一種利用小孢根黴少孢變種降解玉米赤黴烯酮的方法與流程

2023-09-16 03:36:50

本發明屬於微生物降級技術領域，更具體涉及一種利用小孢根黴少孢變種降解玉米赤黴烯酮的方法。

技術背景

黴菌毒素是產玉米、小麥等穀物上生長繁殖過程中產生的次級代謝產物。我國常見的幾種黴菌毒素和對動物危害比較嚴重的黴菌毒素有：玉米赤黴烯酮(zea)、嘔吐毒素、黃麴黴毒素b1、伏馬毒素、赭麴黴毒素以及t-2毒素。飼料中黴菌毒素的汙染及其危害是全球性的問題，在我國南方大部分地區夏天炎熱潮溼，對於黴菌的生長提供了有利條件。所以在我國南方地區受黴菌毒素的汙染十分嚴重。而我國對於黴菌毒素產毒條件的控制不足，黴菌毒素的汙染對食品和飼料生產造成損失十分巨大，已經成為阻礙我國農業發展的難題之一。黴菌毒素降低飼料的營養價值，影響飼料的適口性，黴菌毒素沉積的含量過高引發畜禽的毒性反應，降低動物的採食量和飼料的轉化率，減緩畜禽的生長速度，破壞畜禽免疫力和抵抗力。影響動物的生長發育和繁殖能力，甚至增加畜禽的死亡率，造成器官壞死，貧血和抑制細胞中遺傳信息的傳遞，幹擾遺傳物質dna、rna的合成，進而幹擾蛋白質的合成，對人和畜禽產生毒害。

zea，又稱為f-2毒素，是一類具有類雌激素作用的2,4二經基苯甲酸內醋化合物。玉米、小麥、燕麥和大麥等作物易受到玉米赤黴稀酮汙染。zea為白色晶體溶點161-163℃，溶於鹼性溶液、甲醇、乙醚、乙醇和苯等，不溶於水，zea具有熱穩定性，在詞料加工過程中不易被分解。zea具有很強的生殖毒性和免疫毒性。尤其母豬對zea最敏感。影響母豬孕酮的分泌和子宮的功能。降低黃體生成素。由於玉米赤黴烯酮對育種的家畜和家禽危害很大，常常可以導致一個育種基地一年內恢復不到原有的水平，而且造成大面積的品質下降。因此，對玉米赤黴烯酮的毒害作用應給予積極防治，減少畜產品的損失。另一方面，可以利用玉米赤黴烯酮在農作物生產方面的調控作用，開發出高產高質的新產品。

現在飼料工業中採取添加黴菌毒素的吸附劑，以降低攝入畜禽體內黴菌毒素的作用。其中效果好的有活性炭和一些高聚合物(比如蒙脫石)等，現在使用較多的是一些非金屬無機礦物和有幾聚糖，如矽鋁酸鹽(因為其良好的電負性)和不同來源的寡聚糖(因為其巨大的表面積和眾多的化學鍵)，但是有其負面效應；其次是沸石，沸石具有良好的選擇吸附、陽離子交換、催化激活、耐酸、熱穩定性和分子篩等物理化學性質和功能特性，包括飼料工業在內的許多領域中得到廣泛應用，但是效果都不太明顯。現階段對於黴菌毒素的脫毒分為物理脫毒和化學處理法，都有不同程度的缺陷，而本製備方法通過微生物對飼料原料的發酵來降解黴菌毒素的沉積。從飼料製備的根本上解決這一難題，有很大的幫助。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種利用小孢根黴少孢變種降解玉米赤黴烯酮的方法，使用該方法可用於降解各種飼料中汙染玉米赤黴烯酮，並且製備及應用方法簡單，操作方便、成本低廉，為動物飼料降解玉米赤黴烯酮提供了有效方法，該黴菌容易生長和培養，並且能高密度發酵、提高飼料的營養成分、減少黴菌毒素的含量。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種利用小孢根黴少孢變種降解玉米赤黴烯酮的方法，步驟如下：

a.將小孢根黴少孢變種(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)活化培養：用無菌吸管吸取滅菌pbs緩衝液，滴入放有小孢根黴少孢變種凍乾粉的安瓿管內，pbs緩衝液與小孢根黴少孢變種凍乾粉的用量比例為0.2～0.5ml：2g，輕輕振蕩，使凍幹小孢根黴少孢變種菌體溶解呈懸浮狀；

b.擴大培養：將步驟a中活化後的菌種接種於121℃高壓溼熱滅菌後冷卻至30-40℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂pda培養基中擴大培養，28℃，72小時培養至對數生長期；

所述pda培養基按照下列比例組成：馬鈴薯浸出粉5.0g；葡萄糖20g；瓊脂14g在室溫25℃中ph值為5.6±0.2；配製方法：稱取pda7.8g於200ml蒸餾水或去離子水中加熱至完全溶解，pda與蒸餾水或去離子水的比例為7.8g：200ml，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘，滅菌結束後搖勻，以防瓊脂沉積於器皿底部而凝固，備用

c.將生長至對數生長期的菌種用pbs緩衝液洗滌至250ml錐形瓶中，菌液濃度為1×106cfu/ml-1×107cfu/ml，取混合均勻菌液接種至粉碎玉米中，在28-30℃進行固體發酵，所述的玉米原料中添加了無菌水，菌液、玉米和無菌水的用量比例為10ml：200g：70ml，121℃高壓溼熱滅菌後冷卻至30-40℃。

所述pbs緩衝液為：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l,ph值7.2。配製方法為：稱取原料後加去離子水約800ml充分攪拌溶解，然後加入濃鹽酸調ph至7.2，最後定容到1l。高溫高壓滅菌後置於4℃冰箱保存待用。

所述的小孢根黴少孢變種(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)(中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號cgmcc3.4392)，菌種購自北京豫鼎鑫捷科技有限公司。

所述玉米購自飼料原料市場。

本發明的優點在於:利用小孢根黴少孢變種對飼料原料的固體發酵過程中，不僅對飼料原料的營養成分有不同程度的提升，而且對玉米赤黴烯酮有降解的效果。益生黴菌的發酵有雙重的效果,通過降解部分多糖、蛋白質、脂肪，消除抗營養因子和積累有益的代謝物等大分子物質，形成有機酸和可溶性多肽等小分子物質，形成營養性豐富、適口性好和活菌含量較高的生物飼料不僅對飼料原料的營養成分有提升還能降解嘔吐毒素的含量。不存在二次汙染的問題，提高飼料原料的營養價值。提高產品的質量,提高糧食利用率，保證人畜的安全問題，還具有生產使用成本低、簡單、易操作，玉米赤黴烯酮降解安全、高效等優點利用，對於企業生產有良好的借鑑基礎。

具體實施方式

本發明實施例中小孢根黴少孢變種(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)(中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號cgmcc3.4392)，菌種購自北京豫鼎鑫捷科技有限公司，玉米從飼料廠購買飼料原料。

pbs緩衝液為：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l。稱取137mmolnacl、2.7mmolkcl、10mmolna2hpo4和2mmolkh2po4加去離子水約800ml充分攪拌溶解，然後加入濃鹽酸調ph至7.2，最後定容到1l，高溫高壓滅菌後置於4℃冰箱保存待用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養基：馬鈴薯浸出粉5.0g；葡萄糖20g；瓊脂14g在室溫25℃中ph值為5.6±0.2；配製方法：稱取pda7.8g於200ml蒸餾水或去離子水中(可按比例增加或者減少配置量)加熱至完全溶解，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘，滅菌結束後搖勻，以防瓊脂沉積於器皿底部而凝固，備用

實施例1：

一種利用小孢根黴少孢變種固體發酵降解玉米赤黴烯酮的方法，步驟如下：

1.小孢根黴少孢變種菌液的製備

首先將菌粉活化培養用無菌吸管，吸取0.2ml滅菌pbs緩衝液滴入2g凍幹菌體的安瓿管內，輕輕振蕩，使凍幹菌體溶解呈懸浮狀，分別配置五組懸浮液；

2.馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養基的製備

首先將高溫滅菌的pda分別倒入五個培養皿中，冷卻至室溫。然後將活化好的五組黴菌菌種，接種至pda培養基中擴大培養，每個培養皿中用200ul移液槍吸取菌液200ul至五個培養皿中，再用接種環塗布均勻，放置在恆溫培養箱中培養，將溫度調節至小孢根黴少孢變種適宜生長溫度28℃，進行72h培養。

在72h後，將五個生長黴菌的培養皿從培養箱中取出，分別用pbs緩衝液洗滌培養皿中的小孢根黴少孢變種，每個培養皿洗滌5次，每次10ml，儘量將生長的黴菌洗滌至300ml錐形瓶中,5個培養皿一共洗滌25次，菌液為250ml，然後調節菌液的濃度，用25格x16格血球計數板技術，用200ul移液槍滴一滴菌液至血球計數板中，放置顯微鏡下計數。公式為：黴菌數/ml＝80小格內黴菌細胞個數/80×400×10四次方×稀釋倍數，將菌液的濃度保持在1×107cfu/ml。

3.固體發酵培養

飼料原料的製備方法：粉碎玉米原料稱重200g，添加70ml無菌水，121℃高壓溼熱滅菌後冷卻至40℃。取步驟2中菌液10ml接種至200g粉碎玉米原料中，菌液的濃度保持在1×107cfu/ml，固體發酵溫度為30℃，發酵時間為72小時。

設立空白對照組不進行黴菌接種，作為對照。稱取粉碎玉米200g，添加80ml無菌水，121℃高壓溼熱滅菌後冷卻至40℃，固體發酵溫度為30℃,發酵時間為72小時。

上述應用中，所述的粉碎玉米都是從飼料廠購買飼料原料。

試驗結束。收集發酵前後的飼料原料稱重後，進行65℃風乾，再進行粉碎，-20℃保存待測。

4.小孢根黴少孢變種發酵前後玉米營養物質含量的變化

分別測定小孢根黴少孢變種發酵前後玉米的總能，粗脂肪，粗蛋白，營養指標的變化。統計分析試驗數據用spss19軟體的一般線性模型進行單因素分析，粗脂肪的含量顯著低於空白對照組的粗脂肪含量。因為黴菌的生長和繁殖需要碳水化合物來維持。粗脂肪以此來作為碳源來維持生長。所以在小孢根黴少孢變種發酵過程中生成總能和粗蛋白的含量有上升。具體結果見下表。

5.小孢根黴少孢變種發酵前後玉米赤黴烯酮含量的變化

經過小孢根黴少孢變種固體發酵後使玉米赤黴烯酮的含量顯著下降。

經過少孢根黴固體發酵後使玉米赤黴烯酮的含量顯著下降。

實施例2：

一種利用少孢根黴降解玉米赤黴烯酮的方法，步驟如下：

a.將小孢根黴少孢變種(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)活化培養：用無菌吸管吸取0.5ml滅菌pbs緩衝液，滴入放有2g小孢根黴少孢變種凍乾粉的安瓿管內，輕輕振蕩，使凍幹小孢根黴少孢變種菌體溶解呈懸浮狀；

b.擴大培養：將步驟a中活化後的菌種接種於121℃高壓溼熱滅菌後冷卻至30℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂pda培養基中擴大培養，28℃，72小時培養至對數生長期；

c.將生長至對數生長期的菌種用pbs緩衝液洗滌至250ml錐形瓶中，菌液濃度為1×106cfu/ml，200g粉碎玉米原料中添加了70ml無菌水，121℃高壓溼熱滅菌後冷卻至30-40℃，取混合均勻菌液10ml接種至粉碎玉米中，在28℃進行固體發酵，發酵時間72h。

設立空白對照組不進行黴菌接種，作為對照。稱取粉碎玉米200g，添加80ml無菌水，121℃高壓溼熱滅菌後冷卻至30℃，固體發酵溫度為28℃,發酵時間為72小時。

試驗結束。收集發酵前後的飼料原料稱重後，進行65℃風乾，再進行粉碎，-20℃保存待測。

玉米小孢根黴少孢變種發酵前後營養物質含量的變化分別測定玉米小孢根黴少孢變種(發酵前後的總能，粗脂肪，粗蛋白，營養指標的變化。統計分析試驗數據用spss19軟體的一般線性模型進行單因素方差分析，粗脂肪的含量顯著低於空白對照組的粗脂肪含量。因為黴菌的生長和繁殖需要碳水化合物來維持。粗脂肪以此來作為碳源來維持生長。所以在小孢根黴少孢變種發酵過程中生成總能和粗蛋白的含量有上升。具體結果見下表。

玉米小孢根黴少孢變種發酵前後玉米赤黴烯酮含量的變化為：經過小孢根黴少孢變種固體發酵後使玉米赤黴烯酮的含量顯著下降。