光誘導的棉花花色素合成調控基因GhMYBAP及其應用的製作方法
2023-05-28 11:17:06
專利名稱：光誘導的棉花花色素合成調控基因GhMYBAP及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程領域，具體涉及一種促進棉花及其他植物花色素合成和累積的基因。本發明還涉及該基因編碼的多肽，含有該基因的表達載體，以及該基因在促進植物花色素合成和積累中的應用。
背景技術：
花色素是一類重要的植物非光合色素。它在自然界植物中廣泛存在，是給植物葉、 花和果實著色的主要色素。花色素主要在植物細胞的液泡中積累，具水溶性，在PH或其它因素的作用下，可使植物呈現從粉紅到紫色的變化。花色素同時是一種重要的抗氧化物質， 廣泛用於保健、食品等行業。正因為如此，色彩不僅在園藝觀賞植物中至關重要，在糧食、纖維、蔬菜、水果等作物中也是重要的品質性狀。利用基因工程技術，在植物中激活花色素合成，獲得有色的植物產品，有著廣闊的應用前景。高等植物的花色素合成屬於苯丙烷途徑的一個支路，從苯丙氨酸到最終產物花色素苷是一個由多步生化反應組成的複雜生物合成途徑。每步反應均由不同結構基因編碼的酶催化。遺傳學證據表明，植物花色素合成主要受I 2R3-MYB、WD40和bHLH三類轉錄因子調控。這些轉錄因子相互作用形成複合體結合到結構基因啟動子上，激活花色素生物合成途徑中一個或多個結構基因的表達，從而促進花色素在植物體內的合成和累積，使植物器官或組織顯色。相對於bHLH和WD40蛋白，R2R3-MYB蛋白專一性更強，一般調控花色素合成的 Ii2R3-MTO蛋白只參與花色素合成的調控，而bHLH和WD40則可能同時參與其他生理過程(如原花色素合成和表皮毛決定等)的調控。因此，I^2R3-MYB蛋白及其編碼基因在植物花色素合成中具有中心調控作用。前期研究中，我們發現強光照能誘導棉花葉片和莖合成花色素(圖1)。本發明利用同源克隆的方法從棉花葉片中克隆了一個I^2R3-MYB蛋白基因(GhMYBAP，Gossypium hirsutum anthocyanin promoting MYB)。表達分析表明GhMYBAP基因的表達受強光誘導， 可能與莖葉中光誘導的花色素合成相關(圖1)。轉基因研究表明，該基因的上調表達能夠促進菸草和棉花體內的花色素合成和累積，使相應的器官和組織顯紅色(圖4、5和6)。 GhMYBAP基因的克隆和功能驗證為棉花與其他植物的花色素基因工程調控奠定了基礎，利用棉花纖維特異啟動子控制該基因的表達有可能在棉花纖維中特異合成和累積花色素，從而創建轉基因的彩色棉。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種促進植物花色素合成和累積的基因。本發明的另一個目的是提供上述基因編碼的蛋白質。本發明的再一個目的是提供含有上述基因的表達載體。本發明的進一步目的是提供上述基因在農業、林業作物育種中的應用，用於獲得具高含量花色素的植物材料，改良植物產品的營養價值和外觀品質。
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根據本發明的一個方面，本發明採用基因工程技術，分離出一種促進植物花色素合成和累積的棉花花色素合成調控基因GhMYBAP，來源於棉花(Gossypium hirsutum)，其具有如SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。此外，與SEQ ID NO. 1所示的DNA序列具有80%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列也屬於本發明的範圍。根據本發明的另一方面，一種由上述基因GhMYBAP編碼的蛋白質，其為如SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。此外，將SEQ ID NO. 2的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID N0. 2的胺基酸序列相同生物活性的由SEQ ID N0. 2衍生的蛋白質也屬於本發明的範圍。SEQ ID NO. 1所示的DNA序列由835個鹼基組成，編碼序列表中由251個胺基酸殘基組成的蛋白質序列SEQ ID N0. 2。根據本發明的另一方面，本發明還提供包含上述基因的重組載體，以及包含上述重組載體的宿主細胞。所述重組載體是至少含有上述一種或多種基因以及組成型或組織特異型啟動子的植物表達載體。在一種實施方式中，將SEQ IDN0. 1基因的cDNA構建在 CaMV35S啟動子下遊，得到植物表達載體(其結構如圖3所示)或者用組織特異型啟動子替換CaMV35S啟動子而得到的植物表達載體。進一步地，通過所述植物表達載體轉染宿主而獲得的轉化體也屬於本發明的範圍。將本發明的植物表達載體利用電擊法和凍融法等方法轉化農桿菌即會得到含有該表達載體的農桿菌菌株。本發明還提供了所述新基因GhMYBAP在促進植物中花色素的合成和積累中的應用，典型地是用於改良植物產品的營養價值和外觀品質。通過對轉基因菸草和轉基因棉花的分析，發現超量表達GhMYBAP基因能夠促進花色素的合成和累積，花色素含量顯著提高， 相應的組織器官呈現紅色(圖4、5和6)。因此該基因的表達可能在轉基因植物的組織器官中激活花色素合成，從而獲得具高含量花色素的植物材料，改良植物產品的營養價值和外觀品質。這對於農業、林業中培養優良的作物品種具有重要意義。
圖1 棉花花色素合成和GhMYBAP基因表達的光誘導特性A、B和C分別為陽光直射處理(L-S)和未處理(L-W)葉片的顏色變化、花色素 (Anthocyanin)含量和GhMYBAP基因表達的變化。D、E和F分別為陽光直射(S-S)和蔭蔽 (S-W)莖段的顏色變化、花色素含量和GhMYBAP基因表達的變化。用比色法檢測花色素含量 (Q = (A530-O. 25 X A657) XM—1，其中M為稱取的葉片鮮重)。用定量RT-PCR方法檢測GhMYBAP 基因的相對表達水平(REL, relative expression level)。圖2 組成型啟動子CaMV35S調控下的棉花GhMYBAP基因表達載體的構建流程圖NPTII 新黴素磷酸轉移酶基因；⑶S β -葡萄糖酸苷酶基因；CaMV 35S 來源於花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動子；NosTer :Nos終止子。用於構建植物表達載體的骨架載體為pBI121，具有CaMV 35S啟動子調控下的NPTII基因，便於在植物遺傳轉化的過程中對轉化子進行卡那黴素(Kan)抗性的篩選。圖3 組成型啟動子CaMV35S調控下的棉花GhMYBAP基因表達載體的結構示意圖
圖4 超量表達GhMYBAP基因促進菸草的花色素合成A，野生型(WT)和GhMYBAP超量表達(AP-5)菸草的葉片；B，4個GhMYBAP超量表達菸草植株(AP-1，-3，-5和-7)和野生型葉片的花色素含量(Q = (A530-O. 25XA657) XM-1， 其中M為稱取的葉片鮮重)；C，4個GhMYBAP超量表達菸草植株(AP-1，-3，-5和-7)和野生型葉片中GhMYBAP基因的相對表達水平(REL，relative expression level)。圖5 超量表達GhMYBAP基因特異促進菸草花色素途徑的結構基因的表達用定量RT-PCR方法比較了 GhMYBAP超量表達(AP_5)和野生型(WT)菸草葉片中的花色素途徑結構基因的相對表達水平(REL，relative expressionlevel) 0發現屬於花色素合成支路的查兒酮合成酶(OB)、查兒酮異構酶(CHI)、類黃酮3-羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)和花色素合成酶(ANQ基因在超量表達植株中顯著上調；而屬於苯丙烷途徑共有的苯丙氨酸氨解酶(PAL)和香豆酸輔酶A連接酶(4CL)基因在超量表達植株中的表達量比野生型低。圖6 超量表達GhMYBAP基因促進棉花的花色素合成A，非轉基因(WT)和GhMYBAP超量表達(GAP-5)的棉花愈傷組織；B，3個GhMYBAP 超量表達愈傷細胞系(GAP-2，-3和-5)和非轉基因棉花愈傷中GhMYBAP基因的相對表達水平(REL，relative expression level) ；C，3 個 GhMYBAP 超量表達愈傷細胞系(GAP-2，-3 和-5)和非轉基因棉花愈傷的花色素含量⑴=(A530-O. 25XA657) XM—1，其中M為稱取的愈傷組織鮮重)。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明進行進一步的詳細說明，但以下說明並不對本發明進行限定，任何對本發明的變形和改變，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明所附權利要求所定義的範圍。本發明實例中的試劑藥品未做具體說明的均為普通市售，材料方法未做具體說明的均參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell，2001)。在本發明的下述實例中，所用的棉花實驗材料為冀棉14號(Gossypiumhirsutum CV Jimian 14)，來自來自河北農業大學棉花遺傳育種研究所。所用的菸草實驗材料為 Nicotiana tabacum cv Samsun，為西南大學生物技術中心保存。實施例一GhMYBAP基因序列的克隆
1、CTAB法提取棉花RNA 選取約0. 5g新鮮棉花材料，在液氮中迅速磨成精細粉末，裝入IOmL離心管，加入 4mL 65°C預熱的 RNA 提取液2% CTAB (ff/V) ,2% PVP (W/V)，IOOmmol/L Tris-HCl (ρΗ8. 0)，
0.5g/L Spermidine，2. Omol/L NaCl，2%巰基乙醇(V/V，使用前加入)，顛倒混勻。65°C水浴3 IOmin,期間混勻2 3次。等體積氯仿異戊醇(24 1)抽提2次(12，000r/min, 室溫，5min)。取上清，加入1/4體積1 Omol/L LiCl溶液，4°C放置2h。12，000r/min，4°C離心 lOmin，棄上清，用 400μ L SSTElmol/L NaCl,0. 5% SDS (ff/V), IOmmo 1/L Tris_HClpH8. 0，
1.Ommol/L EDTA溶解沉澱。以酸飽和酚(pH 4.5)氯仿異戊醇Q5 24 1)和氯仿異戊醇04 1)各抽提1次(12，000r/min，室溫，5min)。加2倍體積的無水乙醇， 在_70°C冰箱沉澱30min以上。12，000r/min，4°C離心lOmin，棄上清。沉澱用70%的酒精漂洗一次，風乾。加200 μ L的DEPC處理水溶解。用非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。2、cDNA合成和GhMYBAP基因cDNA序列的PCR擴增根據擬南芥、矮牽牛、金魚草等植物的花色素調控相關Ii2R3-MTO蛋白的同源序列設計簡併引物 MYBAP-D (5，-AACGATGTTAARAAYTAYTGGAA-3，，R = A 或 G，Y = C 或 T， SEQ ID NO. 3)。用3' -RACE的方法擴增棉花GhMYBAP基因的cDNA 3'-末端序列。根據3 『-末端序列設計兩個反向的巢式引物MYBAP-Rl (5，-GTCACTTACTATCAA TGAC-3，， SEQ ID NO. 4)和 MYBAP-R2(5，-CTGGCTATGGGTTGAACAC-3，，SEQ ID NO. 5)，用 Y-RACE 方法擴增獲得GhMYBAP基因的cDNA 5'-末端序列。最後用根據ATG上遊序列設計正向引物 MYBAP-F (5『-CACCAAGCTAG CAAGCTAAC-3，，SEQ IDN0. 6)，與下遊引物一起擴增獲得 GhMYBAP 基因的全長編碼序列。具體方法如下(1) 一鏈 cDNA 合成及 3 『 -RACE 擴增從背面被陽光直射處理(見實施例二)的葉片中提取總RNA。取約2 μ g葉片總 RNA為模板，用簡併引物MYBAP-D和3 『 -RACE試劑盒(TaKaRa)提供的3 『 -site引物擴增獲得棉花(ΛΜΥΒΑΡ基因的cDNA 3 『-末端序列。操作步驟按3 『 -RACE試劑盒(TaKaRa) 說明書進行。(2) Y-RACE 擴增取20 μ g葉片總RNA用cDNA合成試劑盒(TaKaRa)合成雙鏈cDNA，並將cDNA末端平端化。具體操作均按cDNA試劑盒(TaKaRa)說明書進行。取100 μ mol/L 的接頭長鏈(5，-CGGTAGGATCCCGCAGAACGACGGCCAG-3，，SEQ ID NO. 7)和接頭短鏈(5，-pCTGGCCGTCCAAGACGC-3',SEQ ID NO. 8)各 2 μ L，加入 2 μ L 10 X 退火緩衝液(lmol/L NaCl, 100mmol/LTris-HCl, 10mmol/L EDTA)和 16 μ L 蒸餾水，65°C水浴 lOmin，緩慢冷卻至室溫，即獲得接頭。 取接頭和雙鏈cDNA建立如下連接體系10 X T4DNA 連接緩衝液1 μ L雙鏈cDNA2 μ L接頭2 μ LT4DNA 連接酶1 μ L_用雙蒸水補足體積至10 μ L的連接體系16°C連接12h，70°C滅活lOmin。擴增第一步為線性擴增，25 μ L體系中含1 μ L連接產物，1 XPCR Buffer, 200 μ mol/L dNTPs, 1. 5mmol/L MgCl2, 200nmol/L 特異引物 MYBAP-Rl，IU TaqDNA 聚合酶(在94°C預變性時加入)。溫度循環參數為94°C預變性5min ;94°C，30S，56°C，30S， 72°C，2min30S，40個循環。取1 μ L線性擴增產物進行第二步指數擴增，除引物為接頭引物 (5 『 -CGGTAGGATCCCGCAGAAC-3 『, SEQ ID Ν0. 9)和特異引物 MYBAP-R2 外，反應體系中其他成分同線性擴增。反應擴增25 35個循環後，72°C延伸lOmin。(3)全長cDNA的擴增25 μ L 體系中含 1 μ L—鏈 cDNA，IXPCR Buffer, 200 μ mol/L dNTPs, 1. 5mmol/LMgCl2，各 200nmol/L 引物 MYBAP-F 和 MYBAP-R1，1U Taq DNA 聚合酶(在 94°C預變性時加 Λ )。溫度循環參數為，94°C 預變性 5min ；94°C，30s, 56 V，30s, 72°C，lmin30s, 35 個循環； 最後72°C延伸IOmin03、擴增片段回收，連接，大腸桿菌轉化(1)電泳和回收將擴增產物在1.2% (W/V)瓊脂糖凝膠中進行電泳分離。將目的條帶從凝膠上切下，用DNA回收試劑盒(Bioflux)回收純化目的片段，回收步驟按照試劑盒說明書進行。回收片段在瓊脂糖凝膠上電泳定量。(2)克隆和測序回收的片段經瓊脂糖凝膠電泳定量。按試劑盒說明書，通過回收片段與克隆載體的連接、連接產物的大腸桿菌轉化、陽性菌落的培養和質粒酶切驗證，將回收片段克隆到 PMD19-T(TaKaRa)載體上。回收的片段與pMD19-T (TaKaRa)載體建立如下連接體系10 X T4DNA 連接緩衝液1 μ L載體DNA片段IyL外源連接產物DNA片段IyLT4DNA 連接酶1 μ L_用雙蒸水補足體積至10 μ L的連接體系載體DNA與外源片段DNA片段摩爾比為1 3，16°C連接12h。之後將連接產物轉化大腸桿菌Dffia。挑白色菌落培養，提質粒酶切驗證。正確克隆寄上海英俊公司進行序列測定。最終獲得棉花GhMYBAP基因的cDNA序列(SEQID NO. 1)。實施例二棉花花色素合成和GhMYBAP基因表達的光誘導特性檢測在正常生長的棉花植株上選擇剛剛展開的葉片，從中間翻折使半片葉片的葉背面朝上，並用曲別針固定，在晴天由陽光直射葉片背面處理3天。取下葉片分別用直射處理和未處理的半片葉進行花色素含量測定和基因表達分析。在大田種植的棉田裡，選取上部被陽光直射的枝條和下部蔭蔽的枝條比較花色素含量和GhMYBAP基因的表達分析。採用比色法測定葉片的花色素含量。取0.2g葉片，切成小塊裝入1.5mL離心管中，加入ImL酸化甲醇(1%鹽酸，80%甲醇)，室溫提取1 至材料無紅色。常溫下離心12000g, 3min。取0. 2mL,測定530nm與657nm下的吸光值(A530和A657)。總花色素Q = (A530-O. 25XA657) XM—1，其中M為稱取的植物組織的鮮重。用CTAB方法(見實施例一)提取棉花莖段和葉片的總RNA。以這些總RNA反轉錄的單鏈cDNA為模板進行定量PCR分析。用定量RT-PCR方法分析轉基因植株中目的基因的表達。GhMYBAP 基因用引物 MYBAP-F(SEQ IDN0. 4)和 MYBAP-Rl (SEQ ID NO. 6)擴增，用棉花 Histone 基因做內標，引物為 His-up (5，-GAAGCTGCAGAGGCATACC-3，，SEQ ID NO. 10)和 His-down(5，-CTACCACTACCATCATGGC-3，，SEQ ID NO. 11)。反轉錄和定量 PCR 分析均採用 TaKaRa公司的STO Green RT-PCR分析試劑盒在iCycle定量PCR儀上完成。按試劑盒和儀器說明書進行各步具體操作。用測得的GhMYBAP基因與Histone的起始拷貝數的比值表示目的基因GhMYBAP的相對表達水平。檢測結果顯示，經陽光直射處理(L-S)的葉片的顏色呈現紅色，花色素的含量高， GhMYBAP基因的相對表達水平高；而未經處理(L-W)的葉片的顏色呈綠色，花色素的含量低，GhMYBAP基因的相對表達水平低(圖1，A-C)；，經陽光直射處理(S-S)的莖段的顏色完全呈紅色，花色素的含量高，GhMYBAP基因的相對表達水平高；而蔭蔽(S-W)的莖段的顏色完全呈綠色，花色素的含量很低，GhMYBAP基因的相對表達水平很低(圖1，D-F)。實施例三超量表達載體的構建和菸草遺傳轉化1、超量表達載體的構建pMD19-GhMYBAP載體在克隆GhMYBAP基因時構建，其上的GhMYBAP片段已測序。為了在轉基因植物中超量表達GhMYBAP基因，需要GhMYBAP將基因正向插入植物表達載體中， 並用適當的啟動子啟動表達。為此我們根據pMD19-GhMYBAP載體上的酶切位點和GhMYBAP 的插入方向以及植物表達載體(PBI121)上的多克隆位點和CaMV 35S啟動子的方向，設計了如圖2所示的載體構建路線。根據這個植物表達載體構建路線，構建了超量表達GhMYBAP 基因的植物表達載體pBIl21-GhMYBAP (圖3)。2、菸草遺傳轉化用電激法將構建的植物表達載體質粒導入農桿菌LBA4404和菸草遺傳轉化。參考Bio-RAD MicroPulser用戶說明書，將上述載體通過電激轉化法導入農桿菌 LBA4404。上述的植物表達載體通過農桿菌介導葉盤感染的方法導入菸草。轉化用培養基及配方見表1。具體方法如下菸草種子用的次氯酸鈉消毒後，在MSB基本培養基上萌發，培養條件為25V、 16hr光照/Shr黑暗的光周期。約一個月後生長健壯的無菌苗即可用作轉化外植體。採用農桿菌介導的葉盤轉化法。含植物表達載體的農桿菌菌株接種於液體YEB， 280C 200rpm搖床培養過夜，從已搖好的菌液中重新吸取1 2mL於20 25mL液體YEB中再次活化。待菌液搖至0D600約為0. 8時，取出用YEB稀釋到OD6tltl值為0. 05 0. 2備用。表1 根癌農桿菌介導的菸草遺傳轉化用培養基
權利要求
1.一種分離的棉花花色素合成調控基因GhMYBAP，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
2.由權利要求1所述的基因編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.含有權利要求1所述的基因的表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特徵在於，所述表達載體至少含有權利要求1所述的基因和植物組成型或組織特異性啟動子。
5.根據權利要求3所述的表達載體，其具有如圖3所示的結構。
6.含有權利要求3所述的表達載體的宿主細胞。
7.權利要求1所述的基因在促進植物花色素合成和累積中的應用。
8.權利要求1所述的基因在農作物、林木育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種從棉花中克隆的受光誘導的花色素合成調控基因GhMYBAP，在植物中表達該基因可以促進轉基因棉花和其他植物體內花色素的合成和累積。應用該基因及其植物表達載體可以培育高花色素含量的植物品系(種)、提高植物產品的營養價值和外觀品質。
文檔編號C12N15/29GK102154314SQ20111002078
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月18日 優先權日2011年1月18日
發明者侯磊, 宋水清, 張瑞芝, 李德謀, 羅明, 肖月華, 裴炎 申請人:西南大學