一種超耐硒細菌對亞硒酸鹽的還原作用的研究方法與流程

2023-05-28 13:41:41

本發明屬於耐硒微生物技術領域，具體涉及一種超耐硒細菌對亞硒酸鈉的還原作用的研究方法。

背景技術：

硒是很多生物必需的微量元素，在生物體內，硒被合成為硒蛋白，有些硒蛋白具有抗氧化功能，同時，能夠防治一些癌症。硒在含量低時，對生物有益，在含量高時，對人類和動物有害，在人體必需微量元素中，硒從不足到產生毒性，範圍最窄。

在土壤中具有生物有效性的硒，主要以硒酸鹽和亞硒酸鹽形態存在，一些富硒地區的農業排水和半導體工業廢水是水體中水溶態硒(硒酸鹽/亞硒酸鹽)的主要來源，而無機硒對人體是有毒害的，因此，尋找一種解決將具有毒性的無機硒轉化為無毒或低毒的硒這一問題的方法至關重要。

目前已報導能夠將無機硒還原為單質硒的微生物有：嗜麥芽寡養單胞菌、芽孢桿菌、羅爾斯通菌、陶厄氏菌、脫硫微菌、超嗜熱古菌、根瘤菌、假單胞菌等，但是，對硒的耐受性都不是很高。關於賴氨酸芽孢桿菌的報導有：李婷等(2013)報告一株具有吸附功能的微生物固定化載體對間甲酚的降解。Hayat.et.al(2013)報告Lysinibacillus pakistanensis耐硼酸。Bahuguna.et.al(2011)報告從柴油汙染土壤中分離出的球形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sphaericus)能夠對二苯並噻吩產生脫硫作用。但是，關於硒的化合物對於賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus)毒性或影響的報導幾乎沒有。

微生物能將具有較強毒性的亞硒酸鹽或硒酸鹽還原，產生的紅色單質硒毒性降低且溶解度較小，可用於某些硒環境汙染的生物治理。近年來的實驗還發現，當粒徑在5-200nm時，紅色單質硒在生物補硒方面可能有很高的應用價值。

技術實現要素：

根據以上現有技術的不足，本發明所要解決的技術問題是提出一種超耐硒細菌對亞硒酸鹽的還原作用的研究方法，目的是通過微生物使亞硒酸鹽具有高還原率，使硒環境汙染進行生物治理。

為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案為：

一種超耐硒細菌對亞硒酸鈉的還原作用的研究方法，該方法包括如下步驟，

a、活化：將耐硒細菌純培養體接種於LB液體培養基，並置于振蕩培養箱中培養；

b、梯度脅迫培養：將步驟a得到的活化耐硒細菌接種於含亞硒酸鹽的量為0-25000mg·L-1的LB液體培養基中，之後置于振蕩培養箱中培養，該活化耐硒細菌的接種量為LB液體培養基體積分數的0.5％-1.5％；

c、活菌計數：取步驟b得到的耐硒細菌用無菌水稀釋105-107，之後取稀釋後的菌液塗布於LB固體培養基，然後在生化培養箱中恆溫培養後計數；

d、Se4+測定：將步驟a得到的活化耐硒細菌接種於含亞硒酸鹽的量為180-220mg·L-1的LB液體培養基中，該活化耐硒細菌的接種量為LB液體培養基體積分數的1％-2％，之後置于振蕩培養箱中培養，用分光光度計劃分時間間隔測菌液的吸光度值，繪製細菌的生長曲線；取振蕩培養後的菌液經離心分離，並用2,3-二氨基萘分光光度法測上清液中Se4+的濃度。

將步驟a培養的耐硒細菌接種於放置有含200mg·L-1亞硒酸鈉的LB液體培養基中，之後置于振蕩培養箱中培養，從第0h開始，每隔3h，用分光光度計測菌液的吸光度值，同時，用pH計測菌液pH值，耐硒細菌接種量為LB液體培養基體積分數的1％，培養基的量為25mL，振蕩培養箱的溫度為35℃，振蕩培養箱的轉速為180r·min-1，振蕩培養時間為30h，分光光度計的波長為600nm。

所述研究方法還包括還原產物的表徵步驟，還原產物的表徵方法包括取步驟a得到的活化耐硒細菌經離心、無菌磷酸鹽緩衝液清洗、無菌水清洗，然後用無菌水重懸菌液，之後取菌懸液觀察。

還原產物的表徵方法中所述活化耐硒細菌的量為0.8-1.2mL，菌懸液的量為1-3μL。

步驟a和步驟b中所述振蕩培養箱恆溫培養的溫度為35-37℃，轉速160-200r·min-1，培養時間為10-14h。優選的，振蕩培養箱恆溫培養的溫度為35℃，轉速180r·min-1。

步驟c中所述生化培養箱恆溫培養的溫度為36-38℃，培養時間24-72h。優選的，生化培養箱恆溫培養的溫度為37℃。

步驟a中耐硒細菌純培養體的製備方法包括：

(1)製備富硒土壤懸液；

(2)增菌培養：取步驟(1)製備的富硒土壤懸液加入到含濃度為100-200mg·L-1亞硒酸鹽的LB液體培養基中，並置于振蕩培養基中振蕩培養；

(3)繼代培養：將步驟(2)振蕩培養後的菌液接種於含濃度為100-200mg·L-1亞硒酸鹽的LB液體培養基中，菌液的接種量為該LB液體培養基總體積的3％-7％，之後置于振蕩培養箱中振蕩培養，如此重複3-5次；

(4)稀釋塗布平板：將步驟(3)得到的菌液用無菌水稀釋101-107倍，取稀釋105、106、107菌液塗布於含亞硒酸鹽的LB固體培養基上，置於生化培養箱中恆溫培養；

(5)平板劃線；取步驟(4)長出的單菌落結合平板劃線法接種於含100-200mg·L-1亞硒酸鹽的LB液體培養基中，之後置於生化培養箱中恆溫培養；

所述振蕩培養箱恆溫培養的溫度為35-37℃，轉速160-200r·min-1，培養時間為8-14h；步驟(4)和(5)中所述生化培養箱恆溫培養的溫度為36-38℃，培養時間24-72h。

所述超耐硒細菌為賴氨酸芽孢桿菌。

本發明有益效果是:本發明以天然富硒土壤為材料，從中分離篩選出兩株超耐硒細菌B1和B2，其中B1為Lysinibacillus xylanilyticus，B2為Lysinibacillus macroides，一方面，具有較強的亞硒酸鹽耐受性，亞硒酸鈉對超耐硒細菌-賴氨酸芽孢桿菌的半最大效應濃度分別約為10000、15000mg·L-1，另一方面，能夠將亞硒酸鈉還原為紅色單質硒，還原率分別達到99.91％和99.96％。本發明具有材料成本較低、實驗方法簡單和對環境無汙染的優點，同時，產生的納米級紅色單質硒對生物還能起到補硒作用。

附圖說明

下面對本說明書附圖所表達的內容及圖中的標記作簡要說明：

圖1是本發明的亞硒酸鈉對耐硒細菌的半最大效應濃度示意圖；

圖2是本發明的耐硒細菌還原亞硒酸鈉的動力學曲線圖；

圖3是本發明的耐硒細菌還原亞硒酸鈉過程中pH的變化圖；

圖4是本發明的耐硒細菌還原亞硒酸鈉的產物表徵圖；

其中,左上圖是B1的電鏡圖,右上圖是左上圖中箭頭部分的EDS圖，左下圖是B2的電鏡圖，左下圖是B2的電鏡圖，右下圖是左下圖中箭頭部分的EDS圖；

圖5是本發明的兩株超耐硒細菌總DNA、16S rDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；

圖6是本發明的兩株超耐硒細菌基於16S rDNA基因序列的系統發育樹；

圖7是本發明兩株超耐硒細菌分離、純化的形態圖；

圖8是本發明的兩株超耐硒細菌的革蘭氏染色結果圖。

具體實施方式

下面對照附圖，通過對實施例的描述，對本發明作進一步詳細的說明，以幫助本領域技術人員對本發明的發明構思、技術方案有更完整、準確和深入的理解。

一種超耐硒細菌對亞硒酸鈉的還原作用的研究方法，該方法包括如下步驟，

a.活化

將篩選得到的耐硒細菌純培養體接種於放置有LB液體培養基的錐形瓶中，接著將接種後的錐形瓶放置在振蕩培養箱中培養，培養基的量為25mL，振蕩培養箱的溫度為35℃，振蕩培養箱的轉速為180r·min-1，振蕩培養時間為12h；

其中耐硒細菌純培養體的篩選方法為：

(1)製備土壤樣品懸液

稱取2g富硒土壤樣品，加入放置有已滅菌的50mL磷酸鹽緩衝液的錐形瓶中，置于振蕩培養箱中振蕩，振蕩培養箱的溫度為25℃，轉速為180r·min-1，振蕩時間為30min，接著靜置30min，取30mL懸浮液於已滅菌的50mL離心管中，放置於離心機中離心，所述離心機的轉速為5000r·min-1，離心時間為10min，棄去上清液，再加入5mL磷酸鹽緩衝液以懸浮沉澱。

(2)增菌培養

取步驟(1)製備的土壤樣品懸液1mL，加入到放置有含Na2SeO3的LB液體培養基(酵母提取物5g·L-1，氯化鈉10g·L-1，胰蛋白腖10g·L-1，pH＝7.2)的錐形瓶中，Na2SeO3濃度為150mg·L-1，LB液體培養基的量為50mL，置于振蕩培養箱中振蕩培養，振蕩培養箱的溫度為35℃，轉速為180r·min-1，培養時間為10h。

(3)繼代培養

取步驟(2)菌液接種到放置有含Na2SeO3的LB液體培養基的錐形瓶中，菌液接種量為5％(體積分數)，Na2SeO3濃度為150mg·L-1，LB液體培養基的量為50mL，置于振蕩培養箱中振蕩培養，振蕩培養箱的溫度為35℃，轉速為180r·min-1，培養時間為10h；如此重複4次。

(4)稀釋塗布平板

將步驟(3)菌液用無菌水稀釋101-107倍，取105、106、107菌液塗布於含Na2SeO3的LB固體培養基上，置於生化培養箱中恆溫培養，塗布的菌液體積為100μL，Na2SeO3濃度為150mg·L-1，生化培養箱的溫度為37℃，培養時間為48h，結果如圖7(上)所示，菌斑顏色為紅色，菌體較溼潤，圓形邊緣，邊緣整齊，易挑取。

(5)平板劃線

用接種環挑取步驟(4)長出的單菌落，結合平板劃線法，接種於含Na2SeO3的LB固體培養基上，置於生化培養箱中恆溫培養，培養基成分及培養條件同步驟(4)，結果如圖7(下)所示，劃線結果表明，細菌單菌落形態規整。

(6)活化

用接種環挑取步驟(5)長出的單菌落，接種於放置有LB液體培養基的錐形瓶中，接著將接種後的錐形瓶放置在振蕩培養箱中培養，培養基的量為25mL，振蕩培養箱的溫度為35℃，振蕩培養箱的轉速為180r·min-1，振蕩培養時間為12h。

(7)革蘭氏染色

用接種環挑取步驟(5)長出的單菌落，結合平板劃線法，接種於LB固體培養基，置於生化培養箱中恆溫培養，挑取單菌落用於革蘭氏染色，在100倍油鏡下觀察細胞形態，選擇已知革蘭氏染色結果的金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)和大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)作為對照，生化培養箱的溫度為37℃，培養時間為20h，結果如圖8所示，結果表明B1和B2均為革蘭氏陽性桿菌。

(8)總DNA提取

根據步驟(7)結果，按革蘭氏陽性細菌處理，採用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取細菌總DNA，提取的DNA用1％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，4S green染色，λDNA/HindⅢ作為DNA Marker，結果如圖5(左)所示，結果表明，DNA片段大小在20000bp左右。

(9)16S rDNA基因擴增

將步驟(7)提取的細菌總DNA用細菌16S rDNA通用引物為序列號為SEQ ID NO.1的UF 5』-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3』(M為A或C)和序列號為SEQ ID NO.2的UR 5』-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3』對16S rDNA基因全長進行擴增，所述擴增的反應體系為30μl，包括dNTPs 2μL，10×buffer 3μL，Mg2+ 2μL，Tap酶1μL，引物各1μL，ddH2O 19μL，總DNA模板1μL，所述擴增的反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性45s，55℃退火4s，72℃延伸1.5min，30個循環；最後在72℃延伸10min，引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR擴增產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，4S green染色，DNA Marker-F作為Marker，結果如圖5(右)所示，結果顯示擴增產物特異性較好，目的條帶較明亮，條帶大小在1500bp左右，根據瓊脂糖凝膠電泳的結果，將PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，根據測序結果，將序列在http://www.ezbiocloud.net中進行同源性比對分析，根據比對分析結果，選取相似性最高(均大於96％)的前10個基因序列，使用ClustalX(1.83)軟體進行多重比對，比對結果使用MEGA5.10建立系統發育樹，以芽胞乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)作為外源菌，結果如圖6所示，B1和B2均屬於賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus)，其中，B1和Lysinibacillus xylanilyticus同源性可信度達到98％，B2和Lysinibacillus boronitolerans、Lysinibacillus macroides同源性可信度達到98％。

(10)耐低溫檢驗

取步驟a培養的菌液接種於放置有含Na2SeO3的LB液體培養基的錐形瓶中，接著將接種後的錐形瓶放置在振蕩培養箱中培養，Na2SeO3濃度為150mg·L-1，LB液體培養基的體積為25mL，振蕩培養箱的溫度為35℃，振蕩培養箱的轉速為180r·min-1，振蕩培養時間為12h，接著將菌液稀釋，稀釋倍數為101-106，然後取稀釋的106菌液塗布於含Na2SeO3的LB固體培養基上，置於4℃冰箱中恆溫培養，觀察菌落形態特徵，塗布的菌液量為100μL，所述Na2SeO3含量為150mg·L-1，所述培養時間為72h，結果如下表1所示，結果表明兩株細菌均能夠在4℃條件下生長，具有一定的耐低溫能力，根據Coorevits.et.al(2012)研究結果，確定B1為Lysinibacillus xylanilyticus，B2為Lysinibacillus macroides。

表1

b.梯度脅迫培養

將步驟a培養的耐硒細菌接種於放置有含亞硒酸鈉的LB液體培養基的錐形瓶中，接著將接種後的錐形瓶放置在振蕩培養箱中培養，其中LB液體培養基中含亞硒酸鈉的量為0、5000、10000、15000、20000、25000mg·L-1，耐硒細菌接種量為LB液體培養基體積分數的1％，培養基的量為25mL，振蕩培養箱的溫度為35℃，振蕩培養箱的轉速為180r·min-1，振蕩培養時間為12h。

c.活菌計數

取步驟b培養的耐硒細菌放置於滅菌的離心管中，加無菌水稀釋，菌液的稀釋倍數為105、106、107，接著取稀釋的菌液塗布於LB固體培養基上，菌液塗布的量為100μL，於生化培養箱中恆溫培養後計數，生化培養箱的溫度為37℃，培養時間為48h，如圖1所示，結果顯示，亞硒酸鈉對細菌B1和B2的半最大效應濃度分別約為10000、15000mg·L-1。

d.Se4+測定

將步驟a培養的耐硒細菌接種於放置有含200mg·L-1亞硒酸鈉的LB液體培養基的錐形瓶中，接著將接種後的錐形瓶放置在振蕩培養箱中培養，從第0h開始，每隔3h，用分光光度計測菌液的吸光度值，繪製細菌的生長曲線，同時，從錐形瓶中取1.5mL的菌液於滅菌的離心管中，放置於離心機中離心，取1mL上清液於新的滅菌的離心管中，放置於4℃冰箱保存，待所有取樣及樣品製備結束，用2,3-二氨基萘分光光度法測上清液中Se4+的濃度，耐硒細菌接種量為LB液體培養基體積分數的1.5％，培養基的量為150mL，振蕩培養箱的溫度為35℃，振蕩培養箱的轉速為180r·min-1，振蕩培養時間為36h，分光光度計的波長為600nm，離心機的轉速為10000r·min-1，離心機的離心時間為10min，如圖2所示，結果顯示，細菌B1和B2對亞硒酸鈉的還原率分別達到99.91％和99.96％；

e.pH測定

將步驟a培養的耐硒細菌接種於放置有含200mg·L-1亞硒酸鈉的LB液體培養基的錐形瓶中，接著將接種後的錐形瓶放置在振蕩培養箱中培養，從第0h開始，每隔3h，用分光光度計測菌液的吸光度值，同時，用pH計測菌液pH值，耐硒細菌接種量為LB液體培養基體積分數的1％，培養基的量為25mL，振蕩培養箱的溫度為35℃，振蕩培養箱的轉速為180r·min-1，振蕩培養時間為30h，分光光度計的波長為600nm，如圖3所示，結果顯示，在細菌B1和B2的生長過程中，pH逐步升高並趨於穩定。

f.還原產物表徵

取1mL步驟a培養的耐硒細菌的菌液於滅菌的離心管中，放置於離心機中離心，接著用無菌磷酸鹽緩衝液清洗，再用無菌水漂洗，然後用無菌水重懸菌液，接著取2μL菌懸液，滴在打磨光滑、清洗好的銅片上，置於空氣中乾燥，然後用掃描電鏡觀察，離心機的轉速為10000r·min-1，離心機的離心時間為10min，如圖4所示，其中,左上圖是B1的電鏡圖,右上圖是左上圖中箭頭部分的EDS圖，右上圖EDS圖中滿量程3715cts，光標0.000，左下圖是B2的電鏡圖，左下圖是B2的電鏡圖，右下圖是左下圖中箭頭部分的EDS圖，右下圖的EDS圖中滿量程5140cts，光標0.000；掃描電鏡結果發現，兩株細菌細胞內均可見膨大的芽胞結構，樣品中菌體周圍及外部存在高電子密度顆粒，對這些顆粒進行EDS(Energy Dispersive Spectroscopy)分析，在0～2keV出現了銅和硒的特徵吸收峰，其中銅為銅片的成分，另外，還原過程中伴有刺激性氣體生成，因此，Se4+被還原為納米級的紅色單質硒和揮發性的硒化物。

上面結合附圖對本發明進行了示例性描述，顯然本發明具體實現並不受上述方式的限制，只要採用了本發明的方法構思和技術方案進行的各種非實質性的改進，或未經改進將本發明的構思和技術方案直接應用於其它場合的，均在本發明的保護範圍之內。本發明的保護範圍應該以權利要求書所限定的保護範圍為準。