利用酵母生產非n－糖基化蛋白的方法

2023-05-28 13:09:56 1

專利名稱：利用酵母生產非n－糖基化蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種非N-糖基化蛋白的生產方法，尤其涉及一種利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法。
背景技術：
N-糖醯胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase，EC 3.5.1.52)主要存在於革蘭氏陰性菌腦膜膿桿菌(Flavobacteriummeningosepticum)、釀酒酵母和一些哺乳動物細胞內，能夠專一性的斷裂糖鏈和蛋白之間的醯胺鍵，生成一個完整的糖鏈和蛋白，並且將蛋白上的天氡醯胺轉化為天冬氨酸。由於N-糖醯胺酶能夠從糖肽和糖蛋白上面完整切下N-連接的低聚糖(N-糖苷)，將蛋白和糖鏈完全分開，這對於進行細胞表面糖結構—功能的分析、糖鏈對糖蛋白功能的影響和糖鏈結構的分析和研究具有重要意義。
長期以來，人們用大腸桿菌作為宿主表達了許多蛋白，但是這一系統本身也存在著若干缺陷，主要是缺少真核生物的蛋白翻譯後修飾和加工，如剪切、糖基化、形成二硫鍵等，所表達真核蛋白不具有該蛋白的天然構像，往往不具有生物活性。酵母是單細胞低等真核生物，它既具有原核生物的易於培養、繁殖快、便於基因工程操作等特性，同時又具有真核生物的蛋白質翻譯後加工的功能，有適於真核生物基因產物正確摺疊的細胞內環境和糖鏈加工系統，還能分泌外源蛋白質到培養液中，利於純化。因此，最近十多年來，酵母作為一個基因工程表達系統受到廣泛研究和應用。但是酵母細胞內的糖基化過程與高等哺乳動物細胞內的糖基化有一定的差別。酵母細胞內的糖基化主要為高甘露糖性糖基化，並存在過糖基化現象。具有酵母糖基化的蛋白作為治療藥物，在人體內常常具有抗原性，研究表明此抗原性是由酵母細胞內的糖基化過程與高等哺乳動物細胞內的糖基化差異引起的。另外，在畢赤酵母表達體系表達異源蛋白一般存在過糖基化現象，蛋白的高度糖基化可以使一些外源蛋白(如酶)降低酶活，甚至喪失酶活。常常表達出無功能蛋白。

發明內容
為了克服以上缺陷，獲得一個既具有真核生物的蛋白翻譯後修飾和加工，又不具有上述的抗原性的蛋白。本發明的目的是提供一種利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法。
利用本發明的方法，可以應用分子生物學技術構建含有N-糖醯胺酶和外源蛋白基因重組酵母菌株，N-糖醯胺酶穩定表達在酵母細胞表面，外源蛋白經分泌表達到培養介質中，在分泌和培養過程中，表面表達的N-糖醯胺酶將分泌表達的外源糖蛋白的糖鏈除去。
本發明涉及的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，由下述步驟組成；(1)重組表達載體的構建克隆出N-糖醯胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC 3.5.1.52)基因，經酶切後插入大腸桿菌載體，命名為vector-PNG；然後克隆出酵母性凝集因子C-末端錨定位點基因，經酶切後插入到vector-PNG載體；與N-糖醯胺酶基因形成融合基因，載體命名為vector-PNG-A；vector-PNG-A載體經EcoRI、NotI酶切後回收小片段，插入經相同酶切的酵母表達載體，獲得了帶有N-糖醯胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重組載體命名為pPIC9k-PNG-A。
(2)重組酵母菌株的構建用SalI將重組載體pPIC9k-PNG-A線性化；電轉到酵母菌株基因組中，構建重組酵母菌株；在MD平板上長出的菌落為陽性克隆；其中，MD平板培養基配方為13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
(3)分泌糖蛋白的重組菌株的構建將糖蛋白基因插入到pPIC9K載體的α-factor信號肽下遊的多克隆位點，獲得了含有糖蛋白基因分泌表達載體；用SacI將含有該糖蛋白基因的pPIC9K載體線性化，利用電轉化的方法將線性化的重組載體，轉化到上述構建的表面表達N-糖醯胺酶的重組酵母菌株基因組中，構建成分泌表達目的蛋白的酵母重組工程菌株；通過G418抗生素篩選出陽性克隆菌株。
(4)糖蛋白在酵母中誘導表達將上述陽性克隆工程菌株，接種於YPD培養基中，30℃培養12-24小時，搖床轉速為240-270轉/分；當發酵液濃度達OD＝5-6時，按體積比1∶100的接種量轉接到BMG培養基中培養，溫度30℃，搖床轉速為240-270轉/分，培養28～35小時；5000g離心5～10分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體1～2次，轉接到BMM液體培養基中，使發酵液濃度達OD＝0.5-1.0時，誘導培養，誘導溫度20℃-30℃，搖床轉速為180-250轉/分，每隔12小時向培養基中加入5～10ml/L量的甲醇，誘導溫度20℃-30℃，搖床轉速為180-250轉/分，培養36-60小時；將N-糖醯胺酶表達於酵母細胞壁表面，同時外源糖蛋白分泌表達到培養介質中；在培養介質中，表面表達的N-糖醯胺酶將分泌表達的糖蛋白的糖鏈切除，生成了非N-糖基化蛋白。
其中PBS為pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液。
其中YPD培養基配方為10g/L酵母粉；20g/L蛋白腖；20g/L葡萄糖。
其中BMG培養基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；其中BMM液體培養基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；其中，上述重組陽性克隆工程菌株可以通過離心、過濾去除。
在上述方法中，步驟(1)所述的N-糖醯胺酶是具有能夠從糖蛋白上完整的將N-連接的寡糖鏈切除活性的一類酶。
其中，上述步驟(1)所述的N-糖醯胺酶優選是來源於腦膜炎膿桿菌ATCC 33958的N-糖醯胺酶F。
在上述方法中，步驟(1)所述的N-糖醯胺酶(PNGase F)基因，其閱讀框中含有1062個鹼基。編碼一個354個胺基酸的蛋白質。前面的40個胺基酸推測為信號肽，剩餘的314個胺基酸為一分子量為34779Da的蛋白Genbank[gi148720]。
在上述方法中，步驟(1)所述的酵母性凝集因子C-末端錨定位點基因是釀酒酵母性凝集因子基因Genbank[gi171041]的C-末端基因。
在上述方法中，步驟(1)所述的大腸桿菌載體優選是具有XbaI、NotI、EcoRI酶切位點的大腸桿菌質粒，如pBluescriptSK(-)、pBluescriptSK(+)、pET22b之一。
其中，上述用於質粒擴增的宿主菌優選Top10、DH5α、JM109、BL21之一。
在上述方法中，步驟(2)或(3)所述的電轉條件優選是1.5Kv；25μF。
在上述方法中，步驟(2)所述的酵母菌株優選是甲醇營養酵母菌株——畢赤酵母Gs115。
在上述方法中，步驟(3)所述的外源糖蛋白基因是幹擾素基因、EPO基因、核糖核酸酶B基因之一。
在上述方法中，步驟(4)所述的YPD培養條件優選是30℃培養15～20小時，搖床轉速為260轉/分。
在上述方法中，步驟(4)所述的誘導溫度優選是25℃，搖床轉速為220轉/分。
在上述方法中，步驟(4)所述的向培養基加甲醇的量優選是6-8ml/L。
採用本發明涉及的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，可以方便地構建含有N-糖醯胺酶和目的蛋白基因的表達載體，並通過電轉化法轉入酵母菌中，將N-糖醯胺酶穩定表達在酵母細胞表面，同時外源蛋白經分泌表達擴散到培養介質中，在所述分泌表達外源蛋白的酵母重組工程菌分泌和培養過程中，表面表達的N-糖醯胺酶將分泌表達的外源糖蛋白的糖鏈除去，生成了非N-糖基化蛋白。方法簡便，實用，大大降低了成本，具有推廣應用價值。
本發明涉及的分泌表達外源蛋白的酵母重組工程菌株接受外源基因是以整合與基因組的形式，這與大腸桿菌、釀酒酵母的獨立染色體外的質粒表達體系有顯著區別，不存在外源基因丟失現象。通過抗性、PCR等方法篩選出的陽性克隆，可以通過傳代培養。通過該重組酵母菌株表達的真核糖蛋白具有真核翻譯修飾後加工過程，與天然的糖蛋白相比具有相同的構象，只是去掉了糖鏈，作為治療藥物在人體內不具有抗原性，但具有生物活性。


圖1非N-無糖基化蛋白酵母菌株示意2為vector-PNG-A載體圖3為酵母重組載體pPIC9k-PNG-A具體實施方式
下面結合實施例對本發明的內容作進一步的闡述實施例1
非N-糖基化促紅細胞生成素(EPO)在畢赤酵母菌株中的生產1、材料EPO基因Genbank[gi4503588]、pPIC9K載體(Invitrogen Ltd)、含有PNGaseF畢赤氏酵母GS115菌株2、方法1)、表面表達N-糖醯胺酶酵母菌株的構建以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3；5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3為引物從腦膜炎膿桿菌ATCC 33958(購自ATCC)中克隆出N-糖醯胺酶基因，PCR擴增條件50μl反應體系中，10×PCR buffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，dNTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因組DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃預變性5min後按如下參數94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循環28次，最後一個循環72℃延伸10min。經XbaI、NotI酶切後插入pBluescriptSK(+)載體的XbaI、NotI位點命名為vector-PNG。然後以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3為引物，克隆出釀酒酵母性凝集因子C-末端錨定位點基因(PCR擴增條件同上)，經XbaI、EcoRI插入到vector-PNG載體的XbaI、EcoRI位點命名為vector-PNG-A(見附圖2)。vector-PNG-A載體經EcoRI、NotI酶切後回收小片段，插入經相同酶切的pPIC9k表達載體，獲得了帶有N-糖醯胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重組載體pPIC9k-PNG-A(見附圖3)。用SalI將重組載體pPIC9k-PNG-A線性化；電轉到畢赤酵母Gs115菌株基因組中。電轉條件1.5Kv；25μF。以MD(13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg生物素；20g/L葡萄糖)培養篩選菌株，在MD平板上長出的菌落為陽性克隆。
2)、分泌EPO的表達菌株的構建將EPO基因插入到pPIC9K載體的α-factor信號肽下遊的多克隆位點，獲得了含有EPO基因分泌表達載體。用SacI將含有該糖蛋白基因的pPIC9K載體線性化，利用電轉化的方法將線性化的重組載體轉化到表面表達的PNGase F的重組畢赤酵母Gs115菌株基因組中，電轉條件1.5Kv；25μF。構建成分泌表達EPO的畢赤酵母Gs115重組工程菌株。通過G418抗生素篩選出陽性克隆菌株。
3)、重組畢赤酵母菌株的誘導表達挑取經過驗證的陽性重組畢赤酵母Gs115菌株的單菌落，接種到3ml的YPD(10g/L酵母粉；20g/L蛋白腖；20g/L葡萄糖)培養基中，30℃，260r/min培養20小時，按1∶100的接種量轉接到BMG(100mM磷酸鹽緩衝液，pH6.0；酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L)培養基中，於30℃，250r/min條件，培養30小時，5000g離心10分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體2次，用BMM(pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L)培養基重懸菌體，使OD＝0.5，每隔12小時向培養基中加入8ml/L量的甲醇，誘導培養，誘導溫度25℃，搖床轉速為220轉/分，培養48小時。進行SDS-PAGE檢測，在電泳圖上可以看到上述的重組菌株表達的EPO比用普通的畢赤酵母表達的EPO分子量小。
實施例2非N-糖基化幹擾素在酵母菌株中的生產
1、材料幹擾素基因Genbank[gi50593016]、pPIC9K載體(Invitrogen Ltd)、含有PNGase F畢赤氏酵母GS115菌株2、方法1)、表面表達N-糖醯胺酶畢赤酵母菌株的構建以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3；5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3為引物從腦膜炎膿桿菌ATCC 33958(購自ATCC)中克隆出N-糖醯胺酶基因，PCR擴增條件50μl反應體系中，10×PCR buffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，dNTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因組DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃預變性5min後按如下參數94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循環28次，最後一個循環72℃延伸10min。經XbaI、NotI酶切後插入pBluescriptSK(-)載體的XbaI、NotI位點命名為vector-PNG。然後以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3為引物，克隆出釀酒酵母性凝集因子C-末端錨定位點基因(PCR擴增條件同上)，經XbaI、EcoRI插入到vector-PNG載體的XbaI、EcoRI位點命名為vector-PNG-A(見附圖2)。vector-PNG-A載體經EcoRI、NotI酶切後回收小片段，插入經相同酶切的pPIC9k表達載體，獲得了帶有N-糖醯胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重組載體pPIC9k-PNG-A(見附圖3)。用SalI將重組載體pPIC9k-PNG-A線性化；電轉到畢赤酵母Gs115菌株基因組中。電轉條件1.5Kv；25μF。以MD(13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg生物素；20g/L葡萄糖)培養篩選菌株，在MD平板上長出的菌落為陽性克隆。
2)、分泌糖蛋白幹擾素的表達菌株的構建將糖蛋白幹擾素基因插入到pPIC9K載體的α-factor信號肽下遊的多克隆位點，獲得了含有糖蛋白幹擾素基因分泌表達載體。用Sac I將含有該糖蛋白基因的pPIC9K載體線性化，利用電轉化的方法將線性化的重組載體轉化到表面表達的PNGase F的重組菌株基因組中，電轉條件1.5Kv；25μF。構建成分泌表達幹擾素的酵母重組工程菌株。通過G418抗生素篩選出陽性克隆子。
3)重組畢赤酵母菌株的誘導表達挑取經過驗證的陽性重組畢赤酵母Gs115菌株的單菌落，接種到3ml的YPD(10g/L酵母粉；20g/L蛋白腖；20g/L葡萄糖)培養基中，30℃，250r/min培養24小時，按1∶100的接種量轉接到BMG(pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L)培養基中，於30℃，250r/min條件，培養35小時，5000g離心8分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體2次，用BMM(pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L)培養基重懸菌體，使OD＝0.5，每隔12小時向培養基中加入10ml/L量的甲醇，誘導培養，誘導溫度28℃，搖床轉速為230轉/分，培養55小時。進行SDS-PAGE檢測。在電泳圖上可以看到上述的重組菌株表達的幹擾素比用普通的畢赤酵母表達的幹擾素分子量小。
實施例3非N-糖基化核糖核酸酶B在酵母菌株中的生產1、材料核糖核酸酶B基因、pPIC9K載體(Invitrogen Ltd)、含有PNGase F畢赤氏酵母GS115菌株
2、方法1)、表面表達N-糖醯胺酶畢赤酵母菌株的構建以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3；5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3為引物從腦膜炎膿桿菌ATCC 33958(購自ATCC)中克隆出N-糖醯胺酶基因，PCR擴增條件50μl反應體系中，10×PCR buffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因組DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃預變性5min後按如下參數94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循環28次，最後一個循環72℃延伸10min。經XbaI、NotI酶切後插入pET22b載體的XbaI、NotI位點命名為vector-PNG。然後以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3為引物，克隆出釀酒酵母性凝集因子C-末端錨定位點基因(PCR擴增條件同上)，經XbaI、EcoRI插入到vector-PNG載體的XbaI、EcoRI位點命名為vector-PNG-A(見附圖2)。vector-PNG-A載體經EcoRI、NotI酶切後回收小片段，插入經相同酶切的pPIC9k表達載體，獲得了帶有N-糖醯胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重組載體pPIC9k-PNG-A。用SalI將重組載體pPIC9k-PNG-A線性化；電轉到畢赤酵母Gs115菌株基因組中。電轉條件1.5Kv；25μF。在MD(13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg生物素；20g/L葡萄糖)平板上長出的菌落為陽性克隆。
2)、分泌核糖核酸酶B的表達菌株的構建將核糖核酸酶B基因插入到pPIC9K載體的a-factor信號肽下遊的多克隆位點，獲得了含有糖蛋白核糖核酸酶B基因分泌表達載體。用SacI將含有該糖蛋白基因的pPIC9K載體線性化，利用電轉化的方法將線性化的重組載體轉化到表面表達的PNGase F的重組菌株基因組中，電轉條件1.5Kv；25μF。構建成分泌表達目的蛋白的酵母重組工程菌株。通過G418抗生素篩選出陽性克隆子。
3)重組畢赤酵母菌株的誘導表達挑取經過驗證的陽性重組畢赤酵母Gs115菌株的單菌落，接種到3ml的YPD(10g/L酵母粉；20g/L蛋白腖；20g/L葡萄糖)培養基中，30℃，260r/min培養20小時，按1∶100的接種量轉接到BMG(pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L)培養基中，於30℃，270r/min條件，培養28小時，5000g離心7分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體2次，用BMM(pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L)培養基重懸菌體，使OD＝0.5，每隔12小時向培養基中加入7ml/L量的甲醇，誘導培養，誘導溫度23℃，搖床轉速為250轉/分，培養60小時。進行SDS-PAGE檢測。
在電泳圖上可以看到上述的重組菌株表達的核糖核酸酶B比用普通的畢赤酵母表達的核糖核酸酶B分子量小。
實施例4表面表達N-糖醯胺酶1(PNG1)的畢赤酵母菌株的構建1.材料PNG1Genbank[gi50593503]；pPIC9K載體(Invitrogen Ltd)1)重組表達載體的構建以5-ATAATCTAGATTTACCATCCTCCCCACGCT-3；5-TTGGAATTCATGGGAGGTATACGAAA-3為引物從釀酒酵母中克隆出N-糖醯胺酶基因，PCR擴增條件50μl反應體系中，10×PCRbuffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因組DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃預變性5min後按如下參數94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循環28次，最後一個循環72℃延伸10min。經XbaI、NotI酶切後插入pBluescriptSK(+)載體的XbaI、NotI位點命名為vector-PNG。然後以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3為引物，克隆出釀酒酵母性凝集因子C-末端錨定位點基因，PCR擴增條件同上，經XbaI、EcoRI插入到vector-PNG載體的XbaI、EcoRI位點命名為vector-PNG-A(見附圖2)。vector-PNG-A載體經EcoRI、NotI酶切後回收小片段，插入經相同酶切的pPIC9k表達載體，獲得了帶有N-糖醯胺酶1(PNG1)和酵母性凝集因子C-末端基因的重組載體pPIC9k-PNG-A(見附圖3)。
2)重組畢赤酵母菌株的構建用SalI將重組載體pPIC9k-PNG-A線性化；電轉到畢赤酵母Gs115菌株基因組中，構建重組畢赤酵母菌株；在MD平板上長出的菌落為陽性克隆；其中MD平板培養基配方為13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
3)重組畢赤酵母菌株的培養與誘導挑取上述陽性克隆單菌落，接種於YPD培養基中，30℃培養12小時，搖床轉速為240轉/分；當發酵液濃度達OD＝5時，按體積比1∶100的接種量轉接到BMG培養基中培養，溫度30℃，搖床轉速為240轉/分；當發酵液濃度達OD＝10時，5000g離心8分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體1～2次，轉接到BMM液體培養基中，使發酵液濃度達OD＝0.5時，誘導培養，誘導溫度20℃，搖床轉速為180轉/分，每隔12小時向培養基中加入5ml/L量的甲醇，培養36小時，5000g離心5分鐘，收集菌體，PBS洗兩次，即得固定化N-糖醯胺酶；其中PBS為pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液。
其中YPD培養基配方為10g/L酵母粉；20g/L蛋白腖；20g/L葡萄糖。
其中BMG培養基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L。
其中BMM液體培養基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
4)分泌糖蛋白幹擾素的表達菌株的構建將糖蛋白幹擾素基因插入到pPIC9K載體的α-factor信號肽下遊的多克隆位點，獲得了含有糖蛋白幹擾素基因分泌表達載體。用SacI將含有該糖蛋白基因的pPIC9K載體線性化，利用電轉化的方法將線性化的重組載體轉化到表面表達的PNGase F的重組菌株，電轉條件1.5Kv；25μF。構建成分泌表達幹擾素的酵母重組工程菌株。通過G418抗生素篩選出陽性克隆子。
5)重組畢赤酵母菌株的誘導表達挑取經過驗證的陽性重組畢赤酵母Gs115菌株的單菌落，接種到3ml的YPD(10g/L酵母粉；20g/L蛋白腖；20g/L葡萄糖)培養基中，30℃，260r/min條件，培養20小時，按1∶100的接種量轉接到BMG(pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L)培養基中，於30℃，250r/min條件，培養30小時，5000g離心6分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體2次，用BMM(pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L)培養基重懸菌體，使OD＝0.5，每隔12小時向培養基中加入8ml/L量的甲醇，誘導培養，誘導溫度25℃，搖床轉速為220轉/分，培養50小時。進行SDS-PAGE檢測。在電泳圖上可以看到上述的重組菌株表達的幹擾素比用普通的畢赤酵母表達的幹擾素分子量小。
實施例5表面表達N-糖醯胺酶(NGLY1)的畢赤酵母菌株的構建1.材料NGLY1(來源於人基因組)Genbank[gi21314689]；pPIC9K載體(Invitrogen Ltd)1)重組表達載體的構建以5-ATAATCTAGATGGCGGCGGCGGCATTGGG-3；5-TTGGAATTCTCAAAGGTCACTGAATTTT-3為引物從釀酒酵母中克隆出N-糖醯胺酶基因，PCR擴增條件50μl反應體系中，10×PCRbuffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因組DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃預變性5min後按如下參數94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循環28次，最後一個循環72℃延伸10min。經XbaI、NotI酶切後插入pBluescriptSK(-)載體的XbaI、NotI位點命名為vector-PNG。然後以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3為引物，克隆出釀酒酵母性凝集因子C-末端錨定位點基因，PCR擴增條件同上，經XbaI、EcoRI插入到vector-PNG載體的XbaI、EcoRI位點命名為vector-PNG-A(見附圖2)。vector-PNG-A載體經EcoRI、NotI酶切後回收小片段，插入經相同酶切的pPIC9k表達載體，獲得了帶有N-糖醯胺酶(NGLY1)和酵母性凝集因子C-末端基因的重組載體pPIC9k-PNG-A(見附圖3)。
2)重組畢赤酵母菌株的構建用SalI將重組載體pPIC9k-PNG-A線性化；電轉到畢赤酵母Gs115菌株基因組中，構建重組畢赤酵母菌株；在MD平板上長出的菌落為陽性克隆；其中MD平板培養基配方為13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
3)重組畢赤酵母菌株的培養與誘導挑取上述陽性克隆單菌落，接種於YPD培養基中，30℃培養18小時，搖床轉速為260轉/分；當發酵液濃度達OD＝6時，按體積比1∶100的接種量轉接到BMG培養基中培養，溫度30℃，搖床轉速為250轉/分；當發酵液濃度達OD＝10時，5000g離心10分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體2次，轉接到BMM液體培養基中，使發酵液濃度達OD＝0.8時，誘導培養，誘導溫度25℃，搖床轉速為210轉/分，每隔12小時向培養基中加入8ml/L量的甲醇，培養30小時，5000g離心5分鐘，收集菌體，PBS洗兩次，即得固定化N-糖醯胺酶；其中PBS為pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液。
其中YPD培養基配方為10g/L酵母粉；20g/L蛋白腖；20g/L葡萄糖。
其中BMG培養基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L。
其中BMM液體培養基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
4)分泌糖蛋白幹擾素的表達菌株的構建將糖蛋白幹擾素基因插入到pPIC9K載體的α-factor信號肽下遊的多克隆位點，獲得了含有糖蛋白幹擾素基因分泌表達載體。用SacI將含有該糖蛋白基因的pPIC9K載體線性化，利用電轉化的方法將線性化的重組載體轉化到表面表達的PNGase F的重組菌株，電轉條件1.5Kv；25μF。構建成分泌表達幹擾素的酵母重組工程菌株。通過6418抗生素篩選出陽性克隆子。
5)重組畢赤酵母菌株的誘導表達挑取經過驗證的陽性重組畢赤酵母Gs115菌株的單菌落，接種到3ml的YPD(10g/L酵母粉；20g/L蛋白腖；20g/L葡萄糖)培養基中，30℃，250r/min條件，培養18小時，按1∶100的接種量轉接到BMG(pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L)培養基中，於30℃，260r/min條件，培養28小時，5000g離心8分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體2次，用BMM(pH6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L)培養基重懸菌體，使OD＝0.7，每隔12小時向培養基中加入7ml/L量的甲醇，誘導培養，誘導溫度27℃，搖床轉速為240轉/分，培養54小時。進行SDS-PAGE檢測。在電泳圖上可以看到上述的重組菌株表達的幹擾素比用普通的畢赤酵母表達的幹擾素分子量小。
權利要求
1.一種利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，由下述步驟組成(1)重組表達載體的構建克隆出N-糖醯胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC 3.5.1.52)基因，經酶切後插入大腸桿菌載體，命名為vector-PNG；然後克隆出酵母性凝集因子C-末端錨定位點基因，經酶切後插入到vector-PNG載體；與N-糖醯胺酶基因形成融合基因，載體命名為vector-PNG-A；vector-PNG-A載體經EcoRI、NotI酶切後回收小片段，插入經相同酶切的酵母表達載體，獲得了帶有N-糖醯胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重組載體命名為pPIC9k--PNG-A；(2)重組酵母菌株的構建用SalI將重組載體pPIC9k-PNG-A線性化；電轉到酵母菌株基因組中，構建重組酵母菌株；在MD平板上長出的菌落為陽性克隆；其中，MD平板培養基配方為13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；(3)分泌糖蛋白的重組菌株的構建將糖蛋白基因插入到pPIC9K載體的α-factor信號肽下遊的多克隆位點，獲得了含有糖蛋白基因分泌表達載體；用SacI將含有該糖蛋白基因的pPIC9K載體線性化，利用電轉化的方法將線性化的重組載體，轉化到上述構建的表面表達N-糖醯胺酶的重組酵母菌株基因組中，構建成分泌表達目的蛋白的酵母重組工程菌株；通過G418抗生素篩選出陽性克隆菌株；(4)糖蛋白在酵母中誘導表達將上述陽性克隆工程菌株，接種於YPD培養基中，30℃培養12-24小時，搖床轉速為240-270轉/分；當發酵液濃度達OD＝5-6時，按體積比1∶100的接種量轉接到BMG培養基中培養，溫度30℃，搖床轉速為240-270轉/分，培養28～35小時；5000g離心5～10分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體1～2次，轉接到BMM液體培養基中，使發酵液濃度達OD＝0.5-1.0時，誘導培養，誘導溫度20℃-30℃，搖床轉速為180-250轉/分，每隔12小時向培養基中加入5～10ml/L量的甲醇，誘導溫度20℃-30℃，搖床轉速為180-250轉/分，培養36-60小時；將N-糖醯胺酶表達於酵母細胞壁表面，同時外源糖蛋白分泌表達到培養介質中；在培養介質中，表面表達的N-糖醯胺酶將分泌表達的糖蛋白的糖鏈切除，生成了非N-糖基化蛋白；其中PBS為pH 6.0，100mM磷酸鹽緩衝液；其中YPD培養基配方為10g/L酵母粉；20g/L蛋白腖；20g/L葡萄糖；其中BMG培養基配方為pH 6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；其中BMM液體培養基配方為pH 6.0，100mM磷酸鹽緩衝液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；其中，上述重組陽性克隆工程菌株可以通過離心、過濾去除。
2.如權利要求1所述的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，其特徵是，步驟(1)所述的N-糖醯胺酶是具有能夠從糖蛋白上完整的將N-連接的寡糖鏈切除活性的一類酶。
3.如權利要求2所述的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，其特徵是，步驟(1)所述的N-糖醯胺酶是來源於腦膜炎膿桿菌ATCC 33958的N-糖醯胺酶F。
4.如權利要求1所述的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，其特徵是，步驟(1)所述的大腸桿菌載體是具有NotI、EcoR I酶切位點的大腸桿菌質粒，如pBluescriptSK(-)、pBluescriptSK(+)、pET22b之一。
5.如權利要求1所述的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，其特徵是，步驟(2)或(3)所述的電轉條件是1.5Kv；25μF。
6.如權利要求1所述的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，其特徵是，步驟(2)所述的酵母菌株是甲醇營養酵母菌株——畢赤酵母Gs115。
7.如權利要求1所述的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，其特徵是，步驟(3)所述的外源糖蛋白基因是幹擾素基因、EPO基因、核糖核酸酶B基因之一。
8.如權利要求1所述的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，其特徵是，步驟(4)所述的YPD培養條件是30℃培養15～20小時，搖床轉速為260轉/分。
9.如權利要求1所述的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，其特徵是，步驟(4)所述的誘導溫度是25℃，搖床轉速為220轉/分。
10.如權利要求1所述的利用酵母生產非N-糖基化蛋白的方法，其特徵是，步驟(4)所述的向培養基加甲醇的量為6-8ml/L。
全文摘要
本發明公開了一種利用酵母生產非N－糖基化蛋白的方法，即利用分子生物學技術構建含有N－糖醯胺酶和目的蛋白基因的表達載體，並通過電轉化法轉入酵母菌中，N－糖醯胺酶穩定表達在酵母細胞表面，目的蛋白經分泌表達到培養介質中，在分泌和培養過程中，表面表達的N－糖醯胺酶將分泌表達的目的糖蛋白的糖鏈除去，從而獲得經過真核表達系統分泌的非N－糖基化蛋白。利用本發明的方法獲得的蛋白經過真核蛋白的後處理加工，具有正確的構像和三級結構，但不具有酵母蛋白的N－糖基化，若作為蛋白藥物不會在人體內產生免疫源性；也不會因為過糖基化使表達蛋白失去活性。
文檔編號C12N15/81GK1746302SQ200510044079
公開日2006年3月15日 申請日期2005年7月18日 優先權日2005年7月18日
發明者祁慶生, 蘇移山, 王鵬 申請人:山東大學