治療腦缺血再灌注損傷的藥物及其製備方法
2023-05-28 04:14:01 1
專利名稱：治療腦缺血再灌注損傷的藥物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及治療腦缺血再灌注損傷的藥物。尤其是涉及含活性組分水飛薊賓-卵磷脂複合物的治療腦缺血再灌注損傷的藥物。
背景技術：
缺血再灌注損傷一直是腦血管病治療的重點課題。中性粒細胞在缺血再灌注損傷中起著極其重要的作用。再灌注期間，中性粒細胞大量浸潤於病變組織，一方面可機械性堵塞微循環通道，影響組織(特別是缺血半影區)的血液供應，另一方面，活化的白細胞可釋放大量的毒性氧自由基和蛋白水解酶，損害局部的血管，導致血管通透性加強，造成組織水腫。進入組織的白細胞可進一步釋放上述毒性物質，破壞殘存的神經元和膠質細胞，從而加重神經組織的損傷。此外，白細胞還釋放一些炎性介質和細胞因子，加重炎性反應，從而吸引更多的白細胞進入組織，形成惡性循環，直到組織完全破壞。而這種惡性循環的形成，是通過缺血/再灌注損傷細胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達的上調來實現的。
溶栓療法是近年來缺血性卒中治療上的一個重要進展，通過重建腦血流，使缺血區在產生不可逆性損傷前恢復供血，可以明顯改善神經功能，但伴發而來的再灌注損傷，包括血腦屏障的破壞、嚴重腦水腫以及腦出血，限制了急性溶栓療法的療效。即使不進行該治療，自發的血栓或栓子溶解也可導致再灌注損傷，只有滲透性利尿劑或開顱減壓等降低顱內壓的措施可起到部分作用，目前尚無真正有效的治療再灌注損傷的方法。而炎症反應是腦缺血再灌注損傷的主要成分，對抗炎症的各項研究具有深遠的臨床意義。此外，炎症反應持續至缺血後數天，因此抗炎治療可以擴大治療時間窗，而後者是缺血性卒中治療中的關鍵點。所以準確確定炎症通路中的各種成分及其相互作用和研究開發抑制ICAM-1表達、抑制中性粒細胞的藥物是一個新的研究課題，為缺血再灌注損傷的治療提供新的途徑。
發明內容
本發明提供的治療腦缺血再灌注損傷的藥物含有50％以上的活性組分水飛薊賓-卵磷脂複合物(SLC)。
水飛薊賓(silybin)是一種黃酮類天然抗氧化劑，1968年由Wagner等從菊科植物水飛薊中提取，對血小板聚集及血栓的形成有很好的抑制作用，有證據表明水飛薊賓具有抗菌、抗毒素、抗氧化和減少自由基的作用。一般認為，核轉錄因子NF-κB是介入細胞因子刺激內皮細胞表面粘附分子表達的中心轉錄因子。抗氧化合物能有效地抑制NF-κB的活性，因而抑制粘附因子的表達。
細胞間粘附分子、中性粒細胞在缺血再灌注腦區的上調和浸潤中起著極其重要的作用。缺血再灌注期間ICAM-1的表達和中性粒細胞的浸潤不僅影響了局部的血液供應而且還可直接破壞腦組織結構。本發明從水飛薊賓-卵磷脂複合物(SLC)具有抗自由基和抗脂質過氧化的作用來改變ICAM-1的表達和中性粒細胞浸潤的原理出發，發現了水飛薊賓-卵磷脂複合物複合物對腦缺血再灌注損傷的保護作用。
腦缺血再灌注後，ICAM-mRNA和ICAM-1蛋白質表達明顯增加，中性粒細胞浸潤數亦明顯增加，腦梗塞面積擴大和組織含水量增加。水飛薊賓-卵磷脂複合物複合物能下調ICAM-1的表達和抑制白細胞的聚集，特別是減少中性粒細胞的聚集和粘附，從而減少蛋白水解酶、溶酶體酶、氧自由基和其他效應分子的釋放，使酶類和自由基引起的鏈鎖反應削弱，阻止細胞膜的崩解。同時，抑制缺血再灌注損傷時的PAF和EAA的大量釋放，改善神經症狀，縮小梗塞面積和減輕腦水腫，對缺血再灌注腦損傷有一定的保護作用。
經口服給藥時，首先使本發明與常規的藥用輔劑如賦形劑、潤滑劑、崩解劑等混合，將其製成顆粒劑、膠囊、片劑等形式；經非口服給藥時，可以注射液、輸液劑或栓劑等形式給藥。製備上述製劑時，可使用常規的製劑技術。
本發明另一方面提供製備治療腦缺血再灌注損傷的藥物的方法稱取水飛薊賓28～60g，溶入熱丙酮1250～1450ml中，得暗紅色澄明液體，45～58℃保溫，加入卵磷脂47～70g，攪拌，直至溶液澄明，約5～15min，接回流裝置，邊加熱保溫邊振蕩反應0.5～1.5h，拆除回流裝置，真空濃縮至反應液體積為135～315ml，迅速加入到正己烷2856～3686ml中，得黃色沉澱物，上層液體為黃白色乳濁液，加壓過濾，用正己烷洗滌沉澱，置於真空乾燥箱中室乾燥，得黃色固體產物86～125g。
具體實施例方式
下面的實施例可更詳細地說明本發明，但不以任何形式限制本發明。
實施例1 活性成分為SLC的治療腦缺血再灌注損傷的藥物的製備稱取水飛薊賓(上海朝暉藥廠)43g，溶入熱丙酮1350ml中，得暗紅色澄明液體，55℃保溫，加入卵磷脂(四川英格爾公司)68g，攪拌，約10min，直至溶液澄明，接回流裝置，邊加熱保溫邊振蕩反應1h，拆除回流裝置，真空濃縮至反應液體積為270ml，迅速加入到正己烷3150ml中，得黃色沉澱物，上層液體為黃白色乳濁液，加壓過濾，用正己烷洗滌沉澱，置於真空乾燥箱中室乾燥，得黃色固體產物103g。
通過下面的試驗說明本發明藥物的活性。數據資料x±S表示，應用單因素方差分析，直線回歸分析處理數據，以P＜0.05差異有顯著性，P＜0.01差異有非常顯著性。
試驗實施例1 按照實施例1製得的活性成分為SLC的藥物對缺血再灌注時腦組織ICAM-1mRNA表達的影響實驗方法動物和分組蒙古種沙土鼠，體重80-100克，雌雄不拘，由上海市生物製品研究所動物研究實驗中心提供。按隨機數字表，將動物分為假手術對照組、缺血組、缺血再灌注組、SLC(製備方法見實施例1)組和缺血再灌注溶劑組。SLC組又分為100mg/kg組、200mg/kg和300mg/kg三個亞組，除假手術組外，每組又設1h、3h、6h、12h、24h5個時相點，每組5隻。
腦缺血再灌注動物模型的建立蒙古種沙土鼠再飼料和水供應充足條件下，飼養一周，經10％烏拉坦(1.25g/kg)腹腔注射麻醉後，將動物仰臥固定於解剖板上，沿頸中線切開皮膚，分離兩側腺體及頸肌，暴露氣管及左右兩側頸動脈，將頸總動脈與神經分離，穿線備用，同時進行氣管插管，實驗室室溫26±1℃，動物直腸溫度通過電熱毯維持在37±0.2℃。其中假手術組僅作手術，不結紮動脈。缺血再灌注組用無損傷血管夾鉗夾兩側頸總動脈60min後，放開動脈夾。
ICAM-1mRNA原位雜交製備感受態JM109大腸桿菌，將質量轉入大腸桿菌進行擴增，裂解細菌後離心，分離純化質粒DNA，再用EcokI和Kpn I兩種限制性內切酶雙切質粒CDNA，經電泳分離和透析得到高純度DNA探針片斷。用地高辛隨機引物法標記CDNA探針。腦組織做冰凍切片進行原位雜交，24小時(45℃孵育)；加地高辛抗體後NBI/BICP顯色，封片。結果用CMIAS計算機醫學圖像分析儀處理，單位以面密度(目標總面積/統計場總面積)表示。
腦缺血60min時，腦組織中ICAM-1mRNA明顯增加，而假手術對照組表達不明顯。缺血再灌注組、溶劑組和SLC治療組於缺血再灌注1h ICAM-1mRNA表達明顯增加，再灌注6h達高峰，以後逐漸下降，至24h仍維持較高的表達水平。缺血前30min給予SLC 100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg後，缺血再灌注腦組織中ICAM-1mRNA表達均較溶劑組下降，P＜0.05和P＜0.01(表1)。
表1.缺血再灌注時腦組織ICAM-1mRNA表達的變化(x±s)
注與缺血組比較△P＜0.01；與缺血再灌注比較#P＞0.05；與溶劑組比較*P＜0.05，**P＜0.01試驗實施例2 ICAM-1蛋白質表達水平測定動物模型製備，分組(n＝10)，給藥方法同前。取待測腦組織，冰凍切片用SP免疫組織化學染色法進行，DAB顯色，結果用CMIAS計算機醫學圖像分析儀處理，單位以面密度表示。
腦缺血60min時，腦組織中ICAM-1蛋白表達較假手術組由0.02±0.017增加到0.04±0.021(P＜0.05)。缺血再灌注組、溶劑組和SLC治療組於缺血再灌注1h時，ICAM-1蛋白表達明顯增加，而且隨著再灌注時間延長呈增加趨勢，至24h達高水平。缺血前30min給予SLC 100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg後，缺血再灌注腦組織中ICAM-1mRNA表達各時相點均較溶劑組降低(P＜0.05或P＜0.01)。在SLC各治療組中，ICAM-1蛋白表達與SLC的劑量有較好的量效關係(表2)。
表2.缺血再灌注時腦組織ICAM-1蛋白表達的變化(x±s)
注與缺血組比較△P＜0.01；與缺血再灌注比較#P＞0.05；與溶劑組比較*P＜0.05，**P＜0.01試驗實施例3 SLC對缺血再灌注時腦組織中性粒細胞浸潤數的影響動物模型製備，分組(n＝10)，給藥方法同前。中性白細胞中存在髓過氧化酶(Myeloperoxidase enzyme，MPO)，每個細胞所含酶的量是一定的，約佔細胞乾重的5％。該酶具有使過氧化氫還原的能力，利用這一特點可以分析酶的活力，從而定量出中性粒細胞的數目。其原理為
利用供氫體鄰聯茴香胺供氫體後生成黃色化合物在440nm處有最大吸收峰，以定量測定酶的活力，從而推導出中性粒細胞的數目。Bradly首先在大鼠皮膚組織中應用MPO法測定了炎症反應時中性粒細胞的的浸潤情況，本研究對此法加以改進應用於測定缺血腦組織中的MPO，觀察不同情況下腦組織中中性粒細胞浸潤的不同。
在缺血再灌注1h後，中性粒細胞浸潤數即已開始明顯增加，以後在各時相點呈進行性增加趨勢，在12h時相點達高峰，至24h無下降趨勢。SLC治療組的變化規律類似於缺血再灌注組，但在程度上則明顯低於缺血再灌注組(P＜0.05或P＜0.01)(表3)。
表3.缺血再灌注時腦組織中性粒細胞浸潤數的變化(x±s)
注與缺血再灌注比較△P＞0.05；與溶劑組比較*P＜0.01試驗實施例4 水飛薊賓-卵磷脂對腦梗塞面積的影響動物模型製備，分組(n＝10)，給藥方法同前。每組沙土鼠隨機取5隻，斷頭取腦，低溫取右腦視交叉前後2mm做連續冠狀切片，置於2％TTC鹽水緩衝液中，37℃避光孵育30min。TTC購自Sigma公司，批號8877。TTC染色後，可見正常腦組織被染成紅色，壞死組織不著色。以10％福馬林溶液固定，在CMIAS型計算機圖像分析儀上測定腦梗塞面積，計算出腦梗塞面積百分比(梗塞面積/大腦面積×100％)。
TTC染色後，正常腦組織為深紅色，梗塞區為蒼白色，分界明顯。梗塞可累及基底節及皮質區。CMIAS型分析儀上測量梗塞面積，對照組大腦冠狀切面上未見梗塞。腦缺血60min時，缺血組的腦梗塞面較對照組明顯增加；再灌注30min後，腦梗塞面積由缺血時的17.71±1.97進一步增加到19.16±1.92(P＜0.05)，與溶劑組比較無明顯差異。缺血前給予SLC100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg後，腦梗塞面積分別比溶劑組降低29.39％(P＜0.05)，42.29％(P＜0.01)和60.84％(P＜0.01)，具有較好的量效關係(表4)。
表4 SLC對沙土鼠腦梗塞面積的影響(x±s，n＝10)
注與對照組比較#P＜0.01；與缺血組比較△P＜0.05；與溶劑組比較*P＜0.05，**P＜0.01試驗實施例5 局灶性腦梗塞沙土鼠神經症狀的評定動物模型製備，分組(n＝10)，給藥方法同前。沙土鼠手術後4h、24h、72h動態進行神經症狀評定，記錄沙土鼠神經症狀。0級無明顯異常；I級手術對側前肢內收或屈曲；II級除I級症狀外，尚有向健側打圈；III級除II級症狀外，身體倒向健側；IV級肢體癱瘓，不能爬行。
沙土鼠術後1h-2h甦醒，按4h、24h、72h進行神經功能評定，對照組未見行為異常，均為0級；溶液組術後可觀察到明顯的行為障礙。餘各組沙土鼠神經症隨時間延長於72h有不同程度的緩解，與溶液組比較有統計學意義。SLC對大腦梗塞後沙土鼠神經功能評級的實驗結果見表5。
表5 SLC對腦梗塞沙土鼠神經功能評級的影響(x±s，n＝10)
注與對照組比較*P＜0.001；與溶劑組比較△P＜0.05，△△P＜0.01
試驗實施例6 局灶性腦梗塞沙土鼠腦組織含水量的測定動物模型製備，分組(n＝10)，給藥方法同前。斷頭取腦，用精密天平稱取全腦溼重，於100℃烤箱中烘烤24h。稱取乾重。按Gotoh方法算含水量(溼重-乾重)/溼重×100。
腦缺血60min時，腦組織中的含水量較假手術對照組的40.68±1.86增加到61.38±1.28(P＜0.01)；再灌注30min後，腦組織中的含水量升高至64.32±1.60(P＜0.01)；缺血前給予SLC100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg後，腦組織含水量分別比溶劑組降低10.23％(P＜0.05)，17.73％(P＜0.01)和25.71％(P＜0.01)，且具有較好的量效關係(表6)。
表6 SLC對MCAO沙土鼠腦含水量的影響(x±s，n＝10)
注與對照組比較#P＜0.01；與缺血再灌注比較*P＜0.01；與溶液組比較△P＜0.05，△△P＜0.01試驗結果顯示SLC具有很好的腦保護作用。SLC可通過以下途徑發揮作用的。下調ICAM-1的表達和抑制白細胞的聚集，特別是減少中性粒細胞的聚集和粘附，從而減少蛋白水解酶、溶酶體酶、氧自由基和其他效應分子的釋放，使酶類和自由基引起的鏈鎖反應削弱，阻止細胞膜的崩解。抑制缺血再灌注損傷時的PAF和EAA的大量釋放，改善神經症狀，縮小梗塞面積和減輕腦水腫，從而起到腦保護作用。下面的實施例說明包含本發明提供藥物的藥用製劑。
製劑實施例1 注射液本發明藥物(製備方法同實施例1) 150mg生理鹽水 5ml製劑實施例2 膠囊劑按照本領域已知的方法製備膠囊劑，每個膠囊中含有下述成分本發明藥物(製備方法同實施例1) 50mg乳糖 70mg玉米澱粉 25mg硬脂酸鎂 1mg合計 146mg
權利要求
1.治療腦缺血再灌注損傷的藥物，其特徵在於含有50％以上的水飛薊賓—卵磷脂複合物。
2.權利要求1所述的治療腦缺血再灌注損傷的藥物，所述藥物為膠囊劑。
3.權利要求1所述的治療腦缺血再灌注損傷的藥物，所述藥物為注射液。
4.權利要求1所述的治療腦缺血再灌注損的藥物的製備方法，包括下列步驟a.稱取水飛薊賓28～60g，溶入熱丙酮中，得暗紅色澄明液體，45～58℃保溫；b.加入卵磷脂47～70g，攪拌，直至溶液澄明；c.接回流裝置，邊加熱保溫邊振蕩反應0.5～1.5h，拆除回流裝置，真空濃縮至反應液體積為135～315ml，迅速加入到烷烴中，得黃色沉澱物，加壓過濾，用烷烴洗滌沉澱，乾燥，得黃色固體產物。
5.權利要求4所述的治療腦缺血再灌注損傷的藥物的製備方法，其中所述的烷烴為正己烷。
全文摘要
本發明涉及治療腦缺血再灌注損傷的藥物，其中包含的活性組分為水飛薊賓－卵磷脂複合物(SLC)，該治療腦缺血再灌注損傷的藥物對缺血再灌注腦損傷有一定的治療作用，本發明還公開了該藥物的製備方法。
文檔編號A61P9/10GK1810251SQ20051002355
公開日2006年8月2日 申請日期2005年1月25日 優先權日2005年1月25日
發明者吳曉華 申請人:上海市第七人民醫院