一種甘菊繁殖方法
2023-05-28 13:48:36 1
專利名稱：一種甘菊繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組織培養的方法，特別涉及甘菊離體培養和植株再生的方法，屬於植物組織培養領域。
背景技術：
甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)又名巖香菊，甘野菊，為菊科菊屬甘菊系多年生草本植物，是菊花(ChrysanthemumXmorifolium)起源的重要親本之一，具有較好的觀賞價值，屬於野生觀賞植物。其分布於我國多個省市，多生於海拔630-2300米的山坡、 巖石、河谷、河岸、荒地以及黃土丘陵地區。甘菊是一種較好的節水野生地被植物材料，具有抗逆性強、適用範圍廣、管理粗放等優點，適於山坡綠色、公路護坡、河提種植，可防止水土流失；也可用於公園、庭院，增加景觀的野趣性；可與郊野綠地及植物配景，可形成豔麗的綴花草坪，可給園林增添許多生機。 此外，甘菊為菊屬植物中的二倍體植物，倍性較低，是栽培菊花起源中參與起源且遺傳背景最為簡單的菊屬野生植物，適合用作菊科植物遺傳育種研究的模式植物。目前人們已經針對甘菊做了不少研究工作，其中包括甘菊栽培繁殖技術，再生及轉化體系，花發育基因的克隆、表達及功能驗證和抗逆性等多方面的研究，這些研究為將甘菊作為菊科植物研究的模式植物奠定了基礎。例如劉佔磊等人在2009年14期《安徽農業科學》上發表的甘菊遺傳轉化再生體系的建立，以甘菊無菌苗葉片為外植體，通過添加不同濃度的NAA和6-BA建立了甘菊遺傳轉化再生體系，在芽誘導培養基中添加0. lmg/L的NAA 和0. lmg/L 6-BA時再生頻率最高，可達98%，其不定芽生根率可達100%，該研究為進行甘菊轉基因試驗打下了基礎。又如北京林業大學的丁焱等人在2005年《中國觀賞園藝研究進展》上發表的甘菊再生體系的建立，以甘菊無菌苗葉片為外植體，誘導植株再生，建立再生體系，結果表明甘菊種子用0. 8%次氯酸鈉溶液20分鐘效果最好；切莖增殖用1/2MS+0. 5% 活性炭最好；誘導葉盤愈傷和分化採用MS+lmg/L6-BA+0. 2mg/L NAA最為迅速；生根培養中採用1/2MS+0. 1% NAA效果更好，生根的小苗在溫室裡生長良好。穩定的再生體系和遺傳轉化體系是對甘菊進行轉基因工作和分子遺傳學分析的基礎。通常，一個穩定、高效的再生體系必須具備以下條件(1)外植體的組織細胞具有再生愈傷組織和完整植株的能力；( 具有較高的芽分化率；C3)易於離體培養，具有高度可重複性；(4)體細胞無性系統變異小。雖然對甘菊再生體系的研究較多，但是迄今為止，甘菊穩定的再生體系始終未獲得。現有技術中以甘菊的葉片作為外植體雖然能夠建立甘菊的再生體系，但其再生時間較長，愈傷組織誘導率以及不定芽的分化率低，再生體系不夠穩定，重複及再現性差，從而不利於甘菊的規模化、工廠化生產及培育。
發明內容
本發明的首要目的是針對上述現有技術存在的問題提供一種愈傷組織誘導率高、 不定芽分化率高、生根率高及穩定的甘菊離體培養再生體系的建立方法。該方法可以在較短時間內形成大量優良的甘菊試管苗，可進行規模化、工廠化生產，可用於甘菊轉化體系研究，也可以用於分子育種研究。為實現上述目的，本發明一方面提供一種甘菊繁殖的方法，包括以下步驟1)將甘菊種子接種於種子萌發培養基上進行無菌幼苗培養，萌生為無菌幼苗；2)將無菌幼苗的下胚軸作為外植體，接種於愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，誘導生成愈傷組織；3)將誘導生成的愈傷組織接種於不定芽分化培養基上進行不定芽的誘導分化培養，培養得到不定芽；4)將不定芽接種於生根培養基上進行生根培養，誘導培養不定根，獲得生根苗；5)將生根苗進行煉苗、移栽，即得。其中，所述步驟1)中所述的種子萌發培養基是MS基本培養基+蔗糖30g/L+瓊脂 6g/L，pH 值為 6. 18。特別是，步驟1)中所述無菌幼苗為由種子萌發的子葉完全張開，真葉尚未展開的幼苗。其中，所述無菌幼苗的下胚軸長度為12_17mm。特別是，所述下胚軸為無菌幼苗子葉著生處到根尖的一端胚軸。其中，所述步驟幻中所述愈傷組織誘導培養基是MS基本培養基+2，4-二氯苯氧基乙酸0. 5-1. 5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0. 1-1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為6. 18。特別是，步驟幻中所述2，4-二氯苯氧基乙酸優選為lmg/L，6_苄氨基腺嘌呤優選為 0. 5mg/L。尤其是，步驟2~)中將下胚軸切成長度為3_5mm的下胚軸段後再接種，進行所述的愈傷組織誘導培養。其中，所述步驟幻中所述不定芽分化培養基是MS基本培養基+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為6. 18 ；所述步驟4)中所述生根培養基是大量元素減半的V2MS基本培養基 + 萘乙酸 0. 1-0. 3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 6. 18。特別是，步驟4)中所述萘乙酸優選為0. lmg/L。特別是，步驟1)中在所述接種之前先將甘菊種子在體積百分比濃度為70%的乙醇溶液中浸泡20-30s，用無菌水衝洗3-5次，再用體積百分比濃度為2. 5%的次氯酸鈉溶液消毒10-15min，用無菌水衝洗3_5次。其中，所述步驟1)中的無菌幼苗培養、步驟幻中愈傷組織誘導培養在以下條件下進行黑暗條件，培養溫度為22 士 1°C。特別是，步驟1)中所述無菌幼苗培養的培養條件為黑暗條件，培養溫度為 22士 1°C，培養時間為5-7天。尤其是，所述培養時間為6-7天，進一步優選為7天。特別是，步驟2、中所述愈傷組織誘導培養的培養條件為黑暗條件，培養溫度為 22 士 1°C，培養時間為14-16天。其中，步驟幻中不定芽誘導分化培養、步驟4)中生根培養在以下條件下進行培養溫度為22士 1°C，光照強度為20001x，光周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗。特別是，所述光周期優選為16小時光照/8小時黑暗。
特別是，步驟幻中所述在不定芽誘導分化培養過程中，每6-7天繼代培養一次，即不定芽誘導分化培養過程中，每6-7天將誘導分化培養的愈傷組織取出後，轉移至新鮮的不定芽分化培養基中繼續進行不定芽誘導分化培養，直到愈傷組織分化形成不定芽；也就是將愈傷組織在不定芽分化培養基中培養6-7天後，取出，接著將愈傷組織轉移到另一新鮮的不定芽分化培養基中培養6-7天後取出，重複操作4-5次，直到愈傷組織分化形成不定芽。尤其是，步驟幻中在所述不定芽誘導分化培養過程中，每7天繼代培養一次；繼代培養次數優選為4次。特別是，步驟幻中所述不定芽長度達到0.8-1. 2cm;步驟4)中所述不定根長度達到 0. 8-1. 2cm。步驟幻中所述的煉苗移栽包括如下順序進行的步驟移栽前打開培養瓶的瓶蓋， 在組培室中煉苗1天，接著將生根的試管苗取出，用自來水洗淨試管苗根部殘留的瓊脂培養基，然後移栽到甘菊無土栽培基質中培養，在溫度為20士 1°C，相對溼度為50-80%，光照強度為30001x，光照周期為16小時光照/8小時黑暗，培養一個月後，在溫度為20士 1°C，相對溼度為50-80%，光照強度為30001x，光照周期為12小時光照/12小時黑暗條件下培養至甘菊開花。特別是，所述的甘菊無土栽培基質為泥炭與蛭石混合基質，其中泥炭與蛭石的體積比為1 1。本發明的甘菊繁殖的方法具有以下優點1、本發明利用甘菊成熟種子進行高效離體繁殖，每個培養階段所採用的基本培養基的都是MS基本培養基(除生根培養基外，生根培養的基本培養基是1/2MQ，具有無機鹽濃度高，特別是硝酸鹽、鉀和銨的含量高，可以為組織生長提供所需礦質營養和促進愈傷組織生長，MS培養基的無機養分的數量和配比適當，不需額外添加胺基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機附加成分，節約了生產成本。2、本發明採用甘菊植物體上分化狀態較低的組織——下胚軸作為外植體，進行甘菊的繁殖，具有愈傷組織誘導率高、不定芽分化頻率高等優點，此外，採用下胚軸作為外植體進行甘菊繁殖所需要的時間更短，更有利於甘菊的大規模繁殖與栽培。3、本發明在愈傷組織誘導培養基中添加植物生長調節劑2，4- 二氯苯氧基乙酸和 6-苄氨基腺嘌呤，利於外植體愈傷組織的誘導、增殖，愈傷組織誘導率達到86. 63%，誘導形成的愈傷組織顏色為淡黃色，質地疏鬆，大小一致，愈傷組織生長狀態良好，分化能力強， 利於不定芽的分化。4、本發明在生根培養基大量元素減半的1/2MS基本培養基中添加植物生長調節劑萘乙酸，促進了不定芽誘導生根，生根率達到100%，根系健壯，生根數可達到5. 20-6. 89 條，根長達到2. 55-3. 34cm ；而且所形成的根系短粗，且根系上布滿根毛，為有效根，從而增加了根的吸收面積利於甘菊不定芽對營養成份的吸收。5、本發明的不定芽誘導分化培養過程中，每6-7天進行繼代轉瓶培養一次，降低了甘菊愈傷組織誘導不定芽分化培養過程中激素濃度，不定芽生長茁壯，分化效率高，達到 20. 25-25. 50%，無玻璃化等現象，平均每個外植體產生不定芽數達到3. 75-4. 25個。6、本發明對各種培養基的組成及含量進行優化，所使用的培養基中營養物質組成合理，用量和配比適宜，不僅甘菊離體培養效率高，而且還有效地抵制了不定芽玻璃化、褐化等不良影響，移栽成活率達到100%，利用本發明的再生體系甘菊培育結果重複性高，再生體系穩定，可以在短時間內形成大量優良的甘菊試管苗，有利於進行規模化、工廠化生產，建立的再生體系可用於甘菊轉化體系研究，也可以用於分子育種研究。
圖1是甘菊種子萌發形成的無菌幼苗；圖2是接種到愈傷誘導培養基培養甘菊下胚軸；圖3是甘菊下胚軸在黑暗條件下誘導生成的愈傷組織；圖4是甘菊愈傷組織轉移到光照條件下不定芽誘導過程中愈傷組織變化；圖5是甘菊下胚軸愈傷組織誘導產生的不定芽；圖6是甘菊不定芽誘導產生的不定根；圖7是移栽後的甘菊小苗；圖8是移栽後開花的甘菊。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。本發明實施例中所得數據採用Microsoft Excel 2007和SPSS17. 0軟體進行方差分析與多重比較(鄧肯式檢驗沖=0.01或？ = 0.05)，百分數經反正弦(y = arcsin x1/2) 轉換後再進行分析和比較。實施例1一、試驗材料1、甘菊種子於2009年秋季採自北京林業大學校園，採種植株生長良好，種子成熟飽滿，種皮完好。2、植物生長調節劑本發明中所使用的植物生長調節物質採用國產萘乙酸(NAA)、6_苄氨基腺嘌呤 (6-BA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。3、培養基的配製(1) "MS基本培養基」的組成或配製方法；表IMS 培養基(Murashige and Skoog, 1962)
權利要求
1.一種甘菊繁殖的方法，包括以下步驟1)將甘菊種子接種於種子萌發培養基上進行無菌幼苗培養，萌生為無菌幼苗；2)將無菌幼苗的下胚軸作為外植體，接種於愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，誘導生成愈傷組織；3)將誘導生成的愈傷組織接種於不定芽分化培養基上進行不定芽的誘導分化培養，培養得到不定芽；4)將不定芽接種於生根培養基上進行生根培養，誘導培養不定根，獲得生根苗；5)將生根苗進行煉苗、移栽，即得。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟1)中所述的種子萌發培養基是MS基本培養基+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為6. 18。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟幻中所述愈傷組織誘導培養基是:MS基本培養基+2，4_ 二氯苯氧基乙酸0. 5-1. 5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0. 1-1. Omg/L+蔗糖30g/L+ 瓊脂6g/L，pH值為6. 18。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟幻中所述不定芽分化培養基是:MS基本培養基+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為6. 18。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟4)中所述不定根誘導培養基是大量元素減半的1/2MS基本培養基+萘乙酸0. 1-0. 3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為6. 18。
6.如權利要求1所述方法，其特徵是步驟1)中所述接種之前先將甘菊種子在體積百分比濃度為70%的乙醇溶液中浸泡20-30s，用無菌水衝洗3-5次，再用體積百分比濃度為 2. 5%的次氯酸鈉溶液消毒10-15min，用無菌水衝洗3_5次。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟1)中所述無菌幼苗培養在以下條件下進行黑暗條件，培養溫度為22 士 1°C。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟幻中所述愈傷組織誘導培養在以下條件下進行黑暗條件，培養溫度為22 士 1°C。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟幻中不定芽分化培養、步驟4)生根培養在以下條件下進行培養溫度為22士 1°C，光照強度為20001x，光照周期為14-16小時光照 /8-10小時黑暗。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟幻中所述的煉苗移栽包括如下順序進行的步驟移栽前打開培養瓶的瓶蓋，在組培室中煉苗1天；然後將生根的小苗取出，用自來水洗淨試管苗根部殘留的瓊脂培養基，移栽到甘菊無土栽培基質中培養，在溫度為 20士 1°C、相對溼度為50-80%、光照強度為30001x、光照周期為16小時光照/8小時黑暗， 培養一個月；接著，在溫度為20士 1°C、相對溼度為50-80%、光照強度為30001x、光照周期為12小時光照/12小時黑暗條件下培養至甘菊開花。
全文摘要
本發明公開了一種甘菊繁殖的方法，包括以下步驟1)將甘菊種子接種於種子萌發培養基上進行無菌幼苗培養，萌生為無菌幼苗；2)將無菌幼苗的下胚軸作為外植體，接種於愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，誘導生成愈傷組織；3)將誘導生成的愈傷組織接種於不定芽分化培養基上進行不定芽的誘導分化培養，培養得到不定芽；4)將不定芽接種於生根培養基上進行生根培養，誘導培養不定根，獲得生根苗；5)將生根苗進行煉苗、移栽，即得。本發明方法建立的再生體系中愈傷組織誘導率達到86.63％、不定芽分化率達到25.5％，生根率達到100％，移栽成活率達到100％，可以在短期內形成大量優良的甘菊試管苗，可進行規模化、工廠化生產。
文檔編號A01H4/00GK102301952SQ201110201439
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月19日 優先權日2011年7月19日
發明者付建新, 戴思蘭 申請人:北京林業大學