細胞群體產生對所需抗原特異的單個單克 隆抗體。在本發明中，這些抗原特異性B細胞一般將是兔的,或備選地B細胞來自緊密相關 的哺乳動物物種。認為通過本文提供的新型培養和選擇方案獲得由佔優勢地抗原特異性、抗體分泌 細胞組成的克隆抗原特異性B細胞群體。在此種方法中，單個B細胞的分離可以通過在任何選擇步驟前富集得自宿主的細 胞群體來實現，例如,從細胞群體中選擇特定B細胞和/或選擇通過特定細胞生產的抗體。 富集步驟可以以1、2、3或更多個步驟來執行。在一個實施方案中，在證實單個B細胞是否 分泌具有抗原特異性和/或所需性質的抗體前，從富集的細胞群體中分離單個B細胞。在本發明的一個優選實施方案中,得自對所需抗原免疫接種的兔的富集細胞群體 在用於抗體產生和/或選擇的方法中使用，所述抗體是用於主題人源化策略的候選原材 料。該方法可以包括F述步驟製備包含至少一種抗原特異性細胞的細胞群體，通過分離至 少一種抗原特異性細胞富集細胞群體，以形成富集的細胞群體，並且誘導來自至少一種抗 原特異性細胞的抗體產生。在一個優選實施方案中，富集的細胞群體包含超過一種抗原特 異性細胞。在一個實施方案中,在由其分離抗體生成細胞和/'或使用所述B細胞產生抗體, 或與在苯發明的人源化策略中使用的此種抗體相對應的核酸序列前，在產生克隆抗原特異 性B細胞群體的條件下培養富集群體的每個抗原特異性細胞。與從具有低頻率的抗原特異 性細胞的細胞群體產生抗體的現有技術形成對比,本發明允許來自高頻率的抗原特異性細 胞中的抗體選擇。因為富集步驟在抗體選擇前使用，所以用於抗體產生的大多數細胞，優選 基本上所有細胞是抗原特異性的。通過從具有增加頻率的抗原特異性的細胞群體產生抗 體，增加抗體的數量和品種，從而提供更多原材料用於人源化。當使用這些抗體選擇方法用於衍生用於人源化的兔抗體時,優選在產生抗原特異 性B細胞的克隆群體的富集步驟和培養步驟後選擇抗體。該方法可以進一步包括測序來自 一種或多種分離的、抗原特異性細胞的所選擇抗體或其部分的步驟。可以利用本領域已知 用於測序的任何方法,並且可以包括測序重鏈、輕鏈、一個或多個可變區、和/或一個或多 個互補決定區(CDR)。除富集步驟外,用於抗體選擇的方法還可以包括就抗原識別和/或抗體功能性篩 選細胞群體的一個或多個步驟。例如，所需抗體可以具有特異性結構特徵，例如與特定表位 結合或對特定結構的模擬；拮抗劑或激動劑活性；或中和活性，例如抑制抗原和配體之間 的結合。在一個實施方案中，抗體功能性篩選是配體依賴性的。就抗體功能性篩選包括但 不限於,再創造抗原配體與重組受體蛋白質的天然相互作用的體外蛋白質-蛋白質相互作 用測定法；和配體依賴性且容易監控的基於細胞的應答(例如增殖應答)。在一個實施方案 中，用於抗體選擇的方法包括通過測量抑制濃度(IC50)就抗體功能性篩選細胞群體的步 驟。在一個實施方案中，至少一種分離的、抗原特異性細胞產生具有小於約100、50、30、25、 10 u g/mL或其中的增量的IC50的抗體。除富集步驟外，用於抗體選擇的方法還可以包括就抗體結合強度篩選細胞群體 的一個或多個步驟。抗體結合強度可以通過本領域已知的任何方法(例如，Biacore)進
35行測量。在一個實施方案中，至少--種分離的、抗原特異性細胞產生具有高抗原親和力 的抗體，例如小於約 SxlO-^-1、優選約 lxio-1、-1 至 SxlO^VaxlO^M"1 至 7. SxlO^^f1, 1x10 nM 1至2x10 nM人或約1. 5x10 nM 1或其中的增量的解離常數(Kd)。在這個實施方 案中，抗體被說成親和力成熟的。在一個優選實施方案中，用於本文人源化的抗體的親和 力可與下述任何一種的親和力相當或高於下述任何一種的親和力:Panorex (依決 洛單抗)、Rituxan (利妥昔單抗)、Herceptin (曲妥珠單抗)、Mylotarg (gentuzumab)、Campa th (阿侖珠單抗)、ZeValinTM(替伊莫單抗)Jrbitux (西妥昔單 抗)、AVaStinTM(beViCiZumab) ,Raptiva (依法珠單抗)、Refilicad& (英夫利昔單抗)、 Humira (阿達木單抗)和Xolair (奧馬珠單抗)。優選地，抗體的親和力可與Humira 的 親和力相當或高於Humira 的親和力。抗體的親和力還可以通過已知親和力成熟技術而得 到增加。在一個實施方案中，至少一種細胞群體就抗體功能性和抗體結合強度中的至少--種、優選兩種進行篩選。除富集步驟外，用於選擇候選物用於人源化的抗體選擇的方法也可以包括就抗體 序列同源性特別是人同源性篩選兔細胞群體的一個或多個步驟。在一個實施方案中，至少 一種分離的、抗原特異性細胞產生對人抗體具有約50% -約100%或其中的增量的同源性， 或超過約60%、70%、80%、85%、90%或95%同源性的抗體。在另一個優選實施方案中，本發明還提供了根據上文就IC50、Kd和/或同源性而 言描述的任何實施方案從抗體產生的兔衍生的人源化抗體。與用於獲得抗體分泌B細胞和對所需靶抗原特異的單克隆抗體的其他方法比較, 本文公幵的B細胞選擇方案具有許多固有優點，所述方案優選用於鑑定產生抗體的B細胞， 所述抗體具有使得其成為用於人源化的良好候選物的親和力和功能性質。這些優點包括但 不限於下述首先，已發現當這些選擇操作與所需抗原例如IL-6或TNF- a 一起使用時,該方法 可重現地產生抗原特異性B細胞，例如衍生自能夠產生看起來是抗體的基本上全面互補體 的兔，即與抗原的各種不同表位結合的抗體。不受理論束縛，假定全面互補體可歸因於在起 始B細胞回收前執行的抗原富集步驟。此外,這個優點允許分離和選擇具有不同性質的抗 體,因為這些性質可能依特定抗體的表位特異性而變。這些抗體是用於本發明人源化策略 的理想原材料。其次，已發現本發明的B細胞選擇方案可重現地產生包含單個B細胞或其後代的 克隆B細胞培養物,其分泌一般以相對高的結合親和力與所需抗原結合的單個單克隆抗 體。相比之下,現有的抗體選擇方法趨於產生相對少數的高親和力抗體,並且因此需要廣泛 的篩選操作以分離具有治療潛力的抗體。不受理論束縛，假定本發明的方案導致宿主的體 內B細胞免疫接種(初次免疫接種)，隨後為第二次體外B細胞刺激(二次抗原引發步驟)， 這可以增強回收的克隆B細胞分泌對抗原靶特異的單個高親和力單克隆抗體的能力和性 質。第三，已觀察到本發明的B細胞選擇方案可重現地得到產生IgG的B細胞，所述 IgG平均起來,對所需靶具有高度選擇性(抗原特異性)。在基於其上的部分中，通過本發 明方法回收的抗原富集的B細胞被認為包含能夠得到表位特異性的所需完全互補體的B細
36胞，如上文討論的。 第四，已觀察到這種B細胞選擇方案，即使與小抗原一起使用時，即100個胺基酸 或更少的肽，例如長5-50個胺基酸,也可重現地產生克隆B細胞培養物，其分泌針對小抗原 例如肽的單個高親和力抗體。這是卜分令人驚訝的，因為這一般是很難、勞力密集型的、且 有時甚至無法產生針對小肽的高親和力抗體。因此,這些方法可以用於產生理想候選物用 於衍生針對所需肽靶的人源化治療抗體，所述肽靶例如病毒、細菌或自身抗原肽，從而允許 產生具有非常分散的結合性質的單克隆抗體、或甚至產生針對不同肽靶例如不同病毒毒株 的單克隆抗體混合物(cocktail)。在產生具有所需效價的治療或預防疫苗的背上下文中， 這個優點可以是特別有用的，所述疫苗例如誘導針對不同HPV毒株的保護性免疫的HPV疫 第五
細胞選擇方案，特別是當與衍生自兔的B細胞一起使用時，趨於可重 ㈣待異性抗體序列，其與內源人免疫球蛋白非常相似(在胺基酸水平上約90% 相似)，並且包含具有非常類似於人免疫球蛋白的長度且因此需要很少的序列修飾或無序 列修飾的CDR( 一般如先前所述在親本抗體序列中至多僅需要修飾少數CDR殘基且不引入 構架外源殘基)，以便消除潛在的免疫原性牽扯。特別地，優選地重組抗體將僅包含抗原識 別所需的宿主(兔)⑶R1和⑶R2殘基和整個⑶R3,因為這似乎對於抗體親和力成熟是重要 的。因此，即使人源化時,根據本發明的B細胞和抗體選擇方案產> 原結合親和力也保持完整或基本上完整。總之，通過使用比先前已知更有效的方案，本發明方沒 表位顯示更高結合親和力的人源化抗體。在一個具體實施方案中,本發明提供了通過包括下述步驟的過程用於鑑定單個B 細胞的方法，所述B細胞分泌對所需抗原特異的抗體用於在本發明方案中人源化，並且任 選具有至少一種所需功能性質例如親和力、親合力、細胞溶解活性等，a.針對抗原免疫接種宿主；b.從宿主中收穫B細胞；c.富集收穫的B細胞，以增加抗原特異性細胞的頻率；d.製備至少一種單細胞懸浮液；e.在有利於單個抗原特異性B細胞/培養孔存活的條件下，培養來自單細胞懸浮 液的亞群；f.從亞群中分離少於10-12個B細胞；和g.測定單個B細胞是否產生對所述抗原特異的抗體。本發明方法將進一步整體或部分包括分離和測序編碼所需抗體的多肽和核酸序 列的另外步驟，以鑑定關鍵殘基例如選擇性決定殘基,並且以便使用這種序列作為BLAST 搜索的部分，來鑑定候選同源人可變序列以用於衍生其理想的人源化形式。這些序列或其 人源化形式或部分可以在所需宿主細胞中表達，以便產生針對所需抗原例如IL 6、TNF a、 肝細胞生長因子、海帕西啶等的重組抗體。如先前所述,認為B細胞的克隆群體佔優勢地包含產生針對所需抗原的抗體的抗 體分泌B細胞。還認為基於用幾種抗原和用不同B細胞群體獲得的實驗結果，根據本發明產
生的克隆產生的B細胞
細胞分泌如下單克隆抗體，與從培養的抗原特異性B細胞衍生單克隆抗體的其他方法比較，所述單克隆抗體一般具有相對 高的親和力，並且此外能夠有效且可重現地產生更大表位變異性的單克隆抗體的選擇。在 本發明中，在此種B細胞選擇方法中使用的免疫細胞群體將衍生自兔或與其緊密相關的動 物，例如另一個兔科物種。認為兔或緊密相關的哺乳動物用作B細胞的來源可以增強單克 隆抗體的多樣性，所述單克隆抗體可以在本發明中用於衍生人源化形式。此外,根據本發明 衍生自兔的抗體序列一般具有如F序列，所述序列與人抗體序列具有高度序列同一性，使 得它們有利於在人中使用，因為它們應產生具有很少抗原性的人源化變體。在人源化的過 程中，最終人源化抗體包含少得多的外源/宿主殘基含量，通常限制於由於其性質與移植 中使用的人靶序列顯著不同的宿主CDR殘基的子集。這增強了在使用本發明的人源化策略 產生的人源化抗體蛋白質中完全活性回收的可能性。使用本文公開的富集步驟的抗體選擇方法包括從免疫接種的宿主中獲得包含免 疫細胞的細胞群體的步驟。從免疫接種的宿主中獲得包含免疫細胞的細胞群體的方法是本 領域已知的，並且一般包括在宿主中誘導免疫應答,和從宿主中收穫細胞以獲得一種或多 種細胞群體。可以通過針對所需抗原免疫接種宿主而引發應答。備選地，用作此種免疫細 胞來源的宿主可以天然地暴露於所需抗原,例如已用特定病原體例如細菌或病毒感染的個 體,或者備選地已設定對個體所患有的癌症的特異性抗體應答。在本方法中，宿主是兔。如所述的，免疫應答可以由於疾病天然地發生,或它可以通過使用抗原的免疫接 種而誘導。免疫接種可以通過本領域已知的任何方法來執行，例如，通過一次或多次注射抗 原連同或不連同增強免疫應答的試劑，例如完全或不完全弗氏佐劑。作為體內免疫接種宿 主動物的備選方案,該方法可以包括體外免疫接種宿主細胞培養物。允許用於免疫應答(例如,如通過血清抗體檢測測量)的時間後，收穫宿主動物細 胞以獲得一種或多種細胞群體。在一個優選實施方案中，就抗體結合強度和/或抗體功能 性篩選收穫的細胞群體。收穫的細胞群體優選來自脾、淋巴結、骨髓和/或外周血單核細胞 (PBMC)中的至少一種。細胞可以從超過一個來源收穫且合併。特定來源對於特定抗原可 能是優選的。例如,脾、淋巴結和PBMC對於IL-6是優選的；並且淋巴結對於TNF是優選的。 在免疫接種後約20到約90天或其中的增量，優選約50到約60天收穫細胞群體。收穫的 細胞群體和/或來自其的單細胞懸浮液可以就抗體選擇進行富集、篩選和/或培養。抗原 特異性細胞在收穫的細胞群體內的頻率通常為約-約5%,或其中的增量。在--個實施方案中，來自收穫細胞群體的單細胞懸浮液優選通過使用Miltenyi 珠進行富集。來自具有約_約5%抗原特異性細胞的頻率的收穫細胞群體，從而衍生具 有接近100%抗原特異性細胞的頻率的富集細胞群體。使用富集步驟的抗體選擇方法包括從來自富集細胞群體的至少一種抗原特異性 細胞產生抗體的步驟。體外產生抗體的方法是本領域眾所周知的，並且可以採用任何合適 的方法。在一個實施方案中，將富集細胞群體，例如來自收穫細胞群體的抗原特異性單細 胞懸浮液，以多種細胞密度，例如50、100、250、500、或在1-1000個細胞之間的其他增量/ 孔進行鋪平板。優選地,亞群包含不超過約10，000個抗原特異性、抗體分泌細胞，更優選 約50-10, 000、約50-5，000、約50-1, 000、約50-500、約50-250個抗原特異性、抗體分泌細 胞，或其中的增量。隨後，這些亞群用合適的培養基(例如，活化T細胞條件培養基，特別是 1-5%活化兔T細胞條件培養基)在飼養層上培養，優選在有利於單個增殖抗體分泌細胞/培養孔存活的條件下。飼養層--般包含被照射的細胞物質,例如EL4B細胞,不構成細胞群 體的部分。細胞在合適的培養基中培養足以用於抗體產生的時間，例如約1天到約2周、約 1天到約10天、至少約3天、約3到約5天、約5天到約7天、至少約7天、或其中的其他增 量。在一個實施方案中，同時培養超過一個亞群。優選地,單個抗體生成細胞及其後代在每 個孔中存活,從而在每個孔中提供抗原特異性B細胞的克隆群體。在這個階段時,通過克隆 群體產生的免疫球蛋白G(IgG)與抗原特異性高度關聯。在一個優選實施方案中，IgG顯示 出與抗原特異性超過約50 %，更優選超過70 %、85 %、90 %、95 %、99 %，或其中的增量的關 聯。該關聯已通過在有限條件下建立B細胞培養物以產生單個抗原特異性抗體產物/孔得 到證實。比較抗體特異性與--般IgG合成。觀察到3個群體識別抗原(生物素化且直接 包被的)的單個甲酸鹽的IgG，與固定無關的可檢測IgG和抗原識別，和單獨的IgG產生。 IgG產生與抗原特異性高度關聯。任選收集包含抗體的上清液,這可以根據上文描述的步驟就抗體選擇進行富集、 篩選和/或培養。在--個實施方案中，上清液就抗體功能性進行富集(優選通過抗原特異 性測定法，特別是ELISA測定法)和/或篩選。在另一個實施方案中，富集的、優選克隆、抗原特異性B細胞群體(由其任選篩選 上文描述的上清液，以便檢測所需分泌的單克隆抗體的存在)用於分離少數B細胞,優選單 個B細胞,其隨後在合適的測定法中進行測試，以便證實單個抗體生成B細胞在克隆B細胞 群體中的存在。在一個實施方案中，從克隆B細胞群體中分離約1到約20個細胞，優選小 於約15、12、10、5或3個細胞,或其中的增量，最優選單個細胞。篩選優選通過抗原特異性 測定法特別是暈圈測定法來完成。暈圈測定法可以用全長蛋白質或其片段來執行。包含抗 體的上清液也可以就下述至少一種進行篩選抗原結合親和力；抗原_配體結合的激動或 拮抗、特定靶細胞類型增殖的誘導或抑制；靶細胞裂解的誘導或抑制，和涉及抗原的生物途 徑的誘導或抑制。衍生自兔宿主的鑑定的抗原特異性細胞可以用於衍生編碼所需單克隆抗體的相 對應核酸序列，所述單克隆抗體可以在本發明的人源化方法中使用。(Alul消化可以證實僅 產生單個單克隆抗體類型/孔)。如上所述，這些序列隨後優選通過本發明的人源化方案進 行突變，以便使得它們更適合於在人藥物中使用。如所述的，在本發明過程中使用的來自兔的富集B細胞群體也可以根據上文描述 的步驟就抗體選擇進行進一步富集、篩選和/或培養,所述步驟可以重複或以不同順序執 行。在一個優選實施方案中，富集的、優選克隆、抗原特異性細胞群體的至少一個細胞進行 分離、培養和用於抗體選擇。因此,在另一個實施方案中，本發明提供了分離在主題人源化方法中使用的抗體 候選物的方法，其包括a.從免疫接種的兔宿主中收穫細胞群體，以獲得收穫的細胞群體；b.由收穫的細胞群體製備至少一種單細胞懸浮液；c.優選通過層析法富集至少一種單細胞懸浮液，以形成第一種富集的細胞群體；d.優選通過ELISA測定法富集第--種富集的細胞群體，以形成優選是克隆的第二 種富集的細胞群體，即，它僅包含單個類型的抗原特異性B細胞；e.優選通過暈圈測定法富集第二種富集的細胞群體，以形成包含單個或少數B細胞的第三種富集的細胞群體，所述B細胞產生對所需抗原特異的抗體；和f.選擇通過從第三種富集的細胞群體中分離的抗原特異性細胞產生的抗體。該方法可以進一步包括就抗體結合強度(親和力、親合力)和/或抗體功能性篩 選收穫的細胞群體的一個或多個步驟。合適的篩選步驟包括但不限於，檢測下述的測定方 法由鑑定的抗原特異性B細胞產生的抗體是否產生具有最低抗原結合親和力的抗體，抗 體是激動還是拮抗所需抗原與配體的結合；抗體是誘導還是抑制特定細胞類型的增殖；抗 體是否誘導或引發針對靶細胞的細胞溶解反應；抗體是否與特定表位結合；和抗體是否調 節(抑制或激動)涉及抗原的一個或多個特定生物途徑。類似地,該方法可以包括就抗體結合強度和/或抗體功能性篩選第二種富集的細 胞群體的一個或多個步驟。該方法進一步包括測序所選擇抗體的多肽序列或相對應核酸序列，以鑑定關鍵殘 基且以便進行用於在主題人源化方法中使用的合適同源人種系抗體序列的BLAST搜索的 步驟。該方法還包括使用所選擇抗體的序列、其片段、或遺傳修飾的人源化形式產生重組 抗體的步驟。這些人源化突變方法可以產生具有所需效應子功能、免疫原性、穩定性、去除 或添加糖基化等的重組抗體。本文描述的重組人源化抗體或人源化抗體片段可以通過任 何合適的重組細胞產生,所述重組細胞包括但不限於哺乳動物細胞，例如CHO、COS、BHK、 HEK-293,細菌細胞,酵母細胞,植物細胞，昆蟲細胞和兩棲動物細胞。在一個優選實施方案 中，親本兔抗體和衍生自這些抗體的人源化抗體和同源人可變序列在多倍體酵母細胞，即 二倍體酵母細胞特別是畢赤酵母屬中表達。基本上，該方法可以如下實現a.針對抗原免疫接種兔宿主，以產生兔抗體；b.就抗原特異性和中和篩選所獲得的兔抗體；c.從兔中收穫B細胞；d.富集收穫的兔B細胞，以製備具有增加頻率的抗原特異性細胞的富集細胞群 體；e.在有利於單個B細胞存活的條件下，培養來自富集細胞群體的一個或多個亞 群，以在至少一個培養孔中產生克隆群體；f.測定克隆群體是否產生對抗原特異的兔抗體；g.分離單個兔B細胞；和h.測序由單個B細胞產生的兔抗體的核酸序列和i.使用這個抗體序列，以便使用本發明的人源化策略衍生具有親本兔抗體的親和 力和任選其他性質的人源化抗體。人源化抗體的方法如所述的，本發明提供了用於人源化兔抗體重鏈和輕鏈的新型和改良方法。本發 明的方法可以如下實現用於人源化兔抗體重鏈和輕鏈 1.鑑定其為信號肽序列後的第一個的胺基酸。這是構架1的開始。信號肽在第 一個起始甲硫氨酸處幵始，並且對於兔輕鏈蛋白質序列長度一般但不一定是22個胺基酸。 成熟多肽的開始也可以通過N末端蛋白質測序進行實驗測定，或可以使用預測算法進行預
40測。這也是構架1開始,如通常由本領域技術人員限定的。實例圖2中的RbtVL胺基酸殘基1，以『AYDM...，開始。2.鑑定構架3的結束。這一般是構架1開始後的86-90個胺基酸，並且一般是2 個酪氨酸殘基後的半胱氨酸殘基。這是構架3的結束，如通常由本領域技術人員限定的。實例圖2中的RbtVL胺基酸殘基88,以『TYYC，結束。3.使用如上限定的從構架1開始起始到構架3結束的多肽的兔輕鏈序列，並且執 行用於最相似的人抗體蛋白質序列的序列同源性搜索。這一般將是在抗體成熟前針對人 種系序列的搜索，以便減少免疫原性的可能性,然而,可以使用任何人序列。一般地,程序 如BLAST可以用於就最同源搜索序列資料庫。人抗體序列的資料庫可以從各種來源例如 NCBI (國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information))發現。實例在圖2中從編號1到88的殘基的RbtVL胺基酸序列是針對人抗體種係數據 庫BLAST的。前3個獨特的返回序列在圖2中顯示為L12A、VI和Vx02o4. 一般地,最同源的人種系可變輕鏈序列隨後用作用於人源化的基礎。然而本領 域技術人員可以決定使用如通過同源性算法測定並非最高同源性的另一個序列，基於其他 因素包括序列缺口和構架相似性。實例在圖2中，L12A是最同源的人種系可變輕鏈序列，並且用作用於RbtVL人源 化的基礎。5.測定關於用於輕鏈人源化的人同系物的構架和CDR排列(FR1、FR2、FR3、CDR1 和CDR2)。這是使用如本領域描述的傳統布局。比對兔可變輕鏈序列與人同系物，同時維持 構架和⑶R區的布局。實例在圖2中，將RbtVL序列與人同源序列L12A比對,並且指出構架和CDR結構 6.用來自兔序列的CDR1和CDR2序列替換人同源輕鏈序列CDR1和CDR2區域。如 果在兔和人CDR序列之間在長度方面存在差異，那麼使用整個兔CDR序列及其長度。如果 執行更小或更大的序列交換,或如果改變一個或多個特定殘基,那麼所得到的人源化抗體 的特異性、親和力和/或免疫原性可能未改變，這是可能的，然而，如所述的交換已成功地實例在圖2中，用來自RbtVL兔抗體輕鏈序列的CDR1和CDR2胺基酸序列替換人 同源可變輕鏈L12A的CDR1和CDR2胺基酸殘基。人L12A構架1、2和3未改變。所得到的 人源化序列在下面顯示為VLh從編號1到88的殘基。應當指出僅不同於L12A人序列的殘 基是有下劃線的，並且因此是兔衍生的胺基酸殘基。在這個實例中，88個殘基中僅8個不同 於人序列。在步驟6中製備新雜交序列的構架3後，附著兔輕鏈抗體序列的整個CDR3。CDR3 序列可以具有各種長度，但長度一般為9-15個胺基酸殘基。常規限定並且可通過本領域技 術人員鑑定CDR3區和隨後構架4區域的開始。一般地,構架4的開始和因此在CDR3結束 後由序列『FGGG... 』組成，然而,某些變化可能存在於這些殘基中。實例在圖2中，在指示為VLh的人源化序列中在構架3結束後添加RbtVL的 CDR3 (編號89-100的胺基酸殘基)。 8.兔輕鏈構架4用最近的人輕鏈構架4同系物替換，通常來自種系序列，所述兔輕鏈構架4 一般是可變輕鏈的最後11個胺基酸殘基,並且如上文步驟7中所示開始且一般以 胺基酸序列『...VVKR』結束。通常，這種人輕鏈構架4具有序列『FGGGTKVEIKR』。可能可 以使用並非最同源或在其他方面不同的其他人輕鏈構架4序列,而不影響所得到的人源化 抗體的特異性、親和力和/或免疫原性。將這種人輕鏈構架4序列加入緊接來自上文步驟 7的CDR3序列的可變輕鏈人源化序列末端。這現在是可變輕鏈人源化胺基酸序列的末端。實例在圖2中，RbtVL兔輕鏈序列的構架4 (FR4)顯示在同源人FR4序列....丨二面。將 人FR4序列加入到在上文步驟7中加入的CDR3區結束後右側的人源化可變輕鏈序列(VLh) 中。^MMmm^A^m1.鑑定其為信號肽序列後的第一個的胺基酸。這是構架1的幵始。信號肽在第一 個起始甲硫氨酸處開始，並且對於兔重鏈蛋白質序列長度一般是19個胺基酸。一般但不一 定地,兔重鏈信號肽的最後3個胺基酸殘基是『...VQC，,隨後為構架1的開始。成熟多肽的 開始也可以通過N末端蛋白質測序進行實驗測定,或可以使用預測算法進行預測。這也是 構架1幵始，如通常由本領域技術人員限定的。實例圖2中的Rb tVII胺基酸殘基1，以『QEQL...，開始。2.鑑定構架3的結束。這一般是構架1開始後的95-100個胺基酸，並且一般是 『..CAR』(儘管丙氨酸也可以是纈氨酸)的最終序列。這是構架3的結束,如通常由本領域 技術人員限定的。實例圖2中的Rb tVH胺基酸殘基98,以『...FCVR，結束。3.使用如上限定的從構架1開始起始到構架3結束的多肽的兔重鏈序列，並且執 行用於最相似的人抗體蛋白質序列的序列同源性搜索。這一般將在抗體成熟前針對人種 系序列的資料庫，以便減少免疫原性的可能性，然而，可以使用任何人序列。一般地，程序 如BLAST可以用於就最同源搜索序列資料庫。人抗體序列的資料庫可以從各種來源例如 NCBI(國家生物技術信息中心)發現。實例在圖2中從編號1到98的殘基的RbtVH胺基酸序列是針對人抗體種係數據 庫BLAST的。前3個獨特的返回序列在圖2中顯示為3-64-04、3-66-04和3-53-02。4. 一般地,最同源的人種系可變重鏈序列隨後用作用於人源化的基礎。然而，本領 域技術人員可以決定使用如通過同源性算法測定並非最高同源性的另一個序列，基於其他 因素包括序列缺口和構架相似性。實例在圖2中，3-64-04是最同源的人種系可變重鏈序列，並且用作用於RbtVH 人源化的基礎。5.測定關於用於重鏈人源化的人同系物的構架和CDR排列(FR1、FR2, FR3, CDR1 和CDR2)。這是使用如本領域描述的傳統布局。比對兔重鏈序列與人同系物，同時維持構架 和⑶R區的布局。實例在圖2中，將RbtVII序列與人同源序列3-64-04比對 ，並且指出構架和CDR 結構域。6.用來自兔序列的CDR1和CDR2序列替換人同源重鏈序列CDR1和CDR2區域。如 果在兔和人CDR序列之間在長度方面存在差異，那麼使用整個兔CDR序列及其長度。此外， 可能必須用兔重鏈構架1的最後3個胺基酸替換人重鏈構架1區域的最後3個胺基酸。一般但不一定,在兔重鏈構架1中，這3個殘基跟在絲氨酸殘基後的甘氨酸殘基之後。此外』 可能必須用兔重鏈構架2的最後胺基酸替換人重鏈構架2區域的最後胺基酸。一般但不一 定，在兔重鏈構架2中,這是在異亮氨酸殘基後的甘氨酸殘基。如果執行更小或更大的序列 交換,或如果改變一個或多個特定殘基，那麼所得到的人源化抗體的特異性、親和力和/或 免疫原性可能未改變,這是可能的,然而,如所述的交換已成功地使用，但不排除可以允許 其他改變的可能性。例如，色氨酸胺基酸殘基一般存在於兔重鏈CDR2區結束前4個殘基處， 而在人重鏈CDR2中，這個殘基一般是絲氨酸殘基。已證實將這個位置處的這個兔色氨酸殘 基改變成人絲氨酸殘基，對人源化抗體的特異性或親和力具有最低影響或無影響，並且因 此使人源化序列中兔序列衍生的胺基酸殘基含量進一步降到最低。實例在圖2中，用來自RbtVH兔抗體輕鏈序列的CDR1和CDR2胺基酸序列替換人 同源可變重鏈的CDR1和CDR2胺基酸殘基，除加方框的殘基外，這在兔序列(位置編號63) 中是色氨酸,並且在人序列中在相同位置處是絲氨酸,並且保持為人絲氨酸殘基。除CDR1 和CDR2改變外,構架1的最後3個胺基酸(位置28-30)以及構架2的最後殘基(位置49) 保留為兔胺基酸殘基而不是人的。所得到的人源化序列在下面顯示為VHh從編號1到98 的殘基。應當指出僅不同於3-64-04人序列的殘基是有下劃線的，並且因此是兔衍生的氨 基酸殘基。在這個實例中,98個殘基中僅15個不同於人序列。7.在步驟6中製備新雜交序列的構架3後，附著兔重鏈抗體序列的整個CDR3。 CDR3序列可以具有各種長度，但長度一般為5-19個胺基酸殘基。常規限定並且可通過本領 域技術人員鑑定CDR3區和隨後構架4區的開始。一般地，構架4的開始和因此在CDR3結 束後由序列WGXG...(其中X通常是Q或P)組成，然而,某些變化可能存在於這些殘基中。實例在指示為VHh的人源化序列中在構架3結束後添加RbtVH的CDR3(編號 99-110的胺基酸殘基)。8.兔重鏈構架4用最近的人重鏈構架4同系物替換，通常來自種系序列，所述兔 重鏈構架4 一般是可變重鏈的最後11個胺基酸殘基，並且如上文步驟7中所示開始且一般 以胺基酸序列『...TVSS』結束。通常,這種人重鏈構架4具有序列『WGQGTLVTVSS』。可能 可以使用並非最同源或在其他方面不同的其他人重鏈構架4序列，而不影響所得到的人源 化抗體的特異性、親和力和/或免疫原性。將這種人重鏈構架4序列加入緊接來自上文步 驟7的CDR3序列後的可變重鏈人源化序列末端。這現在是可變重鏈人源化胺基酸序列的 末端。實例在圖2中，RbtVH兔重鏈序列的構架4 (FR4)顯示在同源人FR4序列....丨二面。將 人FR4序列加入到在上文步驟7中加入的CDR3區結束後右側的人源化可變重鏈序列(VHh)上述人源化方法提供超過現有人源化方法的顯著優點。例如,本發明提供了用於 人源化來自兔抗體序列的抗體序列的方法，其用來自所選擇的同源比對的人抗體序列的人 抗體殘基替換非常大百分比的兔胺基酸殘基。因此，它們在人中較不可能是免疫原性的。此外，本發明方法僅依賴於初級序列的比較，並且不依賴於或需要(i)對供體 或受體抗體序列的三維結構的理解；(ii)就表面與隱蔽殘基而言對殘基的定位的理解； (iii)試驗出在特定或隨機位點處不同形式或變化的不同構架殘基備選物。因此，相對於更 複雜的人源化方法，本發明是高度有效的，無需關於所得到的人源化抗體的所需性質的任何妥協，例如結合親和力和其他功能性質。 此外且與前述有關，相對於親本兔抗體，通過本發明方法產生的所得到的人源化此外,本發明方法不要求另外的「親和力成熟」,以便優化或增強抗原親和力。相比 之下,在大多數其他人源化方法中，在人源化後必須通過實現「親和力成熟」方案的反覆而 顯著增加抗原親和力(以在可用劑量下治療或診斷上有效)，所述方案通過篩選許多隨機 或限定的序列變體，以便鑑定具有增加的結合親和力的變體。因此，本發明比先前人源化方 法更簡單和更有效。再進--步地,本發明的人源化方法是有利的，因為所得到的人源化可變輕鏈和重 鏈序列可以用於產生全長抗體以及人源化抗體片段或包含的融合蛋白。因此，這些人源化 抗體、人源化抗體片段和包含的融合蛋白，例如與治療或診斷劑附著的那些,充分適合於免 疫治療以及體內免疫診斷和免疫預測，例如在腫瘤組織、轉移灶、粥樣硬化斑塊、炎性位點 等的成像中使用。重組產生本發明的人源化抗體及其片段的優選方法本發明還涉及用於產生本文描述的人源化的兔抗體或其片段的優選方法。與本文 描述的抗體或其片段相對應的重組多肽或其片段優選由交配感受態酵母的多倍體、優選二 倍體或四倍體菌株分泌。本發明涉及用於以延長時期產生分泌形式的這些重組多肽的方 法，其中使用包含多倍體酵母的培養物，即至少數天到1周、更優選至少1個月或數個月、並 且更加優選至少6個月到1年或更長。這些多倍體酵母培養物將表達至少10-25mg/升多 肽、更優選至少50-25mg/升、更加優選至少500-lrag/升、並且最優選1克/升或更多 重組多肽。在本發明的一個實施方案中，用包含所需異源多聚蛋白質亞單位的表達載體轉化 一對遺傳標記的酵母單倍體細胞。一種單倍體細胞包含第一個表達載體，並且第二種單倍 體細胞包含第二個表達載體。在另一個實施方案中,用一個或多個表達載體轉化二倍體酵 母細胞，所述表達載體提供由本發明提供的一種或多種重組人源化多肽的表達和分泌。在 另外一個實施方案中，單種單倍體細胞可以用一個或多個載體進行轉化，並且通過融合或 交配策略用於產生多倍體酵母。在另外一個實施方案中，二倍體酵母培養物可以用一個或 多個載體轉化,所述載體提供根據本發明產生的所需人源化的兔重鏈或輕鏈或者抗體多肽 或多肽的表達和分泌。這些載體可以包含染色體外維持的質粒,或可以包含隨機或通過同 源重組整合到酵母細胞的基因組內的載體，例如線性化的質粒。任選地，可以將另外的表達 載體引入單倍體或二倍體細胞內；或第一個或第二個表達載體可以包含另外的編碼序列； 用於合成異源三聚體；異源四聚體；等。非相同多肽的表達水平可以單獨校正，並且通過合 適的選擇、載體拷貝數、啟動子強度和！或誘導等進行調整。轉化的單倍體細胞遺傳上雜交 或融合。所得到的二倍體或四倍體菌株用於產生和分泌完全裝配和生物學功能的蛋白質、 本文描述的人源化抗體或其片段。使用二倍體或四倍體細胞用於蛋白質生產提供了意想不到的優點。可以培養細胞 用於生產目的，即按比例放大,並且用於延長的時間段,在對單倍體細胞的生長有害的條件 下，所述條件 以包括高細胞密度；在最小培養基中生長；在低溫下生長；在不存在選擇壓 力的情況下穩定生長；和隨著時間提供異源基因序列完整性的維持和高水平表達的維持。不希望由此束縛，本發明人建立理論這些優點可能至少部分起於由2種不同的親本單倍 體菌株製備二倍體菌株。此種單倍體菌株可以包含眾多較少的自養突變，所述突變在二倍 體或四倍體中補充，使得能夠在高度選擇性條件下生長。轉化的交配感受態單倍體酵母細胞提供使得所需人源化抗體蛋白質能夠亞單位 配對的一般方法。單倍體酵母菌株用2個表達載體的每--個進行轉化,第一個載體指導一 條多肽鏈的合成，和第二個載體指導第二條、非相同多肽鏈，即人源化的兔重鏈和輕鏈多肽 的合成。使2種單倍體菌株交配，以提供二倍體宿主，在其中可以獲得優化的靶蛋白質(人 源化的兔抗體或人源化的兔抗體片段)產生。任選地,提供一種或多種另外的非相同編碼序列。此種序列可以存在於另外的表 達載體—丨二或在第一個或第二個表達載體中。如本領域已知的，多個編碼序列可以由個別啟 動子獨立表達；或可以通過包括「內核糖體進入位點」或「IRES」協調表達，所述IRES是促 進直接內核糖體進入順反子(蛋白質編碼區)的起始密碼子例如ATG的元件,從而導致基 因的帽不依賴性翻譯。在酵母中起作用的IRES元件由Thompson等人(2001)P. N. A. S. 98 12866-12868 描述。 在本發明的一個實施方案中，抗體序列在與分泌J鏈的組合中產生，所述J鏈提供 增強的IgA穩定性(參見美國專利號5，959，177 ；和5，202，422)。在--個優選實施方案中，2種單倍體酵母菌株各自是營養缺陷的，並且需要補充培 養基用於單倍體細胞生長。營養缺陷型對是互補的，從而使得二倍體產物將在不存在單倍 體細胞所需的補充物的情況下生長。在酵母中的許多此種遺傳標記是已知的，包括對氨基 酸(例如met、lyS、hiS、arg等)、核苷酸(例如ura3、adel等)；等的需求。胺基酸標記對 於本發明的方法可能是優選的。備選地,包含所需載體的二倍體細胞可以通過其他方法進 行選擇，例如通過使用其他可選標記，例如綠色螢光蛋白、各種顯性可選標記等。2種轉化的單倍體細胞可以進行遺傳雜交，並且通過其雜交營養需求選擇由這種 交配事件產生的二倍體菌株。備選地,使2種轉化的單倍體菌株群體形成原生質體且融合， 並且再生且選擇二倍體後代。通過任一方法,可以鑑定並且選擇性培養二倍體菌株，因為， 與其單倍體親本不同，它們不具有相同的營養需求。例如，二倍體細胞可以在最小培養基中 生長。二倍體合成策略具有特定的優點。二倍體菌株具有通過對潛在突變更廣泛的互補作 用產生增強水平的異種蛋白質的潛力，所述突變可能影響重組蛋白質的產生和/或分泌。如上所述,在某些實施方案中，單倍體酵母可以用單種或多種載體進行轉化,並且 與未轉化的細胞交配或融合，以產生包含一種或多種載體的二倍體細胞。在其他實施方案 中，二倍體酵母細胞可以用一種或多種載體轉化,所述載體提供通過二倍體酵母細胞的一 種或多種所需人源化的兔抗體多肽的表達和分泌。在本發明的--個實施方案中，2種單倍體菌株用多肽文庫進行轉化,例如根據本發 明產生的人源化的兔抗體重鏈或輕鏈的文庫。使合成所述多肽的轉化的單倍體細胞與互補 的單倍體細胞交配。將所得到的二倍體細胞就功能蛋白質進行篩選。二倍體細胞提供快速、 方便和廉價地集合大量的多肽組合用於功能測試的方法。這種技術可特別應用於產生異源 二聚蛋白質產物,其中優化的亞單位合成水平對於功能蛋白質表達和分泌是關鍵的。在本發明的另一個實施方案中，調節2個亞單位的表達水平比，以便使產物產生 達到最大。先前已顯示異源二聚體亞單位蛋白質水平影響最終產物產生(Simmons LC，JImmunol Methods. 2002May 1 ；263 (1-2) :133_47)。可以在交配步驟前通過就表達載體上存 在的標記的選擇來實現調節。通過穩定增加載體的拷貝數，可以增加表達水平。在某些情 況下，可能希望增加一條鏈相對於另一條的水平，以便達到多肽亞單位之間的平衡比例。抗 生素抗性標記對於這個目的有用，例如Zeocin抗性標記、G418抗性等，並且通過選擇對高 水平的Zeocin或G418有抗性的轉化體,提供關於在菌株中包含表達載體的多個整合拷貝 的菌株的富集方法。亞單位基因合適的比例，例如1 丨丨2;等對於有效蛋白質產生可 能是重要的。即使當相同啟動子用於轉錄2個亞單位時，許多其他因素促成所表達蛋白質 的最終水平，並且因此，增加一個編碼基因相對於另一個的拷貝數可能是有用的。備選地, 通過使2種單倍體菌株交配製備相對於單拷貝載體菌株產生更高水平的人源化抗體多肽 的二倍體菌株，所述2種單倍體菌株都具有表達載體的多個拷貝。宿主細胞用上述表達載體轉化，交配以形成二倍體菌株，並且在適當修飾的常規 營養培養基中培養,用於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列的基因。適合於酵 母生長的許多最小培養基是本領域已知的。需要時,這些培養基中的任何都可以補充有鹽 (例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩衝劑(例如HEPES、磷酸鉀、磷酸鈉)、核苷(例如腺苷和 胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或等價能源。任何其他必需補充物也可以以合適濃度包 括在內，這將是本領域技術人員已知的。培養條件例如溫度、PH等是先前就表達選擇宿主 細胞使用的那些，並且對於普通技術人員將是顯而易見的。從培養基中回收分泌的蛋白質。蛋白酶抑制劑例如苯甲基磺醯氯化物(PMSF)對 於抑制在純化過程中的蛋白酶解降解可能有用，並且可以包括抗生素以阻止偶發汙染物的 生長。組合物可以使用本領域已知的方法進行濃縮、過濾、透析等。可以培養本發明的二倍體細胞用於生產目的。此種生產目的希望包括在最小培養 基中生長，所述培養基缺乏預先形成的胺基酸和其他複雜生物分子，例如包含氨作為氮源、 和葡萄糖作為能源和碳源、和鹽作為磷酸鹽、鈣等的來源的培養基。優選地，此種生產培養 基缺乏選擇劑，例如抗生素、胺基酸、嘌呤、嘧啶等。二倍體細胞可以培養至高細胞密度,例 如至少約50g/'L ；更通常至少約100g/L ；並且可以是至少約300、約400、約500g/L或更多。在本發明的一個實施方案中，主題細胞用於生產目的的培養在低溫F執行，所述 溫度可以在對數期過程中、在穩定期過程中或兩者中降低。術語「低溫」指至少約15°C、更 通常至少約17°c,並且可以是約2(rc,並且通常不超過約25°C、更通常不超過約22°C。生 長溫度可以影響分泌的全長蛋白質在生產培養物中的產生，並且降低培養生長溫度可以強 烈增強完整產物得率。降低的溫度似乎通過由宿主使用的摺疊和翻譯後加工途徑幫助細胞 內運輸以產生靶產物，連同減少細胞蛋白酶降解。本發明的方法提供分泌的、活性蛋白質,優選哺乳動物蛋白質的表達。在一個實施 方案中，如本文所使用的,分泌的、「活性蛋白質」指至少2條正確配對鏈的正確摺疊的多聚 體，其與其同源抗原正確結合。活性蛋白質的表達水平通常是至少約10_50mg/升培養物、 更通常至少約100mg/升、優選至少約500mg/升，並且可以是lOOOrng/升或更多。本發明的方法可以提供在生產過程中宿主和異源編碼序列增加的穩定性。穩定性 例如通過高水平表達時間的維持得到證明，其中經過約20次倍增、50次倍增、100次倍增或 更多，表達的起始水平減少不超過約20%、通常不超過10%，並且可以減少不超過約5%。菌株穩定性也提供隨著時間異源基因序列完整性的維持,其中經過約20次倍增、50次倍增、100次倍增或更多，活性編碼序列和必要轉錄調節元件的序列在至少約99%的 二倍體細胞中，通常在至少約99. 9 %的二倍體細胞中，並且優選在至少約99. 99 %的二倍 體細胞中得到維持。優選地,基本上所有二倍體細胞維持活性編碼序列和必要轉錄調節元 件的序列。使用本領域普通技術人員眾所周知的相同常規方法產生第二個表達載體,所述表 達載體包含操縱子和編碼抗體輕鏈的DNA序列，其中編碼抗體特異性所需的CDR的DNA序 列衍生自兔B細胞來源，而編碼抗體鏈其餘部分的DNA序列衍生自人細胞來源。表達載體通過本領域普通技術人員眾所周知的常規技術轉染到宿主細胞內以產 生所述抗體多肽，所述轉染的宿主細胞通過本領域普通技術人員眾所周知的常規技術培宿主細胞可以用上文描述的2個表達載體共轉染，第一個表達載體包含編碼操縱 子和人源化的兔輕鏈衍生多肽的DNA,和第二個載體包含編碼操縱子和人源化的兔重鏈衍 生多肽的DNA。2個載體包含不同的可選標記,但優選地實現基本上相等的重鏈和輕鏈多肽 的表達。備選地，可以使用單個載體，該載體包括編碼人源化的兔重鏈和輕鏈多肽的DNA。2種轉化的單倍體細胞可以進行遺傳雜交,並且通過其雜交體營養需求和/或抗 生素抗性譜選擇這種交配事件產生的二倍體菌株。備選地,使2種轉化的單倍體菌株群體 形成原生質體且融合，以及再生且選擇二倍體後代。通過任--方法,基於其在與其親本不同 的培養基中生長的能力，可以鑑定並且選擇性培養二倍體菌株。例如，二倍體細胞可以在包 括抗生素的最小培養基中進行培養。二倍體合成策略具有特定的優點。二倍體菌株具有通 過對潛在突變更廣泛的互補作用產生增強水平的異種蛋白質的潛力,所述突變可能影響重 組蛋白質的產生和/或分泌。此外,一旦已獲得穩定菌株,任何抗生素就用於選擇不一定需 要連續存在於生長培養基中的那些菌株。用於表達抗體多肽的宿主細胞可以是細菌細胞例如大腸桿菌、或真核細胞。在本 發明的一個特別優選的實施方案中，可以使用就此目的的明確定義類型的哺乳動物細胞, 例如骨髓瘤細胞或中國倉鼠卵巢(CH0)細胞系。通過其可以構建載體的一般方法，產生宿主細胞所需的轉染方法和由所述宿主細 胞產生抗體多肽所需的培養方法都包括常規技術。儘管優選地用於產生抗體的細胞系是哺 乳動物細胞系,但備選地可以使用任何其他合適的細胞系，例如細菌細胞系例如大腸桿菌 衍生的細菌菌株、或酵母細胞系。相似地，一旦產生，人源化的兔抗體多肽就可以根據本領域的標準操作進行純化， 例如交叉流過濾、硫酸銨沉澱法、親和柱層析法等。本文描述的人源化抗體多肽也可以用於設計和合成對於與本發明的抗體多 肽相同的治療應用有用的肽或非肽模擬物。參見例如，Saragobi等人，Science, 253 792-795(1991)，其內容通過引用整體合併入本文。施用根據本發明產生的人源化的兔抗體和片段和包含的融合物優選用於人治療或用 於診斷方法,例如腫瘤位點的體內成像。在本發明的--個實施方案中,本文描述的人源化抗 體、或其人源化結合片段、以及所述抗體片段的組合，以約0. 05-10. Omg/kg接受受試者體 重的濃度施用於受試者。在本發明的一個優選實施方案中,本文描述的人源化抗體、或其人
47源化結合片段、以及所述抗體片段的組合，以約0. 1-1. Omg/kg接受受試者體重的濃度施用 於受試者。在本發明的另一個實施方案中,本文描述的人源化的兔抗體、或其結合片段、以及 所述抗體片段的組合，在藥物製劑中施用於受試者。「藥物組合物」指適合於對哺乳動物施用的化學或生物組合物。此種組合物可 以經特別配製用於經由許多途徑中的一種或多種施用，所述途徑包括但不限於頰、表皮 (epicutaneous)、硬膜外、吸入、動脈內、心內、腦室內、真皮內、肌內、鼻內、眼內、腹膜內、脊 柱內、鞘內、靜脈內、經口、腸胃外、經由灌腸劑或栓劑經直腸、皮下、真皮下、舌下、透皮和經 黏膜。此外,施用可以藉助於注射、粉劑、液體、凝膠劑、滴劑或其他施用方法發生。「藥物賦形劑，，或「藥學上可接受的賦形劑」是在其中配製活性治療劑的載體，通 常為液體。在本發明的一個實施方案中，活性治療劑是對IL-6或TNF-a特異的人源化抗 體，或其一個或多個片段。賦形劑通常對製劑不提供任何藥理學活性，儘管它可以提供化學 和/'或生物學穩定性、和釋放特徵。示例性製劑可以例如在Remington' sPharmaceutical Sciences，第19版，Grennaro, A.，編輯，1995中發現，所述參考文獻通過引用合併。如本文所使用的，「藥學上可接受的載體」或「賦形劑」包括生理學相容的任何和所 有溶劑、分散介質、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑。在一個實施方案中，載體適 合於腸胃外施用。備選地,載體可以適合於靜脈內、腹膜內、肌內或皮下施用。藥學上可接 受的載體包括無菌水溶液或分散系和用於臨時製備無菌可注射溶液或分散系的無菌粉劑。 此種介質和試劑用於藥學活性物質的用途是本領域眾所周知的。除非任何常規介質或試劑 與活性化合物不相容,包括其在本發明的藥物組合物中的使用。補充性活性化合物也可以 摻入組合物內。藥物組合物一般在製造和貯存條件下必須是無菌和穩定的。組合物可以配製為溶 液、微乳劑、脂質體、或適合於高藥物濃度的其他有序結構。載體可以是包含例如水、乙醇、 多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)及其適當混合物的溶劑或分散介質。 合適的流動性可以如下得到維持例如通過使用包衣例如卵磷脂，在分散系的情況下通過 維持所需顆粒大小，和通過使用表面活性劑。在許多情況下，在組合物中將優選包括等滲劑，例如，糖，多元醇例如甘露醇、山梨 糖醇,或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可以通過在組合物中包括延遲吸收的試劑來達 到,所述試劑例如單硬脂酸鹽和明膠。此外,在時間釋放製劑中，例如在包括緩慢釋放聚合 物的組合物中，可以配製鹼性多肽。活性化合物可以用保護化合物不快速釋放的載體製備， 例如控制釋放製劑，包括埋植劑和微囊遞送系統。可以使用生物可降解、生物相容的聚合 物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚 物(PLG)。用於製備此種製劑的許多方法是本領域技術人員已知的。對於每個所述實施方案，化合物可以通過各種劑型施用。包括本領域普通技術人 員已知的任何生物學可接受的劑型及其組合。此種劑型的例子包括但不限於，可重構粉 劑、酏劑、液體、溶液、懸浮液、？L劑、粉劑、粒劑、顆粒、微粒、分散粒劑、扁囊劑、吸入劑、氣溶 膠吸入劑、貼劑、粒子吸入劑、埋植劑、沉澱埋植劑、注射劑(包括皮下、肌內、靜脈內和真皮 內)、浸劑及其組合。
0361]本發明各種舉例說明的實施方案的上述描述不意欲是詳盡的或使本發明限制於目的描述, 一文提供的
文教
公開的精確形式。儘管本發明的具體實施方案〗
但在本發明範圍內的各種等價修飾是可能的，如相關領域技術人員將認識到 本發明教導可以應用於其他目的，除上文描述的例子外。根據上文詳述可以對本發明進行這些和其他改變。一般而言,在下述權利要求中， 使用的術語不應解釋為將本發明限制於說明書中公開的具體實施方案和權利要求。因此, 本發明不受公開內容限制的，相反，本發明的範圍完全由下述權利要求決定。本發明可以以除前述說明書和例子中特別描述的那些外的方式進行實施。根據上 爭,本發明的眾多修飾和變化是可能的,並且因此在所附權利要求的範圍內。 I與用於獲得抗原特異性B細胞的克隆群體的方法相關的特定教導公開於2006年5 曰提交的美國臨時專利申請號60/801，412中，所述美國臨時專利申請號的公開內容
i整體合併入本文。
與使用交配感受態酵母產生抗體或其片段相關的特定教導和相對應方法 公開於2006年5月8日提交的美國專利申請號11/429,053(美國專利申請公開號 US2006/0270045)中，所述美國專利申請號的公幵內容通過引用整體合併入本文。在發明背景、詳述和實施例中引用的每個文件(包括專利、專利申請、期刊論文、 摘要、手冊、書本或其他公開內容)的完整公開內容通過引用整體合併入本文。提出下述實施例，以便為本領域普通技術人員提供如何製備和使用本發明的完整 公幵內容和描述，並且不意欲限制視為本發明的範圍。已進行努力以確保就使用的數字 (例如量、溫度、濃度等)而言的精確度，但應允許某些實驗誤差和偏差。除非另有說明，份 是重量份,分子量是平均分子量,溫度是攝氏度
應答。--般地,用於免疫接種的宿主是兔或其他宿主，其使用相似的成熟過程產生抗體，並 且提供產生可比較多樣性，例如表位多樣性的抗體的抗原特異性B細胞群體。起始抗原免 疫接種可以使用完全弗氏佐劑(CFA)進行，並且用不完全佐劑實現後續加強。在免疫接種 後約50-60天時,優選在第55天時,測試抗體滴度,並且如果確定合適滴度，那麼起始抗體 選擇(ABS)過程。關於ABS起始的2個關鍵標準是在多克隆血清中的有效抗原識別和功能 修飾活性。在確定陽性抗體滴度時，處死動物且分離B細胞來源。這些來源包括脾、淋巴結、 骨髓和外周血單核細胞(PBMC)。產生單細胞懸浮液,並且洗滌細胞懸浮液，以使得它們適應 低溫長期貯存。細胞隨後一般進行冷凍。為了起始抗體鑑定過程，使小部分冷凍細胞懸浮液解凍、洗滌、且在組織培養基中 鋪平板。隨後使這些懸浮液與用於產生動物免疫應答的生物素化形式的抗原混合，並且使 用Miltenyi磁珠細胞選擇方法回收抗原特異性細胞。使用鏈黴親和素珠進行特異性富集。 回收富集群體並且進展至特異性B細胞分離的下一個階段中。實施例2 包含克隆、抗原特異性B細胞的培養物的產生將根據實施例1產生的富集B細胞隨後在各種細胞密度下鋪平板在96孔微定板的每個孔中。一般地，這是50、100、250或500個細胞/孔,具有10塊平板/組。培 養基補充有4%活化的兔T細胞條件培養基，連同50K冷凍的被照射EL4B飼養細胞。這些 培養物不受擾亂51天,在這時收集包含分泌抗體的上清液,並且在分開的測定設置中就 靶性質進行評估。使其餘上清液保持完整,並且將平板冷凍在 7(rc。在這些條件下,培養 過程--般產生包含混合細胞群體的孔,所述混合細胞群體包含抗原特異性B細胞的克隆群 體，即單個孔將僅包含對所需抗原特異的單個單克隆抗體。實施例3 :抗體上清液就所需特異性和/或功能性質的單克隆抗體的篩選衍生自包含根據實施例2產生的克隆抗原特異性B細胞群體的孔的含抗體上清液 最初就抗原識別，使用ELISA方法進行篩選。這包括選擇性抗原固定(例如,通過鏈黴親和 素包被的平板進行生物素化抗原捕獲)，非特異性抗原平板包被，或備選地，通過抗原疊加 策略(例如，選擇性抗原捕獲後通過結合伴侶添加，以產生異聚蛋白質-抗原複合物)。抗 原陽性孔上清液隨後任選在嚴格依賴於配體的功能修飾測定法中進行測試。一個此種例子 是體外蛋白質_蛋白質相互作用測定法,其再現抗原配體與重組受體蛋白質的天然相互作 用。備選地，利用配體依賴性且容易監控的基於細胞的應答(例如，增殖應答)。顯示顯著 抗原識別和效價的上清液視為陽性孔。衍生自最初陽性孔的細胞隨後過渡到抗體回收階實施例4 所需抗原特異性的單個、抗體生成B細胞的回收從包含抗原特異性B細胞的克隆群體(根據實施例2或3產生)的孔中分離少 數細胞，其分泌單個抗體序列。對分離的細胞隨後進行測定，以分離單個、抗體分泌細胞。 Dyna!鏈黴親和素珠在緩衝介質下用生物素化的靶抗原包被，以製備與細胞存活力相容 的含抗原微珠。接下來,使抗原裝載的珠、來自陽性孔的抗體生成細胞和異硫氰酸螢光素 (FITC)標記的抗宿主H&L IgG抗體(如指出的，宿主可以是任何哺乳動物宿主，例如兔、小 鼠、大鼠等)一起在37°C下溫育。將這個混合物隨後以等分試樣再次吸取到載玻片上，從而 使得每個等分試樣平均具有單個、抗體生成B細胞。隨後通過螢光顯微鏡檢查檢測抗原特 異性、抗體分泌細胞。由於結合抗原，分泌抗體局部集中於鄰近珠上，並且基於強螢光信號 提供定位信息。經由對分泌細胞鄰近的所形成抗體-抗原複合物的FITC檢測鑑定抗體分泌 細胞。隨後使用顯微操作器回收在這種複合物中心處發現的單個細胞。將細胞在eppendorf PGR管中速凍用於在 80°C下貯存,直至起始抗體序列回收。實施例5 從抗原特異性B細胞中分離抗體序列使用基於組合RT-PCR的方法，從根據實施例4產生的單個分離的B細胞中，或從 根據實施例2獲得的克隆B細胞群體中分離的抗原特異性B細胞中回收抗體序列。設計引 物以在靶免疫球蛋白基因(重和輕)，例如兔免疫球蛋白序列的保守和恆定區中退火，和使 用2步巢式PCR回收步驟以獲得抗體序列。對來自每個孔的擴增子就回收和大小完整性進 行分析。隨後用Alul消化所得到的片段，以採集序列克隆性的指紋。相同序列在其電泳分 析中顯示共同斷裂模式。明顯地，一般甚至在最初鋪平板至1000個細胞/孔的孔中觀察到 證明細胞克隆性的這個共同斷裂模式。最初的重鏈和輕鏈擴增子片段隨後用Hindlll和 Xhol或Hindlll和BsiwI進行限制性酶消化，以製備各自DNA的碎片用於克隆。所得到的 消化物隨後連接到表達載體內，並且轉化到細菌內用於質粒繁殖和產生。選擇菌落用於序 列表徵。
實施例6 所需抗原特異性和/或功能性質的單克隆抗體的重組產生確定包含單個單克隆抗體的每個孔的正確全長抗體序列，並且使用Qiagen固相 方法製備小量製備DNA。這種DNA隨後用於轉染哺乳動物細胞，以產生重組全長抗體。對粗 抗體產物就抗原識別和功能性質進行測試，以證實在重組抗體蛋白質中發現的最初特徵。 合適時，完成大規模瞬時哺乳動物轉染,並且通過蛋白質A親和層析法純化抗體。使用標準 方法(例如Biacore)評估Kd，以及在效價測定法中評估IC50。實施例7 結合所需抗原例如HuTNF a或IL 6的抗體的製備通過使用本文描述的抗體選擇方案，可以產生顯示TNF-a或對於IL-6或另一 種所需抗原的有效功能拮抗的抗體集合。抗體闡明多種表位，並且因此可以提供關於抗 體的有用備選物或抗體的有用輔助，所述抗體靶向先前鑑定關於特定抗原的表位，例如在 HuTNF-a、tnf-a表位的情況下，例如Remieade (英夫利昔單抗)。在IL-6或TNF- a的特定情況下，可以採用篩選方法以鑑定結合備選IL-6或 TNF-a表位，同時保留顯著的功能拮抗的抗體。例如,在TNF-a的情況下,在初次抗原識 別篩選後，對陽性BCC孔可以就針對TNF-a的功能拮抗以及表位競爭進行測試，例如與英 夫利昔單抗競爭。獨特的表位識別可以通過ForteBio Octet抗體-TNF-a結合競爭研究 來確定。追蹤顯示功能活性以及缺乏競爭的BCC孔,並且回收在這些孔中存在的抗體的編 碼序列。大多數回收序列將顯示最初靶特徵有效抗原識別、功能拮抗和不同的表位識別。 因此，所得到的抗體集合確立了與有效功能拮抗相關的多個新型表位區域。在通過引用合 併入本文的臨時申請中用IL 6證實了相似結果。免疫接種策略:使用TNF- a _#210-TA)和人IL-6免疫接種兔，如2007年5月21日提交且通 過引用整體合併入本文的臨時專利申請美國序列號60/924，551和60/924, 551中描述的。抗體選ff丨商Iti平估抗原識別測定法可以通過其中描述的方案對於TNF- a或人IL-6進行測定。功能滴度評估可以如引用的臨時申請中所述的測定樣品的功能活性。例如，在分別地tnf-a的 情況下，在圓底96孔板中,加入以1 100稀釋(在所述培養基中)的血清樣品，隨後為跨 越平板的1 10稀釋(列2-10,列11僅是用於TNF-a對照的培養基)，50 11 :[/孔,5次重 復(行B-F,行G僅是用於本底對照的培養基)。將50 u 1/孔包含以最終EC50的4倍濃度 的TNF- a的培養基(濃度先前對於每個批次進行測定)和1 U g/ml放線菌素D加入所有 樣品孔中，除行F外。使平板在37°C下溫育1小時。 在1小時,將50 11 1血清/kg複合物和對照轉移至包含50 11 1/孔以固定密度(終 體積100 u 1/孔)應答細胞的96孔平底平板,並且在37°C下溫育24小時。(使列1和12 以及行A和H充滿200 u 1培養基，以防止蒸發及造成邊緣效應。)在24小時，根據製造商方案，將20 u 1/孔CellTiter96試劑(Promega)加入所有 測試孔，並且使平板在37°C下溫育2小時。2小時後,使平板輕輕振蕩以允許測試孔中的均 勻。在490nm波長處對平板進行讀數。使用Graph Pad Prizm(使用非線性S形劑量/應 答曲線)繪製0D與稀釋度的比較，並且測定功能滴度。組織收穫
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如上文引用的臨時申請中所述收穫兔脾、淋巴結和全血，加工且冷凍。B mmmm (BCC)如通過引用合併的臨時專利申請中所述製備B細胞培養物。 抗原識別篩選急匕活.ft難如引用的臨時申請中所述執行功能活性篩選。例如，在TNF-a的情況下，通過 WEH:[細胞毒性測定法對其進行測定。對來自一塊或多塊主平板的上清液在TNF-a剌激的 WEHI細胞毒性測定法(如上文所述)中作為單個點進行測試。與其中所述相同整潔的測試 上清液。對乾重體的次級功能活件測丨定法誦1寸用huTNF-a孫理的HUVEC細朐陽.斷 丨丄-6表汰TNF-a或IL-6特定測定法可以如通過引用合併如本文的相同臨時專利申請中所 述來實現。例如，在TNF-a的情況下，將人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)常規維持在內皮生長 培養基(EGM)培養基和合適的HUVEC補充物(Cambrex)中。在測定當天，通過臺盼藍測定 HUVEC存活力。將細胞以5E05/ml重懸浮於合適體積的測試所需的培養基中(100 u !/孔)。 使細胞鋪平板在96孔平底培養平板的中間孔中，並且將200 u 1培養基加入所有外部孔中， 以防止蒸發。使平板在37tTF溫育24小時。在24小時，在EGM中以4倍所需終濃度製備合適抗體稀釋物。(起始抗體濃度為 1 U g/ral ；跨越平板執行1 3稀釋，除最後1行外。)將相同體積的在EGM中的rhuTNF- a (4 倍所需終濃度)加入孔中。使平板在37°C下溫育1小時，以形成抗體/抗原複合物。在1 小時，取出來自HUVEC培養平板的50 11 1培養基並棄去。加入50 11 1 Ab-Ag混合物，並且使 平板在37°C下溫育48小時。包括標準陽性和陰性對照在48小時,通過ELISA評估條件培養基丨丄-6水平。用1 u g/ml羊抗人huIL-6以 50u 1/孔包被Immulon平板,在4°C下過夜,或在室溫下1小時。將平板在PBS+0. 5% Tween 20中在平板洗滌器(200 11 1/孔；3次)中進行洗滌。用200 u 1/孔FSG在室溫下封閉平板 1小時。抽吸封閉溶液,並印跡平板。設定huIL-6標準，以lyg/ml開始並跨越平板1 3 稀釋(所有稀釋在FSG中進行)。將來自HUVEC培養的樣品加入在標準曲線下的孔中，並且 在室溫下溫育1小時。重複洗滌。將1 U g/ml人源化抗體(抗huIL-6)以50 u 1/孔加入 平板中，並且在室溫下溫育1小時。重複洗滌。將以1 5000稀釋的次級抗人IgG Fc HRP 以50 yl/孔加入，並且在室溫下溫育45分鐘。重複洗滌。測定用SOiil/孔3，3' ,5,5' 四乙基聯苯胺(TMB)顯色最少5分鐘。用50 u 1/孔HC1終止反應,並且平板在450膽處在 平板閱讀器中進行讀數。使用Graph Pad Prizm分析數據。B細胞回收如上文引用的臨時中請中所述執行關於huIL-6和huTNF- a的病灶方案。實施例8 根據本發明的示例性人源化兔抗體(對IL-6特異)的製備使用本文描述和圖1中示意性描繪的人源化策略人源化衍生自兔抗huIL-6抗體 的重鏈和輕鏈，所述重鏈和輕鏈如通過引用合併的臨時專利申請中所述且根據前述實施例 產生。使用BLAST針對人種系序列文庫篩選示例性兔抗IL 6抗體的可變輕鏈區(包含這種IL-6特異性抗體的FR1到FR3結束的區域),並且鑑定相對於這個文庫中的其他人種系 序列，與其具有顯著同源性的3個種系序列，即Vl-6、Vl-27和V1-5。發現種系序列V1-6顯 示與兔輕鏈可變序列最大的序列同一性，並且因此選擇作為原材料以產生2種人源化輕鏈 形式,在圖3中指定為「aggres」和「consrv」。基本上通過用如該圖頂部中所示的來自兔親 本抗IL-6CDR1和CDR2區域的特定選擇性決定殘基修飾V1-6人種系序列，並通過進一步摻 入少數(consrv形式)或無供體(兔)FR殘基(aggres形式)，衍生這些序列。特別地，如 圖3中所示，產生1條人源化輕鏈(在該圖中稱為「aggres」)，其中不摻入兔FR殘基，並且 通過融合對於兔輕鏈CDR3的VI-6序列和與兔輕鏈FR4序列同源的人FR4序列。產生在相 同圖中描述的稱為「 consrv"的另一個形式,其包含來自兔輕鏈FR1的2個FR殘基。
使用相似的人源化方法和如圖1中示意性描繪的，將包含CDR1和CDR2以及相關 FR區域的優選抗IL-6抗體的可變區用於使用BLAST方法針對人種系序列文庫進行篩選， 以便鑑定與其最同源的人種系序列。如該圖中所示,這個篩選鑑定了包含圖2中的序列的 3個同源的人種系序列V3-66、V3-53和V3-23。最同源的人種系序列V3-23再次用作原材 料，以產生通過摻入重鏈的CDR1和CDR2區域的特定選擇性決定殘基相似地修飾的2種人 源化形式，有利於相對應人CDR1和CDR2殘基，進一步摻入少數不連續的兔FR殘基且與兔 CDR3區域並融合同源人FR4區域。如圖3底部中所示,所得到的2種人源化重鏈再次被稱 為「aggres」和「consrv，，。基於比對序列,可以看出這些人源化形式僅在"consrv"形式中 存在幾個兔FR3殘基的方面不同，所述殘基在「aggres」中不存在。與人種系序列比較，這 2種序列僅在相對少數的殘基處改變,並且因此在人中應是基本上無免疫原性的。 發現包含「aggres」人源化重鏈和輕鏈以及"consrv"的人源化抗IL-6抗體具有 與親本兔抗體非常近似的IL-6結合親和力。這驗證了本發明的人源化策略的功效,並且進實施例9 根據本發明產生的示例性人源化兔抗體(對h IL-6和hTNF- a特異)的 保留親和力性質如下文討論的，本發明的顯著優點是主題人源化方法可重現地產生具有高親和力 的人源化抗體，即結合親和力與親本兔或由其衍生的嵌合抗體的結合親和力相當。這通過 圖4中包含的解離常數舉例說明。在其中，2種不同兔嵌合抗hIL 6抗體的解離常數與由其 衍生的3和2種不同人源化抗體分別比較,所述人源化抗體都使用本發明方法產生。根據 該圖中包含的數據，可以看出從由其衍生的嵌合到人源化變體，解離常數在大多數情況下 大致未改變。在最壞的情況下，解離常數減少約3. 5倍。這與一般導致抗原結合親和力基 本喪失的其他人源化方法形成對比，即相對於人源化形式,與親本相差1個數量級或更多。此外,相同的圖4包含使2種不同嵌合兔抗hTNF-a抗體與使用本發明的人源化 方法由其衍生的人源化抗體的解離常數比較的數據。相似地，親本兔衍生的嵌合抗hTNF- a 抗體和人源化抗體的解離常數基本上相同。這些結果舉例說明主題人源化方法的重現性， 即它們用於人源化不同兔抗體序列和用於人源化對不同抗原特異的抗體的廣泛應用性。實施例10 根據本發明產生的示例性人源化兔抗體(對hIL-6和hTNF- a特異) 的保留功能性質兔抗體相當的抗原結合常數。基於此,預測親本嵌合抗體和由其衍生的人源化變體的拮抗 性質將同樣是相當的。事實上，這些本發明人的預測已得到證實。如圖5和6中所示，本發明人使衍生自兔抗IL 6抗體的2種不同嵌合抗體分別與 衍生自每種的2種不同人源化抗體的拮抗性質比較。在檢測這些抗hIL-6抗體對h:[L 6依 賴性細胞增殖的作用的測定法——用於檢測拮抗活性的公認功能測定法中比較拮抗。從圖 5和6中的數據可以看出，對於由其衍生的嵌合和人源化抗體，對hIL-6依賴性細胞增殖的 抑制基本上相同。(細胞增殖數據曲線在不同抗體濃度下基本上重疊或非常相似。)此外，如圖7中所示,本發明人使衍生自兔抗hTNF-a抗體的對hTNF-a特異的嵌 合抗體與由其衍生的人源化抗體的拮抗性質比較，所述人源化抗體使用主題人源化方法產 生。在檢測這些抗hTNF-a抗體對hTNF-a依賴性細胞毒性的作用的測定法——用於檢測 抗hTNF-a抗體拮抗活性的公認功能測定法中比較拮抗。從圖7中的數據可以看出，對於 由其衍生的嵌合和人源化抗hTNF-a抗體,hTNF-a依賴性細胞毒性的抑制非常相似。(細 胞毒性數據曲線在不同抗體濃度下基本上重疊或非常相似。)這些實施例意欲是本發明及其固有優點的示例。事實上，本發明的人源化方法可 以用於人源化對任何所需抗原具有特異性的任何兔抗體(或緊密相關物種的抗體)。優選 地,這些抗體將對適合於人治療的靶抗原特異，並且對於該靶抗原具有高親和力。例如,此 種抗體可以特別包括2008年5月21日提交的美國序列號60/924，550和60/924, 551以及 PCT申請中公幵的任何兔抗體重鏈和輕鏈序列，所述臨時和PCT申請分別具有代理人案號 67858. 901902 和 67858. 701802,名稱為 IL-6Antibodies and Use Thereof and Anti-TNF Antibodies，所述臨時和PCT申請包括其中報告的所有抗體序列通過引用整體合併入本 文。此外，為了進一步描述和示例請求保護的人源化方法和由此可獲得的人源化抗體產物， 關於這2個PCT申請的序列表在本文權利要求前。這些序列表包含本發明方法產生的對 IL-6和TNF-a特異的兔抗體序列和根據人源化形式。此外,本發明的人源化方案可以用於人源化任何可獲得的兔重鏈或輕鏈序列，即 針對任何所需抗原,例如肽、蛋白質、糖蛋白、半抗原、碳水化合物等。優選地,抗原是人抗原 或來自感染或引起或涉及人中的疾病的試劑的抗原。優選地，兔抗體將衍生自通過前述ABC 篩選方案分離的兔B細胞。
權利要求
包含至少一個重鏈和輕鏈多肽的人源化抗體或抗體片段，其中所述輕鏈多肽是人源化輕鏈多肽，其包含至少下述(i)跨越FR1的第一個殘基到FR3的末端的胺基酸殘基，包括選擇自人種系序列文庫的人輕鏈種系序列的CDR1和CDR2區域，所述選擇基於其跨越FR1到FR3的所選擇的胺基酸殘基(相對於文庫中的其他人輕鏈序列)與待人源化的對所需抗原具有特異性的親本兔抗體輕鏈的相對應胺基酸殘基的更大同源性(序列同一性百分比)；和(ii)進一步其中相對應相同親本兔抗體的輕鏈中的「選擇性決定殘基」在CDR1和CDR2中的CDR殘基用相對應兔選擇性決定殘基替換；(iii)包含相同親本兔抗體的整個CDR3區域的胺基酸殘基；(iv)基於其與相同親本兔抗體的輕鏈中包含的相對應FR4區域的更大同源性(序列同一性)，包含衍生自人種系序列文庫的抗體輕鏈的整個FR4區域的胺基酸殘基；和(v)其中所選擇的同源人FR區域中的人FR1、FR2、FR 3和FR4區域的少數或無FR殘基用相對應兔FR殘基替代。
2.權利要求1的人源化抗體,其中所述親本兔抗體對人、病毒或細菌抗原特異。
3.權利要求2的人源化抗體,其中所述人抗原是細胞因子、生長因子、激素或癌抗原。
4.權利要求1的人源化抗體,其對IL-6、海帕西啶、肝細胞生長因子或TNF多肽特異。
5.核酸序列，其編碼權利要求1、2、3或4任一項中所述的人源化抗體中包含的人源化 抗體輕鏈。
6.載體,其包含根據權利要求5的核酸序列。
7.細胞,其包含根據權利要求6的載體。
8.權利要求7的細胞，其選自酵母、細菌和哺乳動物細胞。
9.權利要求8的細胞，其是二倍體酵母細胞。
10.權利要求9的細胞，其是畢赤酵母屬或其他甲醇利用二倍體酵母。
11.包含至少一個重鏈和輕鏈多肽的人源化抗體或抗體片段，其中所述重鏈多肽是人 源化重鏈多肽，其包含至少下述(i)跨越FR1的第一個殘基到FR3的末端的胺基酸殘基， 包括由選擇自人種系序列文庫的人種系序列編碼的CDR1和CDR2區域，所述選擇基於其跨 越FR1到FR3的所選擇的胺基酸殘基(相對於文庫中的其他人種系序列)與待人源化的對 所需抗原具有特異性的親本兔抗體重鏈的相對應胺基酸殘基的更大同源性(序列同-一注 百分比)；和(ii)進一步其中對應於相同親本兔抗體的重鏈的CDR1和CDR2區域中的「選 擇性決定殘基」在人重鏈的CDR1和CDR2區域中的CDR殘基用兔重鏈的CDR1和CDR2區域 中包含的相對應重鏈選擇性決定殘基替換；(iii)包含相同親本兔抗體的整個CDR3區域的 胺基酸殘基；(iv)基於其與相同親本兔抗體的重鏈中包含的相對應FR4區域的更大同源性 (序列同一性)，衍生自人種系序列文庫的FR4區域；和(v)其中人重FR1區域的最後1-3個 胺基酸任選用相對應兔重鏈FR1殘基的末端1-3個胺基酸替換；和/或人重鏈構架2區域 的末端胺基酸任選用兔重鏈構架2的相對應末端胺基酸殘基替換；和/或來自兔重鏈CDR2 的末端的第4個胺基酸(一般是色氨酸)任選用相對應人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替 換；和(vi)其中所選擇的同源人FR區域的少數或無其餘FR殘基用相對應兔FR殘基替代。
12.權利要求11的人源化抗體，其中所述親本兔抗體對人、病毒或細菌抗原特異。
13.權利要求12的人源化抗體,其中所述人抗原是細胞因子、生長因子、激素或癌抗
14.權利要求11的人源化抗體，其對IL-6、海帕西啶、肝細胞生長因子或TNF多肽特
15.核酸序列，其編碼權利要求11、12、13或14任一項中所述的人源化抗體中包含的人 源化抗體重鏈。
16.載體,其包含根據權利要求15的核酸序列。
17.細胞,其包含根據權利要求16的載體。
18.權利要求17的細胞，其選自酵母、細菌和哺乳動物細胞。
19.權利要求18的細胞,其是二倍體酵母細胞。
20.權利要求19的細胞,其是畢赤酵母屬或其他甲醇利用二倍體酵母。
21.權利要求1的人源化抗體,其包含至少一個人源化輕鏈多肽且進--步包含至少一 個重鏈多肽，其中所述至少一個重鏈是人源化重鏈多肽，其包含至少下述(i)跨越FR1的 第一個殘基到FR3的末端的胺基酸殘基,包括由選擇自人種系序列文庫的人種系序列編碼 的CDR1和CDR2區域,所述選擇基於其跨越FR1到FR3的所選擇的胺基酸殘基(相對於文 庫中的其他人種系序列)與待人源化的對所需抗原具有特異性的親本兔抗體重鏈的相對 應胺基酸殘基的更大同源性(序列同一性百分比)；和(ii)進一步其中對應於相同親本兔 抗體的重鏈的CDR1和CDR2區域中的「選擇性決定殘基」在人重鏈的CDR1和CDR2區域中的 ⑶R殘基用兔重鏈的CDR1和⑶R2區域中包含的相對應重鏈選擇性決定殘基替換；(iii)包 含相同親本兔抗體的整個CDR3區的胺基酸殘基；(iv)基於其與相同親本兔抗體的重鏈中 包含的相對應FR4區域的更大同源性(序列同一性)，衍生自人種系序列文庫的FR4區域； 和Cv)其中人重FR1區域的最後1-3個胺基酸任選用相對應兔重鏈FR1殘基的末端1-3個 胺基酸替換；和/或人重鏈構架2區域的末端胺基酸任選用兔重鏈構架2的相對應末端氨 基酸殘基替換；和！或來自兔重鏈CDR2的末端的第4個胺基酸(一般是色氨酸)任選用相 對應人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替換；和(vi)其中所選擇的同源人FR區域的少數或無
22.權利要求21的人源化抗體,其對IL-6、海帕西啶、肝細胞生長因子或TNF多肽特
23.用於產生人源化輕鏈抗體序列的人源化策略，其包括F述步驟(i)從與所需抗原特異性結合的兔抗體獲得編碼兔輕鏈抗體序列的DNA，並且鑑定跨 越所包括的構架1(FR1)開始到構架3(PR3)結束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結束序列的所述兔輕鏈抗體胺基酸序列進行針對包含人 輕鏈抗體可變序列的文庫的同源性搜索，並且鑑定相對於其他人輕鏈抗體可變序列，對其 顯示基本序列同源性的人輕鏈抗體序列；(iii)在兔和人輕鏈序列中鑑定對應於FRl、FR2、F:R3、a)Rl、CDR2區域的排列及其特定 殘基,並且比對在兔和所選擇的人抗體輕鏈中的這些不連續區域；(iv)構建DNA或胺基酸序列，其中所選擇的同源人輕鏈序列的CDR1和CDR2區域用兔 輕鏈序列的CDR1和CDR2區域中包含的相對應選擇性決定殘基替代；(v)將編碼或包含兔CDR3輕鏈抗體序列的相對應胺基酸殘基的DNA序列或多肽進一步 附著至通過步驟(iv)獲得的DNA或胺基酸序列；(vi)進一步選擇與兔輕鏈中包含的FR4同源且優選與其相差至多2-4個胺基酸殘基的 人輕鏈構架4區域(FR4)，並且使編碼所述人FR4的DNA序列或所述人FR4的相對應氨基殘基附著至在步驟(v)後獲得的DNA或胺基酸序列上；和(vii)合成編碼或包含步驟⑴到(vi)中得到的人源化的兔輕鏈序列的DNA或胺基酸 序列。
24.權利要求23的人源化策略，其中所述起始FR1的胺基酸是在所述兔輕鏈信號序列 後的第一個胺基酸。
25.權利要求23的人源化策略，其中所述信號序列包含約20-22個胺基酸殘基。
26.權利要求23的人源化策略，其中所述人輕鏈序列從包含人種系可變輕鏈序列的文 庫中鑑定。
27.權利要求23的人源化策略,其中所述兔序列中的FR1、FR2、FR3以及CDR1和CDR2 區域通過比對兔FR1、FR2、FR3以及CDR1和CDR2區域與相對應人輕鏈FR1、FR2、FR3、CDR1、 CDR2區域而進行鑑定。
28.權利要求23的人源化策略,其中所述兔CDR3區域包含9-1.5個胺基酸殘基。
29.權利要求23的人源化策略,其中所述兔輕鏈FR4區域包含11個胺基酸殘基。
30.權利要求23的人源化策略，其中所述FR3以YYC結束。
31.權利要求23的人源化策略，其中所述兔輕鏈中的FR4以FGGGG開始。
32.權利要求31的人源化策略,其中所述兔FM區域以WKR胺基酸序列開始。
33.權利要求23的人源化策略,其中所述所選擇的人FR4輕鏈序列包含FGGGTKVEIKR。
34.權利要求23的人源化策略，其中所述所得到的人源化的兔輕鏈在結合所需抗原的 人源化抗體或人源化抗體片段製造中使用。
35.人源化的兔輕鏈可變胺基酸序列或編碼其的DNA,其根據權利要求23-24中任一項 產生。
36.權利要求35的人源化的兔輕鏈可變胺基酸序列或DNA序列，其對選自微生物抗原、 人抗原、病毒抗原和變應原的抗原特異。
37.權利要求36的人源化的兔輕鏈可變胺基酸或DNA序列,其中所述人抗原選自人自 身抗原、細胞因子、受體蛋白質、酶、激素、受體配體、類固醇、生長因子和癌基因。
38.抗體或抗體片段，其包含根據權利要求23-24中任一項產生的人源化的兔輕鏈可 變序列。
39.根據權利要求23-24中任一項產生的人源化的兔輕鏈或包含其的抗體,其與效應 物部分附著。
40.權利要求39的人源化的兔輕鏈多肽，其中所述效應物部分選自藥物、毒素、酶、放 射性核素、螢光團、細胞因子、親和標記和易位肽。
41.根據權利要求23-24中任一項產生的人源化的兔輕鏈多肽或包含其的抗體或編碼 其的DNA,其衍生自特異性結合細胞因子、生長因子或腫瘤特異性多肽的兔抗體。
42.權利要求41的人源化的兔輕鏈多肽或包含其的抗體，其衍生自特異性結合IL-6、 TNF、VEGF、IL-12、海帕西啶或肝細胞生長因子的兔抗體。
43.用於從兔重鏈抗體序列產生人源化重鏈抗體序列的人源化策略，其包括下述步驟(i)從與所需抗原特異性結合的兔抗體獲得兔重鏈抗體序列，並且鑑定跨越所包括的 構架1(FR1)開始到構架結束的氨基殘基；(ii)使用跨越FR1開始到FR3結束序列的所述兔重鏈抗體胺基酸序列進行同源性搜 索(例如，通過包含人種系抗體序列的文庫的BLAST搜索)，並且鑑定與其同源的人重鏈抗 體序列，即優選在胺基酸水平上與其具有至少80% -90%同一性；(iii)在兔和人重鏈序列中鑑定對應於FR1、FR2、FR3、CDR1、CD:R2區域的排列及其特定 殘基，並且針對所選擇的同源人抗體重鏈的相對應區域比對兔的這些不連續區域；(iv)構建DNA或胺基酸序列，其中所選擇的同源人重鏈序列的CDR1和CDR2區域中的 殘基用兔重鏈序列的相對應CDR1和CDR2區域中包含的選擇性決定殘基替代,並且任選用 兔重鏈FR1的相對應末端1-3個胺基酸替換人重FR1區域的末端1-3個胺基酸；和/或任 選用兔重鏈構架2的相對應末端胺基酸殘基替換人重鏈構架2區域的末端胺基酸,和/或 任選用相對應人CDR2殘基(一般是絲氨酸)替換來自兔重鏈CDR2的末端的第4個胺基酸 (一般是色氨酸)；(v)將編碼或具有兔重鏈CDR3的相對應胺基酸殘基的DNA序列進一步附著至通過步驟 (iv)獲得的DNA或胺基酸序列,所述胺基酸殘基包含在相同的兔重鏈抗體序列中；(vi)進一步選擇與其同源的人重鏈構架4區域(FR4)(優選與人源化的兔抗體重鏈序 列中包含的FR4相差至多4個胺基酸殘基)，並且使編碼所述所選擇的同源人FR4的DNA序 列或所述人FM的相對應氨基殘基附著至在步驟(v)後獲得的DNA或胺基酸序列上；和(vii)合成編碼或包含步驟(i)到(vi)中得到的人源化的兔重鏈序列的DNA或胺基酸 序列。
44.權利要求43的人源化策略，其中所述起始FR1的胺基酸是在所述兔重鏈信號序列 後的第一個胺基酸。
45.權利要求43的人源化策略，其中所述FR3的結束是在FR1的第一個殘基後約 95-100個胺基酸殘基。
46.權利要求43的人源化策略，其中所述信號序列包含不超過19個胺基酸殘基。
47.權利要求43的人源化策略,其中所述同源的人重鏈序列通過在抗體成熟前獲得的 人種系序列的BLAST搜索進行鑑定。
48.權利要求43的人源化策略，其中所述所選擇的同源人重鏈與所述兔輕鏈的相對應 區域具有至少90-95%序列同一性。
49.權利要求43的人源化策略,其中所述兔重鏈序列中的FR1、FR2,FR3以及CDR1和 CDR2區域通過比對兔FR1、FR2、FR3以及CDR1和CDR2區域與相對應人重鏈FR1、FR2、FR3、 CDRUCDR2區域而進行鑑定。
50.權利要求43的人源化策略，其中用所述兔FR1的相對應3個殘基替換所述人FR1 的最後3個胺基酸殘基。
51.權利要求50的人源化策略,其中所述兔FR1中的3個殘基在ser-gly後。
52.權利要求43的人源化策略，其進一步包括用兔FR2的相對應末端胺基酸殘基替換 所述人FR2的末端胺基酸殘基。
53.權利要求52的人源化策略，其中所述末端兔FR2殘基包含任選在異亮氨酸殘基後 的甘氨酸。
54.權利要求43的人源化策略，其進一步包括用絲氨酸殘基更換位於距離所述兔CDR2 的末端約4個殘基的色氨酸殘基。
55.權利要求43的方法,其中所述兔CDR3包含5-19個胺基酸殘基。
56.權利要求43的人源化策略，其中所述兔⑶R3隨後為殘基WG「X」G，其中「X」優選 是Q或P。
57.權利要求43的人源化策略,其中所述兔FR4包含1.1個胺基酸殘基。
58.權利要求57的人源化策略,其中所述兔FR4包含WGQGTLVTVSS。
59.通過權利要求43-58中任一項產生的人源化的兔重鏈可變胺基酸序列或DNA序列， 其衍生自對選自微生物抗原、人抗原、病毒抗原和變應原的抗原特異的兔抗體。
60.權利要求59的人源化的兔重鏈可變胺基酸序列或DNA序列,其對人抗原特異。
61.權利要求59的人源化的兔重鏈可變胺基酸序列或DNA序列,其中所述人抗原選自 人自身抗原、細胞因子、受體蛋白質、酶、激素、受體配體、類固醇、生長因子和癌基因。
62.抗體或抗體片段,其包含根據權利要求43-58中任一項產生的人源化的兔重鏈可 變序列。
63.根據權利要求43-58中任一項產生的人源化的兔重鏈,其與效應物部分附著。
64.權利要求63的人源化的兔重鏈多肽，其中所述效應物部分選自藥物、毒素、酶、放 射性核素、螢光團、細胞因子、親和標記和易位肽。
65.根據權利要求43-58中任一項產生的人源化的兔重鏈多肽或編碼其的DNA,其衍生 自特異性結合細胞因子、生長因子或腫瘤特異性多肽的兔抗體。
66.權利要求65的人源化的兔重鏈多肽，其衍生自特異性結合IL-6、TNF_a、VEGF_ a、 IL-12、海帕西啶或肝細胞生長因子的兔抗體。
67.權利要求64的人源化的兔重鏈多肽,其是去糖基化的。
68.人源化的兔抗體,其包含根據權利要求23-34中至少--項產生的至少--條人源化 的兔輕鏈，和根據權利要求43-58中的一項產生的至少一條人源化的兔重鏈。
69.權利要求68的人源化的兔抗體，其包含人恆定結構域。
70.權利要求69的人源化的兔抗體,其選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。
71.權利要求68的人源化的兔抗體,其結合選自人抗原、細菌抗原、病毒抗原、病原體、 寄生蟲、酵母抗原和真菌抗原的抗原。
72.免疫治療或免疫診斷方法，其包括施用人源化抗體，其中所述改善包括施用根據權 利要求1 5、11 14、21或22中任一項的人源化抗體或抗體片段。
73.權利要求72的方法,其包括改善或減少與IL-6或TNF相關的疾病或病症的症狀。
74.權利要求73的方法，其中與IL-6或TNF-a相關的所述疾病或病症是癌症或炎性
75.權利要求73的方法,其中所述抗體是抗IL-6抗體，並且用於治療或診斷IL-6相關 的疲勞、惡病質或關節炎的預後。
76.權利要求73的方法，其中與IL-6相關的所述疾病或病症選自四肢無力、運動性 疲勞、癌症相關性疲勞、炎性疾病相關性疲勞、慢性疲勞症候群、癌症相關性惡病質、心臟 病相關性惡病質、呼吸相關性惡病質、腎相關性惡病質、年齡相關性惡病質、類風溼性關節 炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、全身性幼年特發性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節病、強直性脊 柱炎、炎性腸病(IBD)、風溼性多肌痛、巨細胞動脈炎、自身免疫性脈管炎、移植物抗宿主病 (GVHD)、Sjogren』 s症候群、成人斯蒂爾病、類風溼性關節炎、全身性幼年特發性關節炎、骨關節炎、骨質疏鬆症、佩吉特骨病、骨關節炎、多發性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏 淋巴瘤、前列腺癌、白血病、腎細胞癌、多中心性卡斯爾曼病、卵巢癌、癌症化學治療中的抗 藥性、癌症化學治療毒性、缺血性心臟病、動脈粥樣硬化、肥胖症、糖尿病、哮喘、多發性硬化 症、阿爾茨海默氏病和腦血管疾病。
77.權利要求73的方法,其中與TNF相關的所述疾病或病症選自四肢無力、運動性 疲勞、癌症相關性疲勞、炎性疾病相關性疲勞、慢性疲勞症候群、癌症相關性惡病質、心臟 病相關性惡病質、呼吸相關性惡病質、腎相關性惡病質、年齡相關性惡病質、類風溼性關節 炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、全身性幼年特發性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節病、強直性脊 柱炎、炎性腸病(IBD)、風溼性多肌痛、巨細胞動脈炎、自身免疫性脈管炎、移植物抗宿主病 (GVHD)、Sjogren』 s症候群、成人斯蒂爾病、類風溼性關節炎、全身性幼年特發性關節炎、骨 關節炎、骨質疏鬆症、佩吉特骨病、骨關節炎、多發性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏 淋巴瘤、前列腺癌、白血病、腎細胞癌、多中心性卡斯爾曼病、卵巢癌、癌症化學治療中的抗 藥性、癌症化學治療毒性、缺血性心臟病、動脈粥樣硬化、肥胖症、糖尿病、哮喘、多發性硬化 症、阿爾茨海默氏病和腦血管疾病。
78.權利要求72的方法，其中所述人源化抗體或抗體片段在多倍體酵母培養物中表 達,所述多倍體酵母培養物在培養基內穩定表達且分泌至少10-25mg/升所述抗體,所述方 法包括(i)將至少一種表達載體引入單倍體酵母細胞內，所述表達載體包含與啟動子和信號 序列可操作地連接的編碼所述人源化抗體或片段的一種或多種異源多核苷酸；(ii)通過交配或質體融合從所述第一種和/或第二種單倍體酵母細胞產生多倍體酵(iii)選擇穩定表達所述人源化抗體或片段的多倍體酵母細胞；和(iv)從所述多倍體酵母細胞產生穩定的多倍體酵母培養物，所述多倍體酵母細胞在培 養基內穩定表達至少10-25rag/升所述人源化抗體或片段。
79.權利要求78的方法，其中所述酵母選自下述屬Arxiozyma；Ascobotryozyma ； 固囊酵母屬；德巴利酵母屬；德克酵母屬；假囊酵母屬；伊莎酵母屬；Kazachstania ；克魯 維酵母屬；Kodamaea ；婁德羅酵母屬；管囊酵母屬；畢赤酵母屬；酵母屬；Saturnispora ； Tetrapisispora ；有孢圓酵母屬；擬威爾酵母屬和接合酵母屬。
80.權利要求79的方法,其中所述酵母屬是畢赤酵母屬。
81.權利要求80的方法，其中所述畢赤酵母屬的物種選自巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤 酵母和多形漢遜酵母(安格斯畢赤酵母)。
82.包含通過根據權利要求23-34或43-58中任一項產生的人源化抗體多肽的人源 化抗體或抗體片段,其中所述人源化抗體或片段以小於或等於Sxio—V^icrUxicnr1、 1 (T8M 人 5x 1 (T9M-1、1 (T9M 人 5x 1 (r10M 人 10—M-1、5x 1 (T111、1 (T111、5x 1 (T12M-1、1 (T12M-1、5x 1 (T13M 人 lO13!1或SxlOl1的解離常數(Kd)與抗原結合。
83.權利要求82的人源化抗體，其中所述抗體以小於或等於SxKr^M—1的解離常數(Kd) 與抗原結合。
84.權利要求82的人源化抗體，其中所述抗體以小於或等於lO^S^SxlO、-1、^)、-1、 5x10 6S]、10 6S\5xl0 7S 1或10 7S 1的離開速率(Koff)與抗原結合。
85.權利要求82的人源化抗體,其中所述親本兔抗體源於--種或多種兔B細胞群體。
86.權利要求82的人源化抗體，其中所述抗體抑制IL-6與IL-6R或TNF與其受體的結合°
87.權利要求86的人源化抗體,其中所述IL-6R是可溶性IL-6R(sIL-6R)。
88.權利要求86的人源化抗體,其中所述TNF受體(TNFR)是可溶性的。
89.載體，其表達根據權利要求1-22或82-88中任一項的人源化的兔。
90.宿主細胞，其包含權利要求89的載體。
91.權利要求90的宿主細胞,其中所述宿主細胞是屬於畢赤酵母屬的酵母細胞。
全文摘要
本發明涉及用於人源化兔重和輕可變區的新型和改良方法。所得到的人源化的兔重鏈和輕鏈以及包含其的抗體和抗體片段良好適合於在免疫治療和免疫診斷中使用，因為它們保留親本抗體的抗原結合親和力，並且基於其與人抗體序列極高水平的序列同一性，在人中應是基本上無免疫原性的。本發明示例了用於製造治療性人源化的抗人TNF-α和抗人IL-6抗體的方案。
文檔編號C07K16/00GK101868477SQ200880022859
公開日2010年10月20日 申請日期2008年5月21日 優先權日2007年5月21日
發明者B·科瓦瑟維奇, J·萊瑟姆 申請人:奧爾德生物製藥公司