一種測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法

2023-05-27 23:34:16

專利名稱：：一種測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法
技術領域：
：本發明涉及一種測定細菌產酶誘導物的方法。技術背景纖維素酶是多酶體系，受著複雜的代謝調控。酶產量及酶的比活力低一直是影響纖維素酶實際應用的一個重要原因，闡明纖維素酶誘導形成的機制和調節控制的原理，不僅有著理論上的意義，而且將為改變培養條件提高纖維素酶產量，設計篩選模型選育高產菌種提供新的線索和手段。過去人們對纖維素酶的誘導調節機制的研究多集中於木黴(rn'c/20&rmfl)等少數真菌菌株，有關細菌產生纖維素酶的機制了解得非常少。在真菌纖維素酶的研究中，雖發現了幾種可誘導菌體產生纖維素酶的誘導物，但難以用真菌的誘導機理來解釋細菌的誘導現象。因為，一方面目前人們對什麼是纖維素酶合成的真正誘導物仍然存有爭議，在以往所報導的文獻中出現了很多有關何種物質是誘導物的報導；另一方面不能夠確定胞外可誘導產酶的碳源在進入到細胞後，是否被胞壁酶或胞內酶轉化為其它物質而起誘導作用或胞外誘導物不經任何轉化而直接進入胞內起誘導作用。目前缺乏一個有效的測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法。
發明內容本發明是為了解決目前缺乏一個有效的測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法，而提供一種測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法。本發明測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法按照如下步驟進行一、各種碳源對纖維素酶產生的誘導作用在待測細菌的誘導產酶無機鹽培養基中分別添加不同的碳源，使碳源的體積濃度均為0.5%，用4mL無菌水將菌體斜面培養物製成菌懸液，然後取0.3mL菌懸液平行接入裝有30mL發酵培養基的兩個150mL三角瓶中，在30。C的條件下，以170r/min的速度進行振蕩培養，每隔24h取樣，將樣品以4000r/min的速度離心15min，沉澱即為菌體，稱量溼菌體的重量，並同時測定上清液對CMC、濾紙、微晶纖維素、棉花的活力及(3-葡萄糖苷的酶活，連續測定5天，每種酶活的測定平行操作三次，然後取平均值，計算單位溼菌體的產酶量；二、在菌株的對數生長期內獲得菌體；三、細菌胞內酶和胞膜酶的製備用接菌環挑取一環菌體斜面培養物接入裝有30mL種子培養基的150mL三角瓶中，在3(TC的條件下，以170r/min的速度振蕩培養10h，按l。/。的體積比接入裝有200mL增菌培養基的三角瓶中，在30'C的條件下，以170r/min下振蕩培養至對數末期，以1000r/min的速度離心10min收穫菌體，用pH值為7.2的磷酸鹽緩衝液離心洗滌一次，按每克溼菌體需要加入10mL、pH值為7,2的磷酸鹽緩衝液的比例懸浮菌體，將此菌懸液移入一不鏽鋼或玻璃容器內，置冰水浴中，將超聲振蕩器探頭浸入液面以下約2~3mm，調節超聲振蕩器的輸出功率為500W，工作30s，停30s，循環30次，再以1000r/min的速度離心10min，然後以20000r/min的速度離心20min，沉澱層即為細胞壁和細胞膜層，上清層為胞內層，將沉澱層和上清層分別對去離子水於4'C透析過夜，透析液中疊氮鈉的質量濃度為0.02%;四、各酶製備物與底物的反應用去離子水將各種可誘導菌體產纖維素酶的糖和各酶製備物均配成20mg/mL的初始濃度，按1:1的體積比混合，將反應混合物放入37"C水浴反應24h，然後在(TC的條件下以16000r/min的速度離心30min，收集上清用於高效液相色譜的檢測；五、高效液相色譜條件色譜柱為HighPerformanceCarbohydrateColumn(高效糖柱)4.6x250mm，流動相為的乙腈與按照75:25的體積比混合的混合液，流速為1.4mL/min，檢測器為示差折光檢測器，上樣量為15pL，每個樣品平行操作三次；與標準品的保留時間相同的即為細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物。本發明測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法的原理為步驟一為測定單位溼菌體的產酶量，產酶量的測定是為了初步確定胞外可誘導菌體產纖維素酶的碳源；步驟三為製備細菌胞內酶和胞膜酶，其作用是確定在胞外可誘導產酶的碳源在進入到細胞後，是否被胞壁酶或胞內酶轉化為其它物質而起誘導作用或胞外誘導物不經任何轉化而直接進入胞內起誘導作用；步驟四和步驟五為高效液相色譜的測定，高效液相色譜的測定是為了對胞膜酶和胞內酶作用於胞外誘導物後的產物進行定性分析，以確定菌體胞內產酶的真正碳源誘導物。本發明測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法具有步驟少、操作簡單、用時短、費用低廉、無需昂貴的實驗材料和特殊儀器的優點，本發明的方法可明確細菌胞內產纖維素酶的胞內碳源誘導物，這是從分子水平上全面弄清細菌產纖維素酶誘導機制的必不可少的前期步驟，用本發明的方法測定出細菌產纖維素酶的直接誘導物用以提高酶的產量。具體實施方式本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。具體實施方式一本實施方式測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法按照如下步驟進行一、各種碳源對纖維素酶產生的誘導作用在待測細菌的誘導產酶無機鹽培養基中分別添加不同的碳源，使碳源的體積濃度均為0.5%，用4mL無菌水將菌體斜面培養物製成菌懸液，然後取0.3mL菌懸液平行接入裝有30mL發酵培養基的兩個150mL三角瓶中，在30。C的條件下，以170r/min的速度進行振蕩培養，每隔24h取樣，將樣品以4000r/min的速度離心15min，沉澱即為菌體，稱量溼菌體的重量，並同時測定上清液對CMC、濾紙、微晶纖維素、棉花的活力及l3-葡萄糖苷的酶活，連續測定5天，每種酶活的測定平行操作三次，然後取平均值，計算單位溼菌體的產酶量；二、在菌株的對數生長期內獲得菌體；三、細菌胞內酶和胞膜酶的製備用接菌環挑取一環菌體斜面培養物接入裝有30mL種子培養基的150mL三角瓶中，在30°C的條件下，以170r/min的速度振蕩培養10h，按1%的體積比接入裝有200mL增菌培養基的三角瓶中，在30。C的條件下，以170r/min下振蕩培養至對數末期，以1000r/min的速度離心10min收穫菌體，用pH值為7.2的磷酸鹽緩衝液離心洗滌一次，按每克溼菌體需要加入10mL、pH值為7.2的磷酸鹽緩衝液的比例懸浮菌體，將此菌懸液移入一不鏽鋼或玻璃容器內，置冰水浴中，將超聲振蕩器探頭浸入液面以下約23mm，調節超聲振蕩器的輸出功率為500W，工作30s，停30s，循環30次，再以1000r/min的速度離心10min，然後以20000r/min的速度離心20min，沉澱層即為細胞壁和細胞膜層，上清層為胞內層，將沉澱層和上清層分別對去離子水於4。C透析過夜，透析液中疊氮鈉的質量濃度為0.02%;四、各酶製備物與底物的反應用去離子水將各種可誘導菌體產纖維素酶的糖和各酶製備物均配成20mg/mL的初始濃度，按1:1的體積比混合，將反應混合物放入37'C水浴反應24h，然後在0-C的條件下以16000r/min的速度離心30min,收集上清用於高效液相色譜的檢測；五、高效液相色譜條件色譜柱為HighPerformanceCarbohydrateColumn(高效糖柱)4.6x250mm，流動相為的乙腈與按照75:25的體積比混合的混合液，流速為1.4mL/min，檢測器為示差折光檢測器，上樣量為15jiL，每個樣品平行操作三次；與標準品的保留時間相同的即為細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物。本實施方式中的標準品為各種單糖純品(標準品的純度為分析純)。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一的不同點為步驟一的待測細菌為產纖維素酶的細菌，包括芽胞桿菌、纖維弧菌、纖維單胞菌、鐮狀纖維菌、噬纖維菌、生胞噬纖維菌、多囊菌、假單胞菌、熱纖維端胞菌和熱纖維梭菌。其它步驟及參數與具體實施方式一相同。本實施方式中不同菌種測定的誘導物相同。具體實施方式三本實施方式與具體實施方式一的不同點為步驟一中的碳源為CMC(羧甲基纖維素)、微晶纖維素、濾紙、棉花、sigmacell(購於Sigma公司的微晶纖維素粉)、葡萄糖、纖維二糖、果糖、麥芽糖、山梨糖、乳糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、可溶性澱粉、蔗糖、棉子糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇和木糖醇中的一種或幾種的組合。其它步驟及參數與具體實施方式一相同。本實施方式中碳源為兩種或兩種以上物質的混合物時，各種碳源的體積濃度相同。用本實施方式的方法分別測定以下兩株芽胞桿菌(5""7/msp.X10-l-2和5a"7/wsp.X18)的產纖維素酶的胞內真正誘導物，測定數據如表l、表2、圖1和圖2所示。表1為X10-l-2和X18的不同碳源誘導酶活(單位為U/mL.g溼菌體)，表1的數據能夠看出葡萄糖、纖維二糖、果糖、麥芽糖、山梨糖、乳糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖均可在胞外誘導這兩株菌產纖維素酶；表2為各樣品的HPLC保留時間(單位為min)，表2的數據說明小分子物質經胞壁(膜)酶和胞內酶的作用後，所顯示出的保留時間與標準品的保留時間相一致，說明兩株芽胞桿菌的胞壁(膜)酶和胞內酶均未對這些可誘導菌體產纖維素酶的糖起到任何轉化作用，由此可以認為，這些在胞外可誘導菌體產纖維素酶的物質是直接進入菌體內部起誘導作用的，可見，細菌的誘導產酶機制與真菌相比有較大的不同；表1和表2說明本實施方式的方法適用於研究細菌產生纖維素酶誘導物。表ltableseeoriginaldocumentpage8山梨醇nd0.3ndndndnd0.3ndndnd木糖醇ndndiidndndnd0.3ndndnd1)A:CMC;B:微晶纖維素；C:濾紙D:棉花；E:sigmacdl;F:葡萄糖；G:纖維二糖2)nd:未檢測到3)注表中數據為平行操作的平均值表2糖標準物ISEA:X10-l-2胞內酶作用於糖後的產物；B:X10-l-2胞壁(膜)酶作用於糖後的產物；C:X18胞內酶作用於糖後的產物；D:X18胞壁(膜)酶作用於糖後的產物。鼠李糖3.483.50木糖4.074.07阿拉伯糖4.484.51山梨糖《854.874.904.955.385.435.735.776.116.17纖維二糖9.769.78麥芽糖9.979.95乳糖11.1211.123.503.503.504.084.074.084.514.494.494.864.844.844.934.934.915.395.385.385.735.735.716.116.106.109.789.749.749.959.959.9511.1211.1211.12fes.巨口..巨口,露銀乳芽甘葡半權利要求1、一種測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法，其特徵在於測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法按照如下步驟進行一、各種碳源對纖維素酶產生的誘導作用在待測細菌的誘導產酶無機鹽培養基中分別添加不同的碳源，使碳源的體積濃度均為0.5％，用4mL無菌水將菌體斜面培養物製成菌懸液，然後取0.3mL菌懸液平行接入裝有30mL發酵培養基的兩個150mL三角瓶中，在30℃的條件下，以170r/min的速度進行振蕩培養，每隔24h取樣，將樣品以4000r/min的速度離心15min，沉澱即為菌體，稱量溼菌體的重量，並同時測定上清液對CMC、濾紙、微晶纖維素、棉花的活力及β-葡萄糖苷的酶活，連續測定5天，每種酶活的測定平行操作三次，然後取平均值，計算單位溼菌體的產酶量；二、在菌株的對數生長期內獲得菌體；三、細菌胞內酶和胞膜酶的製備用接菌環挑取一環菌體斜面培養物接入裝有30mL種子培養基的150mL三角瓶中，在30℃的條件下，以170r/min的速度振蕩培養10h，按1％的體積比接入裝有200mL增菌培養基的三角瓶中，在30℃的條件下，以170r/min下振蕩培養至對數末期，以1000r/min的速度離心10min收穫菌體，用pH值為7.2的磷酸鹽緩衝液離心洗滌一次，按每克溼菌體需要加入10mL、pH值為7.2的磷酸鹽緩衝液的比例懸浮菌體，將此菌懸液移入一不鏽鋼或玻璃容器內，置冰水浴中，將超聲振蕩器探頭浸入液面以下約2～3mm，調節超聲振蕩器的輸出功率為500W，工作30s，停30s，循環30次，再以1000r/min的速度離心10min，然後以20000r/min的速度離心20min，沉澱層即為細胞壁和細胞膜層，上清層為胞內層，將沉澱層和上清層分別對去離子水於4℃透析過夜，透析液中疊氮鈉的質量濃度為0.02％；四、各酶製備物與底物的反應用去離子水將各種可誘導菌體產纖維素酶的糖和各酶製備物均配成20mg/mL的初始濃度，按1∶1的體積比混合，將反應混合物放入37℃水浴反應24h，然後在0℃的條件下以16000r/min的速度離心30min，收集上清用於高效液相色譜的檢測；五、高效液相色譜條件色譜柱為HighPerformanceCarbohydrateColumn4.6×250mm，流動相為的乙腈與按照75∶25的體積比混合的混合液，流速為1.4mL/min，檢測器為示差折光檢測器，上樣量為15μL，每個樣品平行操作三次；與標準品的保留時間相同的即為細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物。2、根據權利要求所述的一種測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法，其特徵在於步驟一的待測細菌為產纖維素酶的細菌，包括芽孢桿菌、纖維弧菌、纖維單胞菌、鐮狀纖維菌、噬纖維菌、生胞噬纖維菌、多囊菌、假單胞菌、熱纖維端胞菌和熱纖維梭菌。3、根據權利要求1所述的一種測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法，其特徵在於步驟一中的碳源為CMC、微晶纖維素、濾紙、棉花、sigmacell、葡萄糖、纖維二糖、果糖、麥芽糖、山梨糖、乳糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、可溶性澱粉、蔗糖、棉子糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇和木糖醇中的一種或幾種的混合物。全文摘要一種測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法，它涉及了一種測定細菌產酶誘導物的方法。本發明解決了目前缺乏一個有效的測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法。本發明測定細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物的方法按照如下步驟進行一、各種碳源對纖維素酶產生的誘導作用；二、在菌株的對數生長期內獲得菌體；三、細菌胞內酶和胞膜酶的製備；四、各酶製備物與底物的反應；五、高效液相色譜；與標準品的保留時間相同的即為細菌產纖維素酶的胞內碳源誘導物。本發明的方法可明確細菌胞內產纖維素酶的胞內碳源誘導物。文檔編號G01N30/02GK101398415SQ20081013748公開日2009年4月1日申請日期2008年11月7日優先權日2008年11月7日發明者謙楊,紅燕申請人:哈爾濱工業大學