家蠅對ddvp抗藥性快速檢測的方法及試劑盒的製作方法

2023-05-28 09:46:56

專利名稱：家蠅對ddvp抗藥性快速檢測的方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種家蠅對有機磷殺蟲劑DDVP抗藥性的快速檢測方法及試劑盒，是利用生物化學的手段對家蠅抗藥性進行檢測。
背景技術：
目前，敵敵畏DDVP、殺螟硫磷、辛硫磷等有機磷殺蟲劑及各種復配劑被廣泛應用於防治林業和農業害蟲中；城市中園林綠地的害蟲防治及衛生害蟲防治的空間噴灑也是有機磷類殺蟲劑使用較多。在DDVP等有機磷殺蟲劑長期的選擇壓力下，大部分地區的家蠅對其產生了抗藥性，所以雖然用藥劑量逐漸加大，但防治效果普遍降低且對環境汙染嚴重。了解某地區家蠅的抗藥性情況可以規範殺蟲劑的使用，對抗藥性的治理和防治效率的提高有重要的指導作用和理論意義。目前對於家蠅抗藥性的檢測，有生物測定方法、生物化學方法、免疫學方法、分子生物學方法等多種方法，然而受技術水平和實驗儀器等限制，我國長期以來使用最多的還是傳統的點滴法、藥膜法等生物測定方法，具有較大的局限性。目前不論哪種測定方法，都需要花費較長時間，而且基本無法在現場進行快速檢測，對殺蟲劑使用的指導作用不夠及時。

發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於提供一種可在現場進行快速檢測的家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的方法，本發明的另一目的是提供一種家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的試劑盒。為實現上述目的，本發明家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的方法，具體為家蠅體內的乙醯膽鹼酯酶AChE作為DDVP的作用靶標，AChE能夠分解底物碘代硫化乙醯膽鹼ATCh為乙酸和碘化硫代膽鹼，利用該碘化硫代膽鹼與巰基顯色劑5，5-雙二硫代DNTB來進行顏色反應，生成黃色絡合物5-巰基-2-硝基苯甲酸；當AChE未被抑制即有抗性時，所述顏色反應顯示為黃色；當AChE被抑制即敏感時，所述顏色反應顯示為無色。進一步，所述方法的具體步驟為1)家蠅粗酶源樣品的製備將羽化後2-3日的家蠅成蟲置於-80°C超低溫冰箱內設定時間，用鑷子取其頭部放入離心管中，加入冰冷磷酸緩衝液，勻漿並離心處理後，取上清液作為酶源，保存備用；採用乙醯膽鹼脂酶AChE作為陽性對照反應，採用丙酮為陰性對照反應2)顏色反應分別取設定量的樣品於透明離心管內，加入DDVP丙酮溶液，充分混合、靜置，加入 Ellman溶液，均勻混合後靜置，依據AChE顏色反應原理，通過肉眼觀察反應液顏色變化情況；3)結果判讀
溶液顯黃色為抗性品系，說明家蠅AChE活性不能被該濃度DDVP抑制；溶液呈無色說明AChE活性被抑制，為敏感品系；同時陽性對照顯示黃色，陰性對照顯示無色。進一步，所述步驟1)中磷酸緩衝液濃度為25mmol/L，pH = 7. 4，含0. 1 %曲通-100。進一步，所述步驟1)中整個操作在冰上進行。進一步，所述家蠅的敏感品系的AChE抑制時，DDVP的濃度為0. 04mg/mL 0. 16mg/mL 之間。進一步，所述家蠅的敏感品系的AChE完全抑制時，DDVP的濃度為0. 08mg/mL。一種實施上述方法的家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的試劑盒，包括盒體和取液器， 其中盒體中設置有含0. 1 %曲通-100的25mmol/L磷酸緩衝液的PB緩衝液試劑瓶、含乙醯膽鹼ATCh的底物試劑瓶、含二硫雙對硝基苯甲酸的PB溶液顯色劑試劑瓶、含DDVP丙酮溶液的抑制劑試劑瓶、含0. 05mg/mL乙醯膽鹼脂酶AChE的陽性對照試劑瓶、含丙酮溶液的陰性對照試劑瓶。本發明通過檢測家蠅體內AChE被DDVP殺蟲劑作用後的活性，結合家蠅生物測定所確定的抗藥性水平，找出區分敏感品系與抗性品系的DDVP抑制濃度，從而利用生物化學發光方法，建立一種快速檢測家蠅對DDVP殺蟲劑抗藥性的方法。


圖1為DDVP對4種不同品系家蠅AChE的抑制曲線圖；圖2為不同濃度DDVP作用S家蠅AChE顯色反應結果顯示圖；圖3為不同濃度DDVP作用YF9家蠅AChE顯色反應結果顯示圖；圖4為不同濃度DDVP作用YF13家蠅AChE顯色反應結果顯示圖；圖5為不同濃度DDVP作用YF17家蠅AChE顯色反應結果顯示圖；圖6為快速檢測方法評價的結果顯示圖。
具體實施例方式下面，參考附圖，對本發明進行更全面的說明，附圖中示出了本發明的示例性實施例。然而，本發明可以體現為多種不同形式，並不應理解為局限於這裡敘述的示例性實施例。而是，提供這些實施例，從而使本發明全面和完整，並將本發明的範圍完全地傳達給本領域的普通技術人員。家蠅體內的乙醯膽鹼酯酶(AChE)是有機磷殺蟲劑的作用靶標。AChE在家蠅的神經系統中有十分重要的作用，它的生理功能是催化乙醯膽鹼(ACh)水解從而傳遞神經衝動。AChE對殺蟲劑不敏感，是家蠅對有機磷殺蟲劑產生抗藥性的重要機理之一。本發明依據的原理是AChE可以分解底物碘代硫化乙醯膽鹼(ATCh)為乙酸和碘化硫代膽鹼，後者與巰基顯色劑5，5-雙二硫代(2-硝基苯甲酸)(DNTB)反應，生成黃色絡合物5-巰基-2-硝基苯甲酸(5-TNBA)，通過測定反應體系吸光度的變化計算出AChE的活性。本發明通過檢測家蠅體內AChE被有機磷殺蟲劑作用後的活性，結合對家蠅生物測定結果所確定的抗藥性水平，從而找出區分敏感品系與抗性品系的DDVP抑制濃度(劑量)，建立起敏感品系與抗性品系家蠅快速檢測方法。
本發明利用酶標儀動力學方法，測定敏感品系、不同等級抗性品系家蠅AChE活力，以及AChE對DDVP的敏感性。確定了敏感與抗性品系家蠅AChE的活力沒有差別，而對 DDVP的敏感性卻有很大差別。以該結論為基礎，通過測定DDVP對敏感品系家蠅AChE完全抑制的最低濃度，得到區別敏感家蠅與抗性家蠅的DDVP區分濃度。採用生物化學發光的方法，建立一種快速檢測家蠅對有機磷殺蟲劑DDVP抗藥性的方法。一種實施本發明方法的家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的試劑盒，包括盒體和取液器，其中盒體中設置有含0. 曲通-100的25mmol/L磷酸緩衝液的PB緩衝液試劑瓶、含乙醯膽鹼ATCh的底物試劑瓶、含二硫雙對硝基苯甲酸的PB溶液顯色劑試劑瓶、含DDVP丙酮溶液的抑制劑試劑瓶、含0. 05mg/mL乙醯膽鹼脂酶AChE的陽性對照試劑瓶、含丙酮溶液的陰性對照試劑瓶。1家蠅粗酶源的製備將80頭羽化後2-3日的家蠅成蟲置於_80°C超低溫冰箱內30min，用鑷子取其頭部放入1. 5mL離心管中，加入ImL冰冷磷酸緩衝液(PB, 25mmol/L, pH = 7. 4，含0. 1 %曲通-100)，勻漿，整個操作在冰上進行。勻漿液於4°C 10000 X g離心2%iin，取上清液作為酶源，4°C下保存備用。2家蠅粗酶源的蛋白定量2.1標準曲線的製作取7個離心管，按表1平行操作。表1標準曲線用蛋白溶液配製方法
編號1234567
標準蛋白溶液(IaL)O 24681012
0. 15mol/LNaCl ( μ )20 18161412108
考馬斯亮藍試劑(mL)1 111111於混合均勻後分別加入酶標板，以1號為空白對照，20mi η內測定OD595Iim處光吸收值，重複兩次。以OD595Iim為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，繪製標準曲線。2. 2粗酶蛋白質濃度的測定取家蠅粗酶原液，用PB (25mmol/L, pH = 7. 4，含0. 1 %曲通-100)稀釋至10倍、 100倍、1000倍，按上文方法分別測定其OD595Iim值，使測定值在標準曲線範圍內。把得到的 OD595Iim值帶入繪製好的標準曲線，計算得出家蠅粗酶源蛋白質濃度(mg/mL)。3家蠅乙醯膽鹼酯酶活性的測定採用Ellman比色法測定家蠅乙醯膽鹼酯酶活性。取720 μ L Ellman溶液，加入 80 μ 1粗酶提取液，混勻後使用酶標儀於OD412Iim處比色，每隔30s讀數，連續測定!Min ；以加入PB(25mmol/L，pH = 7. 4，含0. 曲通-100)的Ellman溶液作為空白對照。每個結果
重複3次取平均值。根據公式1計算乙醯膽鹼酯酶活性 Γ π ^ FxMxlO6E =--(1)
vxKxLxC
式中E------酶活力(μ mol · mirT1 · ；V------反應體系的總體積(μ L)；ΔA------吸光度隨時間的變化率(mirT1)；ν------酶活力測定時所吸取的酶提取液體積(μ L)；K------黃色物質的消光係數(L · mirT1 · cnT1)；L------測定酶活力時溶液的光徑長度；C------勻漿液中蛋白質濃度(mg · πιΓ1)。4乙醯膽鹼酯酶DDVP抑制活性的測定將70 μ L粗酶提取液與20 μ L不同濃度的DDVP丙酮溶液分別混合，室溫放置 2min，按3所述方法測定乙醯膽鹼酯酶的剩餘活力，以丙酮代替DDVP丙酮溶液作為對照。每個結果重複3次取平均值。在此基礎上根據公式( 計算AChE活性的抑制率
抑制率(%)=Ει~Ε° χ100%(2)
E0式中E1------加入殺蟲劑後的酶抑制活性；E0------未加殺蟲劑時的酶活性。以DDVP濃度的對數為橫坐標，AChE活力抑制率為縱坐標，計算求得線性回歸方程，進一步計算出抑制AChE50%活力時的DDVP濃度的對數，其反對數即為抑制中濃度
(I 50) °5家蠅對DDVP抗藥性快速檢測方法的建立按上述方法製備S敏感(抗性係數1. 0)、YF9 (抗性係數2. 6)、Y13 (抗性係數11. 4) 及YF17(抗性係數19. 3)四種不同品系家蠅粗酶提取液。分別取70 μ L粗酶於透明離心管內，以70 μ L0. 05mg/mL的AChE為陽性對照，以70 μ L丙酮為陰性對照，再分別與20 μ L — 定濃度的DDVP丙酮溶液充分混合，靜置2min，加入630 μ L Ellman溶液，均勻混合後靜置 15min,依據AChE顏色反應原理，通過肉眼觀察反應液顏色變化情況。溶液顯黃色說明家蠅 AChE活性不能被該濃度DDVP抑制，溶液呈無色說明AChE活性被抑制。 6家蠅對DDVP抗藥性快速檢測方法的評價利用5建立的方法對野外種群家蠅進行DDVP抗藥性評價。以0. 08mg/mLDDVP為區分劑量，以抗性品系YF17為陽性對照，以敏感品系家蠅S為陰性對照，測定抗性係數為4. 61 的野外家蠅YY的顏色反應結果。結果與分析1、不同品系家蠅粗酶含量及AChE活性的比較4個品系家蠅羽化後2-3天的粗酶含量及AChE活性變化見表2。結果發現敏感品系家蠅與各抗性汰選株的粗酶蛋白含量及AChE活性的差異均無統計學意義(P >0.05)即抗藥性的上升並非酶蛋白含量增加或活性增高造成的。由此可以表明，使用DDVP汰選抗藥性的家蠅，在20倍抗性係數內，家蠅AChE含量與活性大小與其抗藥性的產生無關。表2不同品系家蠅粗酶蛋白含量及AChE活性情況
權利要求
1.家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的方法，其特徵在於，該方法具體為家蠅體內的乙醯膽鹼酯酶AChE作為DDVP的作用靶標，AChE能夠分解底物碘代硫化乙醯膽鹼ATCh為乙酸和碘化硫代膽鹼，利用該碘化硫代膽鹼與巰基顯色劑5，5-雙二硫代DNTB來進行顏色反應， 生成黃色絡合物5-巰基-2-硝基苯甲酸；當AChE未被抑制即有抗性時，所述顏色反應顯示為黃色；當AChE被抑制即敏感時，所述顏色反應顯示為無色。
2.如權利要求1所述的家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的方法，其特徵在於，所述方法的具體步驟為1)家蠅粗酶源樣品的製備將羽化後2-3日的家蠅成蟲置於-80°C超低溫冰箱內設定時間，用鑷子取其頭部放入離心管中，加入冰冷磷酸緩衝液，勻漿並離心處理後，取上清液作為酶源，保存備用；採用乙醯膽鹼脂酶AChE作為陽性對照反應，採用丙酮為陰性對照反應2)顏色反應分別取設定量的樣品於透明離心管內，加入DDVP丙酮溶液，充分混合、靜置，加入 Ellman溶液，均勻混合後靜置，依據AChE顏色反應原理，通過肉眼觀察反應液顏色變化情況；3)結果判讀溶液顯黃色為抗性品系，說明家蠅AChE活性不能被該濃度DDVP抑制；溶液呈無色說明 AChE活性被抑制，為敏感品系；同時陽性對照顯示黃色，陰性對照顯示無色。
3.如權利要求2所述的家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的方法，其特徵在於，所述步驟1) 中磷酸緩衝液濃度為25mmol/L，pH= 7. 4，含0. 曲通-100。
4.如權利要求2所述的家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的方法，其特徵在於，所述步驟1) 中整個操作在冰上進行。
5.如權利要求2所述的家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的方法，其特徵在於，所述家蠅的敏感品系的AChE抑制時，DDVP的濃度為0. 04mg/mL 0. 16mg/mL之間。
6.如權利要求5所述的家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的方法，其特徵在於，所述家蠅的敏感品系的AChE完全抑制時，DDVP的濃度為0. 08mg/mL。
7.一種實施如權利要求1所述方法的家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的試劑盒，包括盒體和取液器，其中盒體中設置有含0. 曲通-100的25mmol/L磷酸緩衝液的PB緩衝液試劑瓶、含乙醯膽鹼ATCh的底物試劑瓶、含二硫雙對硝基苯甲酸的PB溶液顯色劑試劑瓶、含 DDVP丙酮溶液的抑制劑試劑瓶、含0. 05mg/mL乙醯膽鹼脂酶AChE的陽性對照試劑瓶、含丙酮溶液的陰性對照試劑瓶。
全文摘要
本發明公開了一種家蠅對DDVP抗藥性快速檢測的方法及試劑盒，該方法具體為家蠅體內的乙醯膽鹼酯酶AChE作為DDVP的作用靶標，AChE能夠分解底物碘代硫化乙醯膽鹼ATCh為乙酸和碘化硫代膽鹼，利用該碘化硫代膽鹼與巰基顯色劑5,5-雙二硫代DNTB來進行顏色反應，生成黃色絡合物5-巰基-2-硝基苯甲酸；當AChE未被抑制即有抗性時，所述顏色反應顯示為黃色；當AChE被抑制即敏感時，所述顏色反應顯示為無色。本發明通過檢測家蠅體內AChE被DDVP殺蟲劑作用後的活性，結合家蠅生物測定所確定的抗藥性水平，找出區分敏感品系與抗性品系的DDVP抑制濃度，從而利用生物化學發光方法，建立一種快速檢測家蠅對DDVP殺蟲劑抗藥性的方法。
文檔編號G01N21/78GK102401797SQ20111040732
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者孫宏迪, 張曉龍, 曹曉梅, 楊振洲 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院