培育高脂質含量葡萄藻新品系的方法

2023-05-28 15:25:41 1

專利名稱：培育高脂質含量葡萄藻新品系的方法
技術領域：
本發明屬於能源微藻一葡萄藻開發利用的技術，特別涉及一種培育高脂質含量葡萄藻新品系的方法。
背景技術：
葡萄藻(Botryococcus)屬綠藻門(Chlorophyta)、共球藻綱(Chlorophceae)、綠球藻目(Chlorococcales),葡萄藻科(Botryococcaeae),是一種世界廣布的能源微藻。該屬中的葡萄藻(Botryococcus braunii)因脂質含量通常為其細胞乾重的25-35%,普遍高於小球藻等其它微藻，且脂質的組成和結構與化石原油的也最為相近，而被譽為「油藻」，以其生產航空燃油等高品質燃料一直是近年來全球生物能源領域的研發熱點之一 [Metzger& Largeau.Botryococcus brauni1: a rich source for hydrocarbons and relatedether lipids.Appl Microbiol Biotechnol.2005，66: 486 - 496; Sakamoto, et al.0ptimization of light for growth, photosynthesis, and hydrocarbon productionby the colonial microalga Botryococcus braunii BOT-22.Bioresource Technology.2012，110: 474 479.]。種子工程是農業與生物產業的基礎，選育優良種質的重要性不僅在螺旋藻、小球藻等經濟微藻的產業化進程中得到了充分體現，在推進水稻、小麥、玉米等農作物高產、優質、低成本生產中更是表現得淋漓盡致。值得指出的是，有關葡萄藻優良種質選育雖已受到國內外的高度重視，但在葡萄藻遺傳育種研究方面迄今近乎空白，而從自然界分離藻株的適應性差、脂質產率低等問題，也正是制約著葡萄藻至今尚未能得到商業化開發應用的主要瓶頸。因此， 迫切需要運用誘發突變等現代育種技術，對從自然界分離獲得的葡萄藻種進行遺傳改良，顯著提高其對人工培養條件的適應性、生長速率及含脂量，這對實現葡萄藻的低成本工業化培殖並以之生產品質和價格等均能與化石燃油相競爭的生物燃油，推進葡萄藻制油的產業化進程，具有重要意義。目前，開展高脂質含量葡萄藻新品系選育主要面臨著以下兩方面的技術難題:1、葡萄藻呈由幾十至幾百個細胞聚集而成的集落狀，其誘變頻率及突變體篩選效率遠低於小球藻等呈單細胞態的微藻；2、還沒有建立適於篩選高脂質含量突變體的選擇壓力，只能先將藻液塗於平板分離培養，再將大量的克隆逐一接種到培養液擴大培養後再進行脂質測定，因而篩選的工作量大、效率低、成功率小。因此，迫切需要建立一種簡便、高效、高通量的培育高脂質含量葡萄藻新品系的方法。

發明內容
本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，建立一種培育高脂質含量葡萄藻新品系的方法。為解決技術問題，本發明的解決方案是:提供一種培育高脂質含量葡萄藻新品系的方法，該方法是:將葡萄藻液置於離心管，加入微粒型的黃單胞多糖，然後置於冰水浴中，並用超聲波將由幾十至上百個細胞形成的葡萄藻集落製備成單細胞；單細胞化的葡萄藻經低熔點瓊脂糖固定及6tlCo-Y射線誘變處理後，利用尼羅紅顯微螢光活體篩檢技術獲得高脂質含量的葡萄藻候選突變體；再經擴大培養和脂質含量測定等選育出高脂質含量的葡萄藻新品系；所述的低熔點瓊脂糖是指在多糖鏈上引入羥乙基後的瓊脂糖(低熔點瓊脂糖系常用的生物培養與分子操作實驗素材，其熔點約為65°C，比普通瓊脂糖的熔點低30°C左右);所述的高脂質含量的葡萄藻是指脂質含量比其出發品系至少高30%的葡萄藻。本發明具體包括以下步驟:(I)取4 mL待測葡萄藻液於5 mL離心管中，再加入微粒型黃單胞多糖，並置於冰水浴中預冷；微粒型黃單胞多糖的添加量為5粒,0.2 mg/粒,共I mg ；(2)預冷藻液經超聲波處理10 s後，在光學顯微鏡下觀察葡萄藻集落是否已被分散成單細胞；(3)若沒有，則用每次5 s的超聲波進行多次處理，直至被分散成單細胞，由此計算被測葡萄藻液適宜的超聲處理時間T=10+5Xn，單位為S，其中η為每超聲處理5 s的次數；(4)將製得的葡萄藻單細胞用培養液稀釋至560 nm的光密度D56tl為0.05後，轉Λ10 ml的PE管中，每管裝4 ml，並置於37°C水浴中保溫；(5)固定並用6tlCo-Y射線輻照誘變處理後，置於25°C光照培養箱中培養；(6)將含藻細胞的低熔點瓊脂糖凝膠切成I mm厚的圓片，並置於含2%(V/V) 二甲基亞碸和I Pg/mL尼羅紅的染色液中於黑暗下40°C染色10 min ；同時，按上述步驟製備對照組，其中省去步驟(5)中用6tlCo-Y射線誘變處理藻細胞；(7)取I片染色後的對照組藻細胞的凝膠片並展到載玻片上，置於螢光顯微鏡上用藍光激發，通過調節螢光顯微鏡上藍色激發光電流調控旋鈕調節激發光強度直至能看到具紅色螢光的葡萄藻細胞，再通過調節螢光顯微鏡上藍色激發光電流調控旋鈕逐漸調低激發光的強度，至顯微視野中藻細胞的螢光剛好消失，記下電流表上表徵此時藍色激發光強度的電流值I，繼續調節藍色激發光電流調控旋鈕使電流表的電流值降至21/3，保持此時旋鈕的位置不變；(8)將經Y射線誘變的藻細胞的凝膠片用尼羅紅染色後展到載玻片上，並置於螢光顯微鏡上用調節好光強度的藍光激發，當觀察到具紅色螢光的藻細胞時，用接種針挑取相應的凝膠塊，並置於含I ml培養液的2 ml PE管中，用頻率為20 kHz、發射功率為100W、以I s / I s的開/關間歇的超聲波處理20 s以粉碎凝膠塊，再置於25°C光照培養箱中培養25 d，即可獲得高脂質含量的葡萄藻新品系。本發明中，在步驟(2)或(3)中製備葡萄藻單細胞時，設定超聲波儀的頻率為20kHz，發射功率為100 W，將Φ2型變幅杆前端2 cm浸入預冷藻液，以I s / I s的開/關間歇超聲處理15 25 S。本發明中，在步驟(5)中，誘變方法為用劑量率為2.5 Gy/min、劑量為80 Gy的60Co-Y射線輻照，再避光3 h。

本發明中，在步驟(6)中，使用與藻液等體積的濃度為2%、65°C的低熔點瓊脂糖來固定藻細胞；所述的低熔點瓊脂糖是指在多糖鏈上引入羥乙基後的瓊脂糖，它的熔點約為65°C ,比普通瓊脂糖(agarose)的低30°C左右。
與現有技術相比，本發明的顯著優點:本發明方法與傳統選育方法相比，具有簡便、高效，且可實現高通量篩檢等優點，可為葡萄藻育種等提供必要的技術方法。
具體實施例方式為提高誘變育種的誘變頻率及突變體的有效篩選率，通常需將誘變材料單細胞化。本方法用適當功率超聲波處理將細胞呈集落狀的葡萄藻製備成單細胞。為減少超聲波對藻細胞的機械損傷，本方法於超聲處理前在藻液中加入少量黃單胞多糖(Xanthan gum),利用其能在藻細胞表面形成膜狀物，且可使超聲波能量傳遞變得更加平緩等特性，而達到了良好效果。Y射線是一種高效的物理誘因子，它能使生物的遺傳物質DNA發生變異。同時，尼羅紅(9_ (diethylamino) benzo [a]phenoxazin_5 (5H) -one)是一類親脂性的卩惡嗪類染料，進入藻細胞後能與胞內脂質結合併發出特異波長的螢光，且螢光強度與脂質含量呈正相關，因而可利用螢光顯微鏡觀測藻細胞的螢光強度，篩選出脂量含量比出發品系的至少高30%的新品系。在實際篩選中，可通過調節螢光顯微鏡上激發光強度的電流調控旋鈕使未經誘變處理的藻細胞(即出發品系)的螢光剛消失，此時表徵藍色激發光強度的電流為I，繼續調節藍色激發光電流調控旋鈕使表徵藍色激發光強度的電流降至21/3，在此條件下，只有含脂量比出發品系的至少高30%的藻細胞才能見有螢光，且螢光越亮即意謂藻細胞的脂質含量越高，將具螢光的藻細胞挑選出來後經進一步培養與檢測，即可獲得高脂質含量的突變體。本方法比傳統方法更簡便、高效，且可實現高通量篩檢。下面通過具體實施例子，對本發明的實現方式進行詳細描述。本發明的技術方案可以通過以下步驟實現:1、選用樣本材料:以公知的葡萄藻品系UTEX 572 (保藏單位:CultureCollection of Algae at the University of Texas at Austin ;地址:The Universityof Texas at Austi n, The Culture Collection of Algae (UTEX), 205 ff.24th St.StopA6700, Austin, TX 78712-1240，USA)為材料，這株品系是實驗室常用的葡萄藻，在發明人所在的浙江大學原子核農業科學研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存，可隨時提供樣本。2、試劑和儀器:本發明中所用的微粒型黃單胞多糖(Xanthan gum,約0.2 mg/粒)、尼羅紅(NR)、二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide, DMS0)、低熔點瓊脂糖(low meltingagarose)均為美國Sigma公司產品；微粒型黃單胞多糖是指用造粒-乾燥設備先將黃單胞多糖等物料製成大小均勻的圓球體顆粒、再進行乾燥而獲得的微粒狀劑型，其單粒重可通過調整工藝參數進行調控。JY92-1I型超聲波發生儀由寧波新芝生物科技股份有限公司生產；Ultrospec 2000型紫外可見分光光度計為美國Pharmacia公司產品；TE214S型電子天平為北京賽多利斯產品；6°Co-Y射線輻照裝置由浙江大學研製；CFM-330型螢光顯微鏡為上海長方光學儀器有限公司產品。3、培育高脂質含量葡萄藻新品系的方法的主要步驟如下:(I)取4 mL待測光密度值的葡萄藻液於5 mL離心管中，再加入5粒(約I mg)微粒型黃單胞多糖(Xanthan gum),並置於冰水浴中預冷；(2)設定超聲波儀的頻率為20 kHz，發射功率為100 W，將Φ2型變幅杆前端2 cm浸入步驟(I)的預冷藻液，以I S / I S (開/關)間歇超聲10 S後，用玻璃吸管取約10μ 藻液在光學顯微鏡下觀察葡萄藻集落是否已被分散成單細胞；(3)若葡萄藻集落未被分散成單細胞，則按步驟(2)中的方法再超聲處理5 S，再用光學顯微鏡下觀察是否已被分散成單細胞；(4)重複步驟(3)，直至將葡萄藻集落分散成單細胞，由此可計算被測葡萄藻液適宜的超聲處理時間Τ=10+5*η，單位為S，其中η為每超聲處理5 s的次數；(5)將製得的葡萄藻單細胞用培養液稀釋至560 nm的光密度(D56tl)S 0.05後，轉Λ10 ml的PE管中，每管裝4 ml，並置於37°C水浴中保溫；(6)各PE管中加入65°C濃度為2%的低熔點瓊脂糖4 ml，迅速蓋好蓋並巔倒混勻後，豎直置於試管架上；(7)用劑量率為2.5 Gy/min的6°Co_ Y射線輻照32 min,再避光3 h以阻止DNA損傷光修復，並置於25°C光照培養箱中培養25 d ；(8)用手術刀和手術剪小心切開PE管，取出圓柱形的低熔點瓊脂糖凝膠，用手術刀切成約I mm厚的圓片，並置於含2%(V/V) 二甲基亞碸和I Pg/mL尼羅紅的染色液中於黑暗下40°C染色10 min ；同時，按上述步驟製備 對照組，其中省去步驟(5)中用6tlCo-Y射線誘變處理藻細胞；(9)取I片染色後的對照組藻細胞的凝膠片並展到載玻片上，置於螢光顯微鏡上用藍光激發，通過調節螢光顯微鏡上藍色激發光電流調控旋鈕調節激發光強度直至能看到具紅色螢光的葡萄藻細胞，再通過調節螢光顯微鏡上藍色激發光電流調控旋鈕逐漸調低激發光的強度，至顯微視野中藻細胞的螢光剛好消失，記下電流表上表徵此時藍色激發光強度的電流值I，繼續調節藍色激發光電流調控旋鈕使電流表的電流值降至21/3，保持此時旋鈕的位置不變；(10)將經Y射線誘變的藻細胞的凝膠片用尼羅紅染色後展到載玻片上，並置於螢光顯微鏡上用調節好光強度的藍光激發，當觀察到具紅色螢光的藻細胞時，用接種針挑取相應的凝膠塊，並置於含I ml培養液的2 ml PE管中，用頻率為20 kHz、發射功率為100W、以I s / I s的開/關間歇的超聲波處理20 s以粉碎凝膠塊，再置於25°C光照培養箱中培養25 d，即可獲得高脂質含量的葡萄藻新品系。4、結果與分析根據實驗結果，葡萄藻品系UTEX 572藻液在含0.25%。黃單胞多糖(Xanthan gum)的情況下，經20 s (n=2)超聲處理，由幾十至上百個細胞形成的集落可被分散成單細胞。這種單細胞化的葡萄藻用低熔點瓊脂糖固定後，經劑量為80 Gy的6tlCo-Y射線輻照誘變，並利用尼羅紅顯微螢光活體篩檢等技術，篩選到I株高脂質含量的葡萄藻新品系。經擴大培養和脂質含量測定[按Rao等(Influence of CO2 on growth and hydrocarbon productionin Botryococcus brauni1.J.Microbiol.Biotechnol.2007, 17: 414 - 419)乾重稱量法進行]，此新品系的脂質含量為細胞乾重的48.2%，比其出發品系UTEX 572的高48%。作為實例，我們另選取公知的2株脂質含量分別為32.6%和28.8%的葡萄藻品系UTEX 2441和UTEX B2629來驗證本發明的實用性。利用本發明方法，UTEX 2441和UTEXB2629分別經15 s和25 s超聲處理，即可製得單細胞，經低溶點瓊脂糖固定及劑量率為2.5Gy/min、劑量為80 Gy的6tlCo-γ射線輻照誘變，利用尼羅紅顯微螢光活體篩檢技術，分別選育出I株含脂量比UTEX 2441的高37%，以及I株含脂量比UTEX Β2629的高54%的高脂質含量葡萄藻新品系。這些例子進一步說明，本發明建立的培育高脂質含量葡萄藻新品系的方法是有效和實用的。·
權利要求
1.一種培育高脂質含量葡萄藻新品系的方法，其特徵在於，該方法是:將葡萄藻液置於離心管，加入微粒型的黃單胞多糖，然後置於冰水浴中，並用超聲波將由幾十至上百個細胞形成的葡萄藻集落製備成單細胞；單細胞化的葡萄藻經低熔點瓊脂糖固定及6tlCo-Y射線誘變處理後，利用尼羅紅顯微螢光活體篩檢技術獲得高脂質含量的葡萄藻候選突變體；再經擴大培養和脂質含量測定選育出高脂質含量的葡萄藻新品系；所述的低熔點瓊脂糖是指在多糖鏈上引入羥乙基後的瓊脂糖；所述的高脂質含量的葡萄藻是指脂質含量比其出發品系至少高30%的葡萄藻。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，具體包括以下步驟: (1)取4mL待測葡萄藻液於5 mL離心管中，再加入微粒型黃單胞多糖，並置於冰水浴中預冷；微粒型黃單胞多糖的添加量為5粒,0.2 mg/粒,共I mg ； (2)預冷藻液經超聲波處理10s後，在光學顯微鏡下觀察葡萄藻集落是否已被分散成單細胞； (3)若沒有，則用每次5s的超聲波進行多次處理，直至被分散成單細胞，由此計算被測葡萄藻液適宜的超聲處理時間T=10+5Xn，單位為S，其中η為每超聲處理5 s的次數； (4)將製得的葡萄藻單細胞用培養液稀釋至560nm的光密度D56tl為0.05後，轉入10ml的PE管中，每管裝4 ml，並置於37°C水浴中保溫； (5)固定並用6tlCo-Y射線輻照誘變處理後，置於25°C光照培養箱中培養； (6)將含藻細胞的低熔點瓊脂糖凝膠切成Imm厚的圓片，並置於含2%(V/V) 二甲基亞碸和I Pg/mL尼羅紅的染色液中於黑暗下40°C染色10 min ； 同時，按上述步驟製備對照組，其中省去步驟(5)中用6tlCo-Y射線誘變處理藻細胞； (7)取I片染色後的對照組藻細胞的凝膠片並展到載玻片上，置於螢光顯微鏡上用藍光激發，通過調節螢光顯微鏡上藍色激發光電流調控旋鈕調節激發光強度直至能看到具紅色螢光的葡萄藻細胞，再通過調節螢光顯微鏡上藍色激發光電流調控旋鈕逐漸調低激發光的強度，至顯微視野中藻細胞的螢光剛好消失，記下電流表上表徵此時藍色激發光強度的電流值I，繼續調節藍色激發光電流調控旋鈕使電流表的電流值降至21/3，保持此時旋鈕的位置不變； (9)將經Y射線誘變的藻細胞的凝膠片用尼羅紅染色後展到載玻片上，並置於螢光顯微鏡上用調節好光強度的藍光激發，當觀察到具紅色螢光的藻細胞時，用接種針挑取相應的凝膠塊，並置於含I ml培養液的2 ml PE管中，用頻率為20 kHz、發射功率為100 W、以I s / I s的開/關間歇的超聲波處理20 s以粉碎凝膠塊，再置於25°C光照培養箱中培養25 d，即可獲得高脂質含量的葡萄藻新品系。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，在步驟(2)或(3)中製備葡萄藻單細胞時，設定超聲波儀的頻率為20 kHz，發射功率為100 W，將Φ2型變幅杆前端2 cm浸入預冷藻液，以I s / I s的開/關間歇超聲處理15 25 S。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，在步驟(5)中，誘變方法為用劑量率為2.5Gy/min、劑量為80 Gy的60Co- Y射線輻照，再避光3 h。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，在步驟(6)中，使用與藻液等體積的濃度為2%、65°C的低熔點瓊脂糖來固定藻細胞。
全文摘要
本發明涉及葡萄藻開發利用，旨在提供一種培育高脂質含量葡萄藻新品系的方法。該方法是向葡萄藻液中加入微粒型的黃單胞多糖，置於冰水浴中用超聲波將葡萄藻集落製備成單細胞；經低熔點瓊脂糖固定及60Co-γ射線誘變處理後，利用尼羅紅顯微螢光活體篩檢技術獲得高脂質含量的葡萄藻候選突變體；再經擴大培養和脂質含量測定選育出高脂質含量的葡萄藻新品系。本發明方法與傳統選育方法相比，具有簡便、高效，且可實現高通量篩檢等優點，可為葡萄藻育種等提供必要的技術方法。
文檔編號C12N13/00GK103146679SQ20131006697
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月3日 優先權日2013年3月3日
發明者汪志平, 劉新穎, 於金鑫, 馬麗芳, 陳子元 申請人:浙江大學