中國對蝦c－型凝集素基因及其編碼的c－型凝集素多肽與應用的製作方法

2023-05-28 13:10:31

專利名稱：中國對蝦c－型凝集素基因及其編碼的c－型凝集素多肽與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種凝集素基因及其編碼的蛋白與應用，尤其涉及一種中國對蝦C-型凝集素基因及其編碼的C-型凝集素多肽與應用；屬基因工程技術領域。
背景技術：
無脊椎動物遭受病原感染後可激活多種細胞和體液免疫反應，從微生物侵襲到最終清除病原一般要經過下列幾個步驟首先這些無脊椎動物必須能夠識別外來異物，稱為感染的非己識別(Recognition of infectious non-self)；隨後，引發了激活絲氨酸蛋白酶和解除絲氨酸蛋白酶抑制劑的細胞外級聯反應，從而將受到感染的信號放大為更強的「危險」信號或解除錯誤警報，這個過程稱為信號的調整和放大(Signal modulationand amplification)；然後引發信號轉導途徑(Signal transduction pathway)，而導致目的基因的轉錄活性；最後，激活了效應物反應系統。
雖然有很多效應物基因的功能還不為人們所知，但有3大類效應物系統是很清楚的即抗菌肽、酚氧化酶依賴性黑化系統和凋亡相關基因系統。
下面主要闡述先天免疫的起始步驟——免疫識別受體研究方面的進展。
以前對無脊椎動物識別侵染微生物的機制了解的很少，近幾年來這方面的研究進展很快。現在基本證實這種「非己」識別是因為存在某些特異性的、可溶的或與細胞膜結合的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，也稱為模式識別蛋白或模式識別分子。雖然它們沒有高等動物B細胞和T細胞系統顯著的特異性，但可以識別或結合那些微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相關分子模式，如脂多糖(LPS)、肽聚糖(peptidoglycans)和甘露聚糖(mannans)等。識別後，這些受體通過激活存在於血淋巴的蛋白酶和利用免疫反應組織的細胞內信號轉導途徑而引起免疫反應。免疫識別受體還可以作為促進吞噬的調理素，也可以是凝集、黑化或其他蛋白質修飾級聯反應等免疫過程的起始因子。關於這些免疫識別受體的分類，不同的作者意見不一，有人將高等動物包括人類中發現的PRR分為7個家族，即C型凝集素、富亮氨酸蛋白、清除受體、五聚體蛋白、脂類轉移酶、整合素和補體調節蛋白。最近有的學者將在果蠅和按蚊中發現的模式識別受體分為6種類型肽聚糖識別蛋白，含硫酯鍵蛋白，革蘭陰性菌結合蛋白，清除受體，C-型凝集素和硫依賴型凝集素。
模式識別受體的研究，實際上是研究先天免疫系統識別「自己」與「非己「的本質，這對深入了解無脊椎動物的先天免疫的功能與調節機制、對免疫學研究的完整性和學科發展具有重要的理論意義，同時可為經濟動物免疫防治策略的制定提供指導。因此進行該方面的研究具有重要的理論和實際意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種從對蝦中克隆的模式識別受體——中國對蝦C-型凝集素基因序列，並提供其克隆方法與載體。
本發明的中國對蝦C-型凝集素基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其所示信息為(a)序列特徵*長度557鹼基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源對蝦(Fenneropenaeius chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgaagttcc tggcgccggt tattcttact acgttgatct ccgtcgctgc gtcagccagt 60gtccgtgcga ccgagtgccc ctccccctac gagcccctgg acgaaacgag gtgcattttc 120ttggacgcct tcgtcagcta cacttggcaa gagacggttg acttgtgcaa gagccacggc 180ggagaaatcc tgacaatcga ggactgcgag acgttcgccc ttgtctatga ctacatcagg 240agccaggatg tcacgaaagg aaaacactac tggttaggag caaccgatga agtagaagaa 300ggcacatgga aatttgtaaa caacagactc actcccatgg gcattcctta ctggggtgta 360aacgagccta acaatgggaa tacctacaac tgcgctatga tgcatgctag ttataaccat 420tattggtacg atgccgcgtg cggaagcaag tataacccca tttgtctcaa gaattattaa 480aaagtgcatg ggcaagggag cactgtgata aaaggtacga cttggaaatg aagagacagc 540taaaaaaaaa aaaaaaa557本發明的另一個目的是提供一種由中國對蝦C-型凝集素基因編碼的C-型凝集素多肽，它具有SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列；其所示信息為(a)序列特徵*長度159胺基酸*類型胺基酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(c)序列描述SEQ ID NO.2Met Lys Phe Leu Ala Pro Val Ile Leu Thr Thr Leu Ile Ser Val5 10 15Ala Ala Ser Ala Ser Val Arg Ala Thr Glu Cys Pro Ser Pro Tyr20 25 30Glu Pro Leu Asp Glu Thr Arg Cys Ile Phe Leu Asp Ala Phe Val
35 40 45Ser Tyr Thr Trp Gln Glu Thr Val Asp Leu Cys Lys Ser His Gly50 55 60Gly Glu Ile Leu Thr Ile Glu Asp Cys Glu Thr Phe Ala Leu Val65 70 75Tyr Asp Tyr Ile Arg Ser Gln Asp Val Thr Lys Gly Lys His Tyr80 85 90Trp Leu Gly Ala Thr Asp Glu Val Glu Glu Gly Thr Trp Lys Phe95 100 105Val Asn Asn Arg Leu Thr Pro MET Gly Ile Pro Tyr Trp Gly Val110 115 120Asn Glu Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Cys Ala Met Met His125 130 135Ala Ser Tyr Asn His Tyr Trp Tyr Asp Ala Ala Cys Gly Ser Lys140 145 150Tyr Asn Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr155其中，還包括SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列的變異體，它編碼具有少於8個胺基酸改變的同源變異蛋白，而且胺基酸改變是保守性胺基酸改變。
本發明的中國對蝦C-型凝集素cDNA的克隆方法是採用一步法或RNA kit從對蝦中提取總RNA，或者用mRNA kit分離提取mRNA。然後利用總RNA或mRNA反轉錄合成cDNA；其中根據對蝦C-型凝集素的保守序列設計的引物為正向引物5』GGT GCA TTT TCT TGG ACG CCT-3』反向引物5』ATG GGA GTG AGT CTG TTG TTT-3』PCR反應條件為首先94℃變性2分鐘，然後進入下列循環94℃ 30秒，53℃ 45秒，72℃ 45秒，共進行30個循環，最後72℃延伸10分鐘。
純化通過鏈式聚合酶反應(PCR)擴增獲得DNA片段；取上述純化產物克隆到pGEM-T Easy載體(Promega公司產品)或pMD 18-T載體(TaKaRa公司產品)，轉化DH5α細胞(常用載體宿主細胞)，平板培養；提取並純化質粒，擴增質粒並測序；再經過3』和5』末端快速擴增，將3』和5』端序列拼接，即得SEQ ID NO.1所示中國對蝦C-型凝集素基因全長核苷酸序列。
本發明的中國對蝦C-型凝集素基因在製備具有抗菌活性的重組蛋白中的應用。
其中，上述應用的方法是通過基因重組技術使所述基因在大腸桿菌、酵母和昆蟲核型多角體病毒中進行表達，獲得具有抗菌活性的重組蛋白。
例如將獲得的中國對蝦C-型凝集素基因克隆到pET-30a(Novagen公司)表達載體，轉化大腸桿菌BL21 DE3細胞，進行誘導表達，純化；並利用獲得重組蛋白進行抑菌實驗。
其抗菌譜和最小抑菌濃度(以菌體不生長的濃度為最小抑菌濃度)見表1。
表1中國對蝦C-型凝集素最小抑菌濃度

利用本發明的中國對蝦C-型凝集素基因通過基因工程方法將其轉入作物，可以獲得具有抗菌能力的作物。
利用本發明的方法通過現有基因工程方法修飾中國對蝦C-型凝集素基因，還可用於其他研究和生產。
利用本發明獲得的重組的C-型凝集素可用於抗菌的飼料添加劑、食品保存、動植物基因轉化和藥物開發。


圖1中國對蝦C-型凝集素的重組表達其中1誘導前菌株，2誘導後菌株，3細胞破碎後的上清液，4細胞破碎後的沉澱，5純化的C-型凝集素，M標準Marker。
具體實施例方式
實施例1中國對蝦C-型凝集素cDNA的克隆1)總RNA的提取採用現有技術一步法提取總RNA。
2)cDNA第一鏈合成6微克總RNA，加反應液20微升，反應液是50毫摩爾氯化鉀和3毫摩爾氯化鎂混合液，10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液(Tris-HCl)pH8.3，1毫摩爾二硫蘇糖醇(DTT)，5微摩爾寡聚脫氧胸腺核苷酸(Oligod(T)17)，500微摩爾脫氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25單位RNA酶抑制劑，8單位AMV逆轉錄酶，42℃反應90分鐘，70℃ 10分鐘終止反應。
3)PCR反應鏈式聚合酶反應(PCR)試劑與條件首先將下列試劑混在一起
·10xTaq DNA聚合酶緩衝液5微升(μl)·模板cDNA 1μl·正向引物(1.25μg/μl)1μl·反向引物(1.25μg/μl)1μl·脫氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl·Taq DNA聚合酶0.25μl·滅菌水 37.75μl·總體積 50μl根據對蝦C-型凝集素的保守序列設計的引物為正向引物5』GGT GCA TTT TCT TGG ACG CCT-3』反向引物5』ATG GGA GTG AGT CTG TTG TTT-3』PCR反應條件為首先94℃變性2分鐘，然後進入下列循環94℃ 30秒，53℃ 45秒，72℃ 45秒，共進行30個循環，最後72℃延伸10分鐘。
4)反應產物純化利用德國奎因(QIAGEN)公司產品QIAquick Gel Extraction Kit，操作步驟按產品說明書進行。
5)對蝦C-型凝集素cDNA克隆取純化產物3微升，連接於pGEM-T Easy載體(Promega公司產品)。轉化到大腸桿菌DH5α菌株，在含有氨苄青黴素(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG0.1摩爾/毫升)的平板生長過夜，挑取3個白斑，在LB液體培養基(5毫升，含100微克/毫升安苄青黴素)中培養過夜。
6)質粒純化收取過夜培養菌液2毫升，離心(10000轉/分，1分鐘)收集細胞。用微量DNA純化試劑盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美國普洛麥格Promega公司)純化質粒，純化步驟按說明書進行。
7)序列測定與同源檢索取純化質粒4微升，用載體引物T7進行全自動測序(本工作在上海生工公司完成)。將所得序列與基因庫序列比較。
8)對蝦C-型凝集素cDNA 3』端快速擴增根據得到抗菌肽基因片段後，又設計一條特異性正向引物F35』-GTT TAC AAA TTTCCA AGT CCC TTC-3』，進行cDNA 3』端快速擴增，操作步驟按寶生物3』RACE試劑盒說明書進行。
取血細胞總RNA約20μg，其他試劑的調製和反應條件按說明書進行。用特異性引物F3與3』接頭進行3』端PCR擴增，採用55℃退火，其餘與上述的PCR擴增程序相同，對所得產物按前述方法進行克隆、驗證和測序。
9)對蝦C-型凝集素cDNA 5』端克隆按CLONTECH公司(美國)SMARTTMPCR cDNA文庫構建試劑盒說明書進行，包括下列步驟第一鏈cDNA合成1.0μl RNA樣品(0.05-1.0μg總RNA)
1.0μl SMART寡核苷酸(5』TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3』)1μlCDS/3』PCR引物2.0μl 水將上述試劑在0.5ml離心管內混勻，72℃孵育2分鐘。再冰浴2分鐘，然後加入下列試劑2.0μl 5x第一鏈緩衝液1.0μl DTT(20mM)1.0μl dNTP(10mM)1.0μl MMLV逆轉錄酶10μl 總體積混勻，42℃孵育1小時，冰浴終止反應。
以上述cDNA為模板，以試劑盒提供的5』PCR引物和反向引物5』TGT CCT TAC CCCTAC GAG CCC CTG 3』為引物進行PCR擴增，獲得對蝦C-型凝集素cDNA的5』序列。
將3』和5』端序列拼接，即獲得SEQ ID NO.1所示中國對蝦C-型凝集素基因全長核苷酸序列。
實施例2重組表達載體構建、表達與抑菌功能測定(1)根據中國對蝦C-型凝集素的序列和表達載體pPET30a(Novagen公司)的克隆位點，設計引物LEC-pet F5』AAT ATTGAA TTCATG AAG TTC CTG GCG CCG GTT 3』(EcoR1)LEC-pet R5』GCC CGACTC GAGTTA ATA ATT CTT GAG ACA AAT G 3』(Xhol)本發明選擇了pET30a克隆位點的EcoR I和Xho I酶切位點，因此，設計引物時在上遊引物引入了EcoR I酶切位點，下遊引物上引入了Xho I酶切位點。
(2)基因擴增、克隆與重組質粒篩選以pMD-18T-Lec為模板，用上述引物進行PCR反應，擴增條件為94℃，2min預變性；94℃，30s，56℃，45s，72℃，45s，35個循環；72℃延伸10min。
2％的瓊脂糖凝膠電泳PCR產物檢測。
將PCR產物作製備電泳，用UNIQ-5 Column DNA Gel Extraction Kit(上海生工產品)回收、純化PCR產物，經過EcoR I和Xho I內切酶酶切，切下兩端帶有Xho I和EcoR I內切酶位點的家蠅防禦素成熟肽cDNA片段，同樣表達載體pET30a經過EcoR I和Xho I內切酶酶切，暴露出多克隆位點兩端的Xho I和EcoR I內切酶位點。然後，將酶切後的擴增產物與表達載體用T4 DNA連接酶連接，轉化DH5α感受態細胞，LB+Amp平板PCR篩選陽性克隆。挑取PCR篩到的菌落，37℃振蕩擴增培養並抽提質粒，EcoR I和Xho I雙酶切與測序驗證後，即為重組表達質粒pET30a-Lec。接轉化E.coli表達菌株BL21 DE3感受態細胞，塗布LB+Amp平板，37℃倒置過夜培養。
(3)篩選表達菌株從上述LB+Amp平板上挑取8個單克隆菌落，2ml LB+Amp液體培養基37℃振蕩過夜培養，次日，取20μl過夜培養液加入到2ml LB+Amp液體培養基中轉培養，37℃振蕩培養3h，至OD600在0.5～0.7之間，然後加入IPTG至終濃度為1mmol，繼續37℃振蕩培養誘導表達4h。誘導前，隨機從一個樣品中取出0.5ml菌液，電泳檢測時作未誘導對照。
表達完後，各取0.5ml菌液，5000r/min離心5min收集細胞，包括未誘導的樣品，重懸於100μl去離子水中，以此為電泳樣品作12.5％的SDS-PGAE。根據電泳結果，鑑定表達菌株。
(5)重組C-型凝集素表達與純化挑取表達菌株單克隆在LB+Amp液體培養基中37℃過夜振蕩培養，次日，按照體積比1∶100加入到100ml LB+Amp培養基中轉培養，37℃振蕩培養3h後，再加入IPTG至終濃度為1mmol，再37℃振蕩誘導培養4h。誘導前取出0.5ml的菌液，作為誘導前對照樣品。誘導培養完後，菌液在合適的離心管中7000r/min離心10min收集細胞，細胞重懸於5ml預冷的1×PBS，加入50μl 20％的Triton X-100，充分混勻後冰浴30min。超聲波破碎細胞，超聲循環為超聲1s；間隔1s；全程40s。重複4次，每次間隙時將菌液在冰浴中混勻，避免局部溫度太高，使蛋白質變性。最後，將破碎後的菌液10000r/min離心15min，收集上清液和沉澱，上清液和沉澱分別留樣、備用。
重組蛋白以包含體的形式存在，以常規方法經過包含體純化、復性和親和層析，即獲得到了重組蛋白——重組C-型凝集素(見圖1)。
(6)重組蛋白活性測定活性鑑定採用液體生長抑制方法。
分別取測試菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌等單菌落(見表1)LB過夜培養液，用LB液體培養基稀釋到OD600＝0.01(約106左右)為測試菌液。取100μl測試菌液分別與10倍稀釋的重組C-型凝集素樣品混勻，於96孔培養板30℃振蕩培養，每隔1h用酶標儀測A630吸收值，用Microsoft Excel處理數據，繪製生長曲線圖，以氨苄青黴素和Elution Buffer為對照。
抑菌實驗結果其抗菌譜和最小抑菌濃度(以菌體不生長的濃度為最小抑菌濃度)見表1。
表1中國對蝦C-型凝集素最小抑菌濃度

序列表SEQ ID NO.1110山東大學120中國對蝦C-型凝集素基因及其編碼的C-型凝集素多肽與應用1412005-9-116022101211557212cDNA213對蝦(Fenneropenaeius chinensis)221中國對蝦C-型凝集素基因222(1)…(557)4001atgaagttcc tggcgccggt tattcttact acgttgatct ccgtcgctgc gtcagccagt 60gtccgtgcga ccgagtgccc ctccccctac gagcccctgg acgaaacgag gtgcattttc120ttggacgcct tcgtcagcta cacttggcaa gagacggttg acttgtgcaa gagccacggc180ggagaaatcc tgacaatcga ggactgcgag acgttcgccc ttgtctatga ctacatcagg240agccaggatg tcacgaaagg aaaacactac tggttaggag caaccgatga agtagaagaa300ggcacatgga aatttgtaaa caacagactc actcccatgg gcattcctta ctggggtgta360aacgagccta acaatgggaa tacctacaac tgcgctatga tgcatgctag ttataaccat420tattggtacg atgccgcgtg cggaagcaag tataacccca tttgtctcaa gaattattaa480aaagtgcatg ggcaagggag cactgtgata aaaggtacga cttggaaatg aagagacagc540taaaaaaaaa aaaaaaa 557SEQ ID NO.22102211159212PRT221中國對蝦C-型凝集素基因編碼的C-型凝集素多肽222(1)…(159)4002Met Lys Phe Leu Ala Pro Val Ile Leu Thr Thr Leu Ile Ser Val5 10 15
Ala Ala Ser Ala Ser Val Arg Ala Thr Glu Cys Pro Ser Pro Tyr20 25 30Glu Pro Leu Asp Glu Thr Arg Cys Ile Phe Leu Asp Ala Phe Val35 40 45Ser Tyr Thr Trp Gln Glu Thr Val Asp Leu Cys Lys Ser His Gly50 55 60Gly Glu Ile Leu Thr Ile Glu Asp Cys Glu Thr Phe Ala Leu Val65 70 75Tyr Asp Tyr Ile Arg Ser Gln Asp Val Thr Lys Gly Lys His Tyr80 85 90Trp Leu Gly Ala Thr Asp Glu Val Glu Glu Gly Thr Trp Lys Phe95 100 105Val Asn Asn Arg Leu Thr Pro MET Gly Ile Pro Tyr Trp Gly Val110 115 120Asn Glu Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Cys Ala Met Met His125 130 135Ala Ser Tyr Asn His Tyr Trp Tyr Asp Ala Ala Cys Gly Ser Lys140 145 150Tyr Asn Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr15權利要求
1.一種中國對蝦C-型凝集素基因，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其所示信息為(a)序列特徵*長度557鹼基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源對蝦(Fenneropenaeius chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgaagttcc tggcgccggt tattcttact acgttgatct ccgtcgctgc gtcagccagt 60gtccgtgcga ccgagtgccc ctccccctac gagcccctgg acgaaacgag gtgcattttc120ttggacgcct tcgtcagcta cacttggcaa gagacggttg acttgtgcaa gagccacggc180ggagaaatcc tgacaatcga ggactgcgag acgttcgccc ttgtctatga ctacatcagg240agccaggatg tcacgaaagg aaaacactac tggttaggag caaccgatga agtagaagaa300ggcacatgga aatttgtaaa caacagactc actcccatgg gcattcctta ctggggtgta360aacgagccta acaatgggaa tacctacaac tgcgctatga tgcatgctag ttataaccat420tattggtacg atgccgcgtg cggaagcaag tataacccca tttgtctcaa gaattattaa480aaagtgcatg ggcaagggag cactgtgata aaaggtacga cttggaaatg aagagacagc540taaaaaaaaa aaaaaaa 557
2.權利要求1所述中國對蝦C-型凝集素基因編碼的C-型凝集素多肽，它具有SEQ IDNO.2所示的胺基酸序列；其所示信息為(a)序列特徵*長度159胺基酸*類型胺基酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(c)序列描述SEQ ID NO.2Met Lys Phe Leu Ala Pro Val Ile Leu Thr Thr Leu Ile Ser Val5 10 15Ala Ala Ser Ala Ser Val Arg Ala Thr Glu Cys Pro Ser Pro Tyr20 25 30Glu Pro Leu Asp Glu Thr Arg Cys Ile Phe Leu Asp Ala Phe Val35 40 45Ser Tyr Thr Trp Gln Glu Thr Val Asp Leu Cys Lys Ser His G1y50 55 60Gly Glu Ile Leu Thr Ile Glu Asp Cys Glu Thr Phe Ala Leu Val65 70 75Tyr Asp Tyr Ile Arg Ser G1n Asp Val Thr Lys Gly Lys His Tyr80 85 90Trp Leu Gly Ala Thr Asp Glu Val Glu Glu Gly Thr Trp Lys Phe95 100 105Val Asn Asn Arg Leu Thr Pro MET G1y Ile Pro Tyr Trp Gly Val110 115 120Asn Glu Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Cys Ala Met Met His125 130 135Ala Ser Tyr Asn His Tyr Trp Tyr Asp Ala Ala Cys Gly Ser Lys140 145 150Tyr Asn Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr155
3.權利要求2所述SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列的變異體，它編碼具有少於8個胺基酸改變的同源變異蛋白，而且胺基酸改變是保守性胺基酸改變。
4.權利要求l所述中國對蝦C-型凝集素基因在製備具有抗菌活性的重組蛋白中的應用。
5.如權利要求4所述中國對蝦C-型凝集素基因在製備具有抗菌活性的重組蛋白中的應用，其方法是通過基因重組技術使所述基因在大腸桿菌、酵母和昆蟲核型多角體病毒中進行表達，獲得具有抗菌活性的重組蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種中國對蝦C－型凝集素基因及其編碼的C－型凝集素多肽，還公開了所述中國對蝦C－型凝集素基因在製備具有抗菌活性的重組蛋白中的應用。利用本發明獲得的重組的C－型凝集素可用於抗菌的飼料添加劑、食品保存、動植物基因轉化和藥物開發。
文檔編號C12P21/02GK1766109SQ20051004458
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月13日 優先權日2005年9月13日
發明者王金星, 趙小凡 申請人:山東大學