一種大分子量t載體及其製備方法
2023-05-28 10:19:06 1
專利名稱：一種大分子量t載體及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種大分子量T載體及其製備方法。
背景技術：
PCR(polymerase chain reaction)是分子生物學中的常規實驗技術。絕大多數情況下需要將PCR擴增產物克隆到質粒載體上，以便對PCR產物進行測序、體外轉錄、體外翻譯等操作。克隆PCR產物的方法有很多種，但最直接的、最方便的方法是TA克隆。所謂TA 克隆就是將3』端具有單個A尾巴的PCR產物克隆到3』端具有單個T尾巴的T載體上。TA 克隆的理論依據是在PCR擴增過程中，由於Taq聚合酶具有不依賴於模板的末端轉移酶活性而在PCR產物的3』末端添加單個脫氧核苷酸，並且偏好添加四種脫氧核苷酸中的脫氧腺苷酸，使得50%以上的PCR產物的3』末端具有單個脫氧腺苷酸，即3』端A尾巴。目前，T載體的製備方法有2種。第一種方法是利用產生平末端的內切酶將環狀質粒酶切成線狀質粒，然後利用末端轉移酶將單個雙脫氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到線狀載體的3』端。第二種方法是在質粒載體的多克隆位點中引入特定的酶切位點，用相應的內切酶酶切產生3』端具有單個T突出的線性T載體。前一種方法在製備T載體過程中存在加尾效率較低以及線性質粒在加尾過程中其兩端的序列有時會被部分刪除等問題。與前兩種方法相比，第二種方法更快捷、更高效以及更穩定。理論上，可以用來製備T載體的內切酶包括)(CmI，Eamll05I，其中kml在製備T載體中得到廣泛應用。其它內切酶要麼因為太昂貴，要麼因為在普通的克隆載體上有太多的識別位點，因而在製備T載體中的應用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆載體中，例如pUC18、pBlueSCript SK載體等，都不具有kml 酶切位點，但在Amp抗性基因中含有一個Eamll05I及其同裂酶的酶切位點，因而在這些載體的多克隆位點引入)(cml位點更方便一些，這就是為什麼更多人採用kml製備T載體(美國專利文獻 US005487993A ；中國專利文獻 CN1142279C, CN1344795A 以及 CN1362521A)。使用)(cml構建T載體均存在一個潛在的問題部分酶切的前T載體混雜在T載體中會導致非重組轉化子的本底過高。目前，解決這一問題最有效的方法是在前T載體的兩個kml或兩個kml酶切位點之間引入足夠長的間隔DNA，經瓊脂糖凝膠電泳後將完全酶切的質粒和部分酶切的質粒分開。然而，引入間隔DNA後帶來的一個新問題是由於環形質粒在瓊脂糖凝膠電泳中比起分子量相當的線型質粒移動得快，因而，未被酶切的環型質粒 (前T載體，帶有間隔DNA)往往與分子量小於自身的T載體(不帶有間隔DNA)混雜，最終造成非重組轉化子的本底過高。pBlueScript II SK(+/-)載體(GenBank Accession No. X52330)是由 pUC載體派生而來的噬菌粒載體(phagemid或phasmid)，除了含有一個Amp抗性基因及一個IacZ基因作為篩選標記外，在多克隆位點的兩側存在T3和T7噬菌體的啟動子，同時具有一個單鏈噬菌體fl的複製起點(pBlu必cript II SK(+)和pBlueScript II SK(-)的唯一區別是兩者 Π的方向相反)。ccdB 基因(GenBank Accession No. AP001918)位於 F 質粒上，它和 ccdA 基因一起構成F質粒的ccd (control or cell death)位點。Ccd位點通過殺死不含F質粒的大腸桿菌細胞達到穩定F質粒的作用。CcdB蛋白幹擾大腸桿菌的DNA促旋酶，因而抵制大多數大腸桿菌菌株。但是大腸桿菌DB3. 1菌株中促旋酶的A亞基基因發生了一處突變，突變後的促旋酶可以抵抗CcdB蛋白的毒性效應，因而含有ccdB基因的質粒要以在DB3. 1菌株中增殖。目前，市場上常用的T載體長度都在^OObp到3100bp之間，對於長度在2500bp 至3500bp之間的片段而言，通過酶切得到的片段，很難和該類載體在電泳時長度上做出明顯的區分，不利於後續更換載體等的後續操作，很容易和載體一起回收，最終造成非重組轉化子的本底過高。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，針對目前常用的T載體長度都在^OObp到3100bp 之間，對於長度在2500bp至3500bp之間的外源片段的克隆，存在非重組轉化子的本底過高，克隆效率較低的不足，而提供一種克隆2500bp至3500bp片段具有較高TA克隆效率的 T載體及其製備方法。本發明解決上述技術問題的技術方案如下本發明的第一方面是提供一種前T載體，是以已知載體為出發載體進行改良後的載體，出發載體是 pBlu必cript II SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或 pGEM 系列載體，它們的多克隆位點被替換為)(cml盒，所述的kml盒包括ccdB基因序列以及緊密連接於所述ccdB基因序列兩側的各一個kml酶切位點序列，並且出發載體中的抗性基因前和/或後插入了長度為1000 2000bp的無義序列而被延長。較佳的，所述的kml盒還包括連接於所述各一個kml酶切位點序列的除kml酶切位點序列外的酶切位點序列。更佳的，所述的)CcmI盒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或 SEQ ID NO 6 所示。出發載體中的抗性基因前和/或後插入了長度為1000 2000bp，優選1500bp的無義序列而被延長。所謂的無義序列是指不影響載體複製、轉錄、翻譯等功能的序列，例如可以是某些載體的骨架結構，如包含AMP抗性基因的載體pJETl. 2中AMP抗性基因前後的載體骨架結構優選BpiI和HindIII雙酶切的結構。更佳的，在Amp抗性基因和在其前和/ 或後插入了長度為1000 2000bp，優選1500bp的無義序列後的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。本發明的第二方面是提供一種T載體，由如上所述的前T載體經kml或kml同裂酶酶切而得。其中，所述T載體較佳的為圖4所示的pXL-T，圖5所示的pXL01_T或圖6所示的 PXL02-T。本發明的第三方面是提供一種製備所述的前T載體的方法，包括以下步驟1) WpBlueScript II SK (-), pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pUC19，或 pGEM 系列載體為出發載體，在其多克隆位點引入引入)(cml盒，得到前T載體；所述的)(CmI盒包括 ccdB基因序列以及緊密連接於所述ccdB基因序列兩側的各一個kml酶切位點序列；2)將所述出發載體中的Amp抗性基因延長。
其中，步驟幻中較佳的在載體的Amp抗性基因前和/或後插入無義序列，從而延長。例如將pBlueScript II SK(-)中的Amp抗性基因用來自載體pJETl. 2的AMP抗性基因及其前後的載體骨架(如載體PJET1. 2的BpiI和HindIII雙酶切片段)替換，即得。所述的Amp抗性基因延長後優選如序列表中SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。本發明的第四方面是提供所述的前T載體和T載體在基因克隆中的應用。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。採用本發明的T載體進行TA克隆時由於徹底解決了非重組轉化子本底過高的問題，因此大大提高了 T載體的質量和穩定性。克隆片段的選擇範圍更為廣泛。實驗證明本發明的T載體分別克隆2. Skb和3. 2kb的PCR產物的TA克隆效率在95%以上。本發明的 T載體及其製備方法將在基因工程領域中發揮重要的作用。
以下結合
本發明的特徵和有益效果。圖1顯示用於構建上述前T載體(pXL，pXLOl，pXL02，)的引物序列。其中左邊方框中的序列為酶切位點。圖2是實施例1的質粒構建示意圖。圖3是實施例2的質粒構建示意圖。圖4是為pXL-T的物理圖譜。圖5是pXLOl-T的物理圖譜。圖6是pXL02-T的物理圖譜。
具體實施例方式本發明的目的是提供具有較高TA克隆效率的尤其是克隆2500bp至3500bp之間的常規商業克隆載體不易於區分的片段的T載體。本發明提供一種具有較高TA克隆效率尤其是克隆2500bp至3500bp之間常規商業克隆載體不易於區分的片段的T載體及其製備方法。本發明的一T載體包括pBlueScript II SK(-)的ColEI ori序列，pBlue Script II SK(-)的 Π ori 序列，pBlue Script II SK(-)的 IacZ 基因序列，pBlue Script II SK(-)的T3噬菌體啟動子序列，pBlue Script II SK(-)的T7噬菌體啟動子序列以及分別位於兩個末端的改造過的各一個多克隆位點序列，還包括一段含有amp+基因的外源片段。 其中，所述兩個多克隆位點均具有3』突出T末端。所述含有amp+基因的外源片段除amp+ 基因外還增加了其他序列，被人為延長，從而增加整個載體的總長度，便於區分2500bp至 3500bp之間常規商業克隆載體不易於區分的片段。所述分別位於兩個末端的改造過的各一個多克隆位點序列經過改造。其特徵在於所述3』突出T末端的序列為5，· · · CCCGGGATT 3』5』 ATCTTGGG. · · 3』3，· · · GGGCCCTA 5，，3，TTAGAACCC. · · 5，改造過的多克隆位點(MCS)序列(見序列表SEQ ID NO :1所示)為GAATTC GAGCTC GGTACCC GG GGATCC* AAGATt ATCTTGG GGATCC TCTAGAGTCGAC CTGCAG* GCATGC AAGCTT
*表示單一酶切位點。所述T載體優選為pXL-T (圖4)，pXLOl-T (圖幻或pXL02_T (圖6)。本發明的第二個目的是提供一種製備上述T載體的方法。本發明提供一種製備上述一 T載體的方法，包括以下步驟1)將pBlueScript II SK(-)中的Amp抗性基因延長，從而增加整個載體的長度。2)在步驟1)得到的載體的多克隆位點中引入kml盒，所述的kml盒包括ccdB 基因序列以及緊密連接於所述ccdB基因序列兩側的各一個kml酶切位點序列。3)用kml或其同裂酶酶切步驟2、所得的前T載體，得到T載體。所述的kml盒較佳的還包括連接於所述各一個kml酶切位點序列的除kml酶切位點序列外的酶切位點序列。所述的)(cml盒優選如序列表中SEQ ID N0:4，SEQ ID NO: 5，或SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列。SEQ ID NO 4由718個鹼基組成；SEQ ID NO 5由 726個鹼基組成；SEQ ID NO 6由712個鹼基組成。所述的ccdB基因序列較佳的是序列表中SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。所述前T載體優選pXL，pXLO 1或pXL02 ；所述T載體優選pXL_T (圖4)，pXL01-T (圖 5)或 pXL02-T (圖 6)。本發明構建的pXLxx系列前T載體以及由這些前T載體製備而來的pXLxx-T系列 T載體是基於pBlueScript II SK(-)構建而成。具有pBlueScript II SK(-)載體的全部特性。除了含有一個IacZ基因作為篩選標記外，在多克隆位點的兩側存在T3和T7噬菌體的啟動子，同時具有一個單鏈噬菌休Π的複製起點。本發明中，XcmI盒中的ccdB基因具有間隔DNA和負選標記的雙重作用。ccdB作為間隔DNA是指ccdB基因序列將兩個kml酶切位點間隔開，ccdB基因作為負選標記基因是指含有ccdB基因的質粒轉化到普通大腸桿菌菌株細胞後將殺死大腸桿菌細胞。)(CmI盒中的ccdB基因可以有三種形式第一種形式是ccdB基因與其前面的IacZ讀碼框融合，在 IacZ啟動子驅動下表達產生融合ccdB蛋白；第二種形式是ccdB基因的前面帶有核糖體結合位點(RBQ序列，在IacZ啟動子驅動下表達產生ccdB蛋白；第三種形式是ccdB基因的前面帶有自身啟動子及RBS序列，在IacZ啟動子和其自身啟動子的雙重驅動下表達產生ccdB 蛋白。序列表中SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或SEQ ID NO :6所示分別是這三種形式。以ccdB基因作為間隔DNA的前T載體可以在DB3. 1菌株中增殖，當將T載體與 PCR產物等組成的連接體系轉化普通大腸桿菌菌株(例如DH5a，JM109，DH10B，T0P10)時， 混雜到T載體中的前T載體(包括未酶切的環型質粒及部分酶切的線型質粒經連接而成的環型質粒)會殺死大腸桿菌細胞。這樣，TA克隆過程中由前T載體造成的非重組轉化子本底過高的問題得到徹底解決。此外，一小部分T載體的T尾巴由於種種原因(例如kml及其同裂酶以及連接酶等殘存的核酸外切酶活性、反覆凍融等)會被去除，去除T尾巴的T載體經自身連接產生的轉化子是組成非重組轉化子本底的另一個來源。本發明的方法通過精確設計kml盒使得上述來源的非重組轉化子具有完整的IacZ讀碼框，從而可以經藍白斑篩選去除這種非重組轉化子。本發明的載體中，人為延長了 Amp+的區域，有效增加了整個載體的總長度，從而對常見商業載體的長度缺陷做一個有利的補充。和常規商業載體的組合後，可以克隆任何長度的外援片段，達到優勢互補。
本發明的製備T載體的方法可最大限度的降低T載體中混雜的未酶切的環型質粒和部分酶切的線型質粒。pXLxx-T系列前T載體是把pSK的多克隆位點進行改造，引入2個常規篩選用位點 (BamHI或HindIII或EcoRI)以及XcmI盒。XcmI盒的核心序列如下(框中部分代表ccdB 基因序列，表示酶切割的具體位點)-ccaagatt"cctttggctcgagttcc--ccdB--ccatggca"atcttgg-3'-ggttcta"aggaaaccgagctcaagg ；--ccdB--ggtaccg"ttagaacc 5，使用)(cml內切酶酶切pXLxx系列前T載體，酶切體系經瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收的大片段即是相應的T載體。3種T載體的區別在於多克隆位點中酶切位點的種類及數量不同。其中，PXLOl-T和pXL02-T具有最少的酶切位點，可以減少高GC含量及迴文結構對體外轉錄的影響，因此這兩種載體尤其適合於對插入片段進行體外轉錄。pXL-T酶切位點最多，因此可以選擇更多的內切酶從T載體上釋放插入片段。此外，由於這3種載體上分別額外引入了一個BamHI或HindIII或EcoR I酶切位點，因此可以用BamHI或HindIII 或EcoR I單酶切從T載體上釋放插入片段，使用者可以有更多的選擇。當製備的pXLxx-T (包括pXL-T，pXL01-T，pXL02-T)系列T載體中的一小部分由於種種原因(例如)(cml及其同裂酶以及連接酶等殘存的核酸外切酶活性、反覆凍融等)其T 尾巴被去除時，這些失去T尾巴的質粒經自身連接後可以形成完整的IacZ讀碼框，因而可以通過藍白斑篩選的方法排除這些非重組轉化子。下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1pBluescriptll SK(_)載體多克隆位點的改造和)(cml盒的引入本質粒構建示意圖見圖2。合成MCS_01_MCS_18，共18條引物，通過PCR將18條引物(序列如圖1所示)連接成約400bp的目的片段即MCS。以載體pENTR3C-dual (Invitrogen)為模版，擴增得到ccdb 基因(引物如圖1所示的CCdb_F/CCdb_R)。然後通過重疊PCR，與上述400bp片段融合，得到改造後的)(cml盒。獲得MCS的PCR反應體系為50μ L反應體系中含5U Pfu, 0. 2mmol/LdNTPs U XPfu bufferU號和18號引物各lOymol/L、模板(1-18號引物的混合物)5ng左右；PCR擴增的循環程序為94°C預變性 5min，(94°C，30s ；56°C, 30s ；72°C，1. 5min) X30 個循環，72°C最後延伸5min ；重疊PCR法獲得)(cml盒，模板為上述獲得的400bp MCS以及擴增得到的ccdb 基因，擴增引物為(MCSCCdb_F/MCSCCdb_R)(序列如圖1所示)；PCR反應體系和程序與上述一致，在此不便贅述。瓊脂糖凝膠電泳回收約700bp的目的條帶OCcmI盒)。將回收的 PCR 產物和 pBluescript SK(-)載體(GenBank Accession No. X52330)分別用 PvuII單酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後切膠回收。將酶切後的PCR產物與酶切後的pBluescript SK(-)載體建立如下連接反應體系10 μ L連接體系中含3U連接酶 (Promega)，IX連接緩衝液，約50ng質粒，約50ng PCR產物。4°C連接16小時以上。連接產物按照常規方法轉化到DB3.1菌株(Invitrogen)。經酶切鑑定得到陽性菌落。陽性菌落經測序驗證之後得到PSKMC。插入片段的測序的結果，就是kml盒，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。第1位到第145位是第一個MCS的核苷酸序列，其酶切位點分別對應EcoRl-SacI-KpnI-SmaI-BamHI。第146位到第451位是ccdb基因的核苷酸序列。第452位到第718位是第二個MCS的核苷酸序列，其酶切位點分別對應 BamHI-XbaI-SaII-SphI-HindIII。實施例2構建前T載體，用包含AMP+基因的pJETl. 2 (Fermentas)載體來人為延長 pBluescriptll SK(-)的amp+基因部分，從而整體延長整個載體的長度本質粒構建示意圖見圖3。以實施例1構建得到的質粒pSKMC為模板，用XL_F和XL_R引物(序列見圖1)進行PCR擴增。PCR擴增的反應體系為50μ L反應體系中含5U Pfu,0. 2mmol/L dNTPs,lXPfu buffer,引物各1(^11101/1，模板51^左右；PCR擴增的循環程序為94 °C預變性5min， (94°C，30S ；60°C，30S ；72°C，1. 5min) X 30 個循環，72°C最後延伸 5min。PCR 產物經瓊 脂糖凝膠電泳後切膠回收，將回收的PCR產物用BsaI酶切。將pJETl. 2質粒O^rmentas) 用BpiI和HindIII雙酶切。酶切產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳後切膠回收2. 3kb的大片段。 將酶切後的PCR產物與酶切後的pJETl. 2載體建立如下連接反應體系10 μ L連接體系中含3U連接酶(Promega)，1 X連接Buffer，約50ng質粒，約50ng PCR產物。4°C連接16小時以上。連接產物按照常規方法轉化DB3. 1菌株(Invitrogen)。經酶切鑑定篩選得到陽性菌落，陽性菌落經測序鑑定得到前T載體pXL。前T載體pXLOl的構建過程除所用的PCR擴增引物是XL01_F和XL01_R(序列見圖1)以及所使用的模板是PGH載體(生產商上海捷瑞生物工程有限公司Generay)外，其它步驟與PXL-T相同。前T載體pXL02的構建過程除所用的PCR擴增引物是XL01_F和XL01_R(序列見圖1)以及所使用的模板是PGE載體(生產商上海捷瑞生物工程有限公司Generay)外，其它步驟與PXL構建相同。T 載體 pXL-T、pLXOl-T、pLX02_T 結構如圖 4，5，6 所示，其中 pXL_T(圖 4)設計了一對用於鑑定的酶切位點BamHI，MCS上包括的酶切位點為=EcoRl-SacI-KpnI-SmaI-BamHI -ccdbBox-BamHI-Xbal-SalI-SphI-HindIII。pXLOl-T (圖 5)設計了一對鑑定酶切位點 HindiII，MCS 為 HindiII-SmaI-HindI11。pXL02-T (圖 6)設計了一對鑑定酶切位點 EcoRI，MCS 為 EcoRI-Smal-EcoRI。實施例3pXL-T系列T載體的製備及TA克隆效率分析1、製備T載體用)(cml酶切前 T 載體 pXL 或 pXLOl 或 pXL02 製備 pXL-Τ 或 pXLOl-T 或 pXL02_T。 酶切反應體系如下20 μ L酶切體系中含3U XcmI內酶切(購自NEB公司)，lXNEBuffer4, 大約Iyg質粒。37°C酶切3小時後，經瓊脂糖凝膠電泳後切分別切膠回收大片段。切膠回收純化的大片段即是相應的PXL-T或pXLOl-T或pXL02-T載體。2.測試TA克隆效率
權利要求
1.一種前T載體，其特徵在於，是以已知載體為出發載體進行改良後的載體，出發載體是 pBlueScript II SK (-)，pUC18, pUC19, pUCl 18，pUCl 19，pUC19，或 pGEM 系列載體，它們的多克隆位點被替換為)(cml盒，所述的kml盒包括ccdB基因序列以及緊密連接於所述ccdB 基因序列兩側的各一個)(cml酶切位點序列，並且出發載體中的抗性基因前和/或後插入了長度為1000 2000bp的無義序列而被延長。
2.根椐權利要求1所述的前T載體，其特徵在於，所述的kml盒還包括連接於所述各一個)(CmI酶切位點序列的除)(CmI酶切位點序列外的酶切位點序列。
3.根椐權利要求1或2任一項所述的前T載體，其特徵在於，所述的kml盒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或SEQ ID NO 6所示。
4.根椐權利要求1 3任一項所述的前T載體，其特徵在於，所述的出發載體是 pBlueScript II SK(-)。
5.根椐權利要求1 4任一項所述的前T載體，其特徵在於，所述的抗性基因和在其前和/或後插入了無義序列後的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。
6.一種T載體，其特徵在於，由如權利要求1 5任一項所述的前T載體經)(CmI或 XcmI同裂酶酶切而得。
7.根椐權利要求6所述的T載體，其特徵在於，所述T載體為圖4所示的pXL-T，圖5 所示的pXLOl-T或圖6所示的pXL02-T。
8.根椐權利要求6或7任一項所述的T載體，其特徵在於，所述T載體是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :7所示的pXL-T，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :8所示的pXL01_T， 或核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 9所示的pXL02-T。
9.一種製備權利要求1 5任一項所述的前T載體的方法，包括以下步驟1)以pBlueScript II SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或 pGEM 系列載體為出發載體，在其多克隆位點引入引入)(cml盒，得到前T載體；所述的kml盒包括ccdB基因序列以及緊密連接於所述ccdB基因序列兩側的各一個)(CmI酶切位點序列；2)將所述出發載體中的Amp抗性基因延長。
10.如權利要求1 5任一項所述的前T載體和如權利要求6 8所述的T載體在基因克隆中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種T載體及其製備方法。是以已知載體為出發載體進行改良後的載體，出發載體是pBlueScript II SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或pGEM系列載體，它們的多克隆位點被替換為XcmI盒，所述的XcmI盒包括ccdB基因序列以及緊密連接於所述ccdB基因序列兩側的各一個XcmI酶切位點序列，並且出發載體中的抗性基因前和/或後插入了長度為1000～2000bp的無義序列而被延長。本發明的T載體具有較高TA克隆效率，尤其對於克隆2500bp至3500bp之間的常規商業克隆載體不易於區分的片段，TA克隆效率可達100％，將在基因工程領域中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/66GK102304537SQ20111021417
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月28日 優先權日2011年7月28日
發明者周磊, 肖愛軍, 赫英俊 申請人:上海捷瑞生物工程有限公司