一種無血清幹細胞培養基的製作方法

2023-05-28 09:02:51 1

本發明屬於細胞培養基技術領域，具體涉及一種無血清幹細胞培養基。

背景技術：

諸多研究表明幹細胞不僅可以自我更新，在條件合適的情況下能分化成其他功能細胞，因此幹細胞有望成為治療人類疑難疾病的有效手段。然而，幹細胞在正常成體組織中含量甚微，在體外如何快速擴增與培養幹細胞培養是研究幹細胞的作用機制及探索其在治療人類疾病治療方法的重要技術。

專利申請(CN103243070A)公開了一種幹細胞培養基及其應用，所述培養基組分包括有基礎培養基、胎牛血清、細胞因子或蛋白多肽、維生素及脂類。其所提供的培養基能夠快速擴增幹細胞同時又不影響幹細胞的潛能，幹細胞的擴增速度較常規培養基提高3-5倍，而且能用於培養多種組織的幹細胞。

但是在幹細胞培養的過程中，血清中大量成分複雜的蛋白質，給細胞培養的標準化帶來困難，其中複雜的蛋白和多重的細胞因子，會導致本身就容易分化的幹細胞生出多種完全不同的細胞表型，而產生多種完全不同的細胞分化趨勢，也給細胞培養表達產品分離純化和結果的重複性帶來很大的困難。

因此，迫切需要一種成本低、成分明確、簡單的的無血清培養基。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種成本低、成分明確、簡單的無血清幹細胞培養基。

為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：

一種無血清幹細胞培養基，主要由以下成分及其濃度組成：基礎培養基1L，胰島素6-15mg/L，轉鐵蛋白21-35mg/L，淫羊藿苷0.45-0.55μM，甘氨醯丙氨酸365-850mg/L，丙氨醯-L-酪氨酸1.85-2.15g/L，多聚賴氨酸0.15-0.75mg/L，維生素E 0.3-0.5mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.03-0.045mg/L，轉化生長因子-β10-30μg/L，還原性穀胱甘肽0.025-0.54mg/L和碳酸氫鈉0.45-0.65g/L。

進一步，所述無血清幹細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM/F12 1L，胰島素7.5mg/L，轉鐵蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨醯丙氨酸765mg/L，丙氨醯-L-酪氨酸1.97g/L，多聚賴氨酸0.34mg/L，維生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，轉化生長因子-β19μg/L，還原性穀胱甘肽0.43mg/L和碳酸氫鈉0.52g/L。

進一步，所述基礎培養基為DMEM-L培養基或DMEM/F12培養基。

進一步，所述無血清幹細胞培養基的製備方法，包括以下步驟：

(1)準確稱取相應濃度的胰島素，轉鐵蛋白，淫羊藿苷，甘氨醯丙氨酸，丙氨醯-L-酪氨酸，多聚賴氨酸，維生素E，聚乙烯吡咯烷酮，轉化生長因子-β，還原性穀胱甘肽，溶於溫度為20-30℃超純水中，攪拌至溶解完全，得溶液I；

(2)向上述溶液I中加入相應濃度的碳酸氫鈉，攪拌均勻，加入1LDMEM/F12培養液，攪拌均勻得溶液II；

(3)用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調溶液II的pH至7.2，得溶液III；

(4)將溶液III用0.22μm濾膜正壓過濾除菌，即得。

採用本發明的上述無血清幹細胞培養基，針對幹細胞自身容易生出多種完全不同的細胞表型和多種完全不同的細胞分化趨勢的情形，採用上述各功能成分穩定和保持其分化水平；並且可以避免現有技術血清蛋白培養基存在的血清批次間的質量差異，提高細胞培養和試驗結果的重複性；並避免血清所帶來的外源性汙染及血清組分的細胞毒性作用。並且其自身成分相對明確、質量一致且蛋白含量低，有利於提高細胞產品生產的穩定性並使細胞產品易於純化。與現有技術相比，本發明無血清幹細胞培養基具有以下優點：

(1)利用本發明培養基能夠使細胞生長延滯期縮短，擴增速度快，細胞平頂期時間延長，有利於細胞生長和增殖。

(2)本發明培養基可用於培養多種幹細胞，包括脂肪間充質幹細胞、骨髓間充質幹細胞和臍帶血幹細胞等。

(3)本發明培養能夠明顯地促進幹細胞的分化，同時培養增殖後的幹細胞對細胞退行性模型的保護作用。

附圖說明

圖1：不同細胞培養基中幹細胞密度變化；

圖2：不同細胞培養基中幹細胞分化成RPE細胞的比率；

圖3：實施例1培養基中不同幹細胞在細胞退行性模型中感光細胞的變化情況。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。

原料來源：DMEM(L)液體：美國Hyclone公司；DMEM/F12液體：Hyclone公司；淫羊藿苷，CAS號：489-32-7；多聚賴氨酸，CAS號：25988-63-0。

實施例1一種無血清幹細胞培養基

一種無血清幹細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM/F12 1L，胰島素7.5mg/L，轉鐵蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨醯丙氨酸765mg/L，丙氨醯-L-酪氨酸1.97g/L，多聚賴氨酸0.34mg/L，維生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，轉化生長因子-β19μg/L，還原性穀胱甘肽0.43mg/L，碳酸氫鈉0.52g/L。

培養基製備方法為：

(1)準確稱取相應濃度的胰島素，轉鐵蛋白，淫羊藿苷，甘氨醯丙氨酸，丙氨醯-L-酪氨酸，多聚賴氨酸，維生素E，聚乙烯吡咯烷酮，轉化生長因子-β，還原性穀胱甘肽，溶於溫度為25℃超純水中，攪拌至溶解完全，得溶液I；

(2)向上述溶液I中加入相應濃度的碳酸氫鈉，攪拌均勻，加入1L DMEM/F12培養液，攪拌均勻得溶液II；

(3)用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調溶液II的pH至7.2，得溶液III；

(4)將溶液III用0.22μm濾膜正壓過濾除菌，即得。

實施例2一種無血清幹細胞培養基

一種無血清幹細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM-L 1L，胰島素6mg/L，轉鐵蛋白21mg/L，淫羊藿苷0.45μM，甘氨醯丙氨酸365mg/L，丙氨醯-L-酪氨酸1.85g/L，多聚賴氨酸0.15mg/L，維生素E 0.3mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.03mg/L，轉化生長因子-β10μg/L，還原性穀胱甘肽0.025mg/L，碳酸氫鈉0.45g/L。

製備方法與實施例1相似。

實施例3一種無血清幹細胞培養基

一種無血清幹細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM-L 1L，胰島素15mg/L，轉鐵蛋白35mg/L，淫羊藿苷0.55μM，甘氨醯丙氨酸850mg/L，丙氨醯-L-酪氨酸2.15g/L，多聚賴氨酸0.75mg/L，維生素E 0.5mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.045mg/L，轉化生長因子-β30μg/L，還原性穀胱甘肽0.54mg/L，碳酸氫鈉0.65g/L。

製備方法與實施例1相似。

對比例1一種無血清幹細胞培養基

一種無血清幹細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM/F12 1L，胰島素7.5mg/L，轉鐵蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.85μM，甘氨醯丙氨酸765mg/L，丙氨醯-L-酪氨酸1.97g/L，多聚賴氨酸0.34mg/L，維生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，轉化生長因子-β19μg/L，還原性穀胱甘肽0.43mg/L，碳酸氫鈉0.52g/L。

製備方法與實施例1相似。

與對實施例1區別在於，淫羊藿苷的濃度增加至0.85μM。

對比例2一種無血清幹細胞培養基

一種無血清幹細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM/F12 1L，胰島素7.5mg/L，轉鐵蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨酸320mg/L，丙氨酸445mg/L，丙氨醯-L-酪氨酸1.97g/L，多聚賴氨酸0.34mg/L，維生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，轉化生長因子-β19μg/L，還原性穀胱甘肽0.43mg/L，碳酸氫鈉0.52g/L。

製備方法與實施例1相似。

與對實施例1區別在於，將甘氨醯丙氨酸替換為甘氨酸，丙氨酸。

對比例3一種無血清幹細胞培養基

一種無血清幹細胞培養基，由以下組分及重量份組成：DMEM/F12 1L，胰島素7.5mg/L，轉鐵蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨醯丙氨酸765mg/L，丙氨醯-L-酪氨酸1.15g/L，多聚賴氨酸0.34mg/L，維生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，轉化生長因子-β19μg/L，還原性穀胱甘肽0.43mg/L，碳酸氫鈉0.52g/L。

製備方法與實施例1相似。

與對實施例1區別在於，將丙氨醯-L-酪氨酸濃度降低至1.15g/L。

試驗例一 對幹細胞增殖的加速作用的實驗

1、受試培養基：常規培養基組分：DMEM/F12基本培養基，10％胎牛血清(FBS)；實施例1培養基，對比例1-3培養基

2、培養幹細胞來源：來源於脂肪組織器官的人體幹細胞。

3、體外細胞培養實驗：細胞接種密度控制在10-20％之間，接種後加入培養基培養(37℃，5％CO2)。通過MTT法每隔12小時測一次細胞密度。圖1為本試驗例的實驗結果，從圖中可以看出，經本發明實施例1的培養基培養的幹細胞比對比例1-3的培養基培養表現出更快的擴增速度，並且擴增速度快於常規培養基，在36h時本發明實施例1的培養基培養的幹細胞的濃度是常規培養基的2.9倍。

試驗例二 對成視網膜上皮細胞的潛能分析影響實驗

1、受試培養基：常規培養基組分：DMEM/F12基本培養基，10％胎牛血清(FBS)；實施例1培養基，對比例1-3培養基。

2、培養幹細胞來源：分別來源於脂肪、骨髓間及臍帶三種組織器官的人體幹細胞(ADSC，BMSC，UMBSC)。

3、體外細胞培養實驗：為進一步檢查幹細胞經本發明所描述的培養基擴增後對其分化潛能的影響，我們按文獻所描述測定了按文獻所描述的方法測定了脂肪、骨髓間以及臍三種組織器官來源的人幹細胞(ADSC，BMSC，UMBSC)擴增8代之後視網膜上皮細胞(RPE)的分化實驗(Nat Biotechnol.2008Feb；26(2):215-24.)。對RPE細胞標誌物染色後統計陽性細胞的數量，結果如圖2所示，經本發明描述的培養基培養過的幹細胞分化成RPE細胞的比率均在80％左右，高於對比例培養基並高於常規細胞培養基。因此本發明所描述的培養基培養的幹細胞能夠促進幹細胞分化成RPE細胞的潛能。

試驗例三 增殖後幹細胞對細胞退行性模型的保護作用

1、受試培養基：本發明實施例1培養基

2、培養幹細胞來源：分別來源於脂肪、骨髓間及臍帶三種組織器官的人體幹細胞(ADSC，BMSC，UMBSC)。

3、體外細胞培養實驗：為檢測幹細胞經本發明所描述的培養基擴增後對退行性疾病的治療作用，我們選用了視網膜感光細胞退行性視網膜疾病小鼠模型(rd1)，將8代擴增後的脂肪、骨髓以及臍三種組織器官來源的人幹細胞(ADSC，BMSC或UMBSC)擴增之後植入rd1退行性視網膜之後，組織學檢測感光細胞的數量，以確定其對視網膜感光細胞的保護作用。實驗結果如圖3所示，結果表明，視網膜感光細胞退行性小鼠經幹細胞治療1個月之後，感光細胞的數量由原來不到8％提高到45-57％，幹細胞經本發明的培養基培養之後保護減緩組織細胞退化的能力仍然維持。幹細胞細胞移植之後rd1小鼠視網膜感光細胞退化明顯變慢，因此經本發明所描述的培養基擴增後的幹細胞在對退行性視網膜具有保護作用。