肌酸激酶活性測定用試劑的製作方法
2023-05-27 20:55:31 2
專利名稱：肌酸激酶活性測定用試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及測定試樣中所含肌酸激酶(以下稱CK)活性的試劑。
背景技術：
CK是由二個亞組構成的二聚物的磷酸酶。CK的亞組中有B型(腦型)和M型(肌型)兩種。CK因兩種亞組的不同組合，而存在三種異酶(CK-MM、CK-MB和CK-BB)，CK-MM多含於筋骨，CK-MB多含於心肌，CK-BB多含於腦中。因心肌梗塞和肌肉營養不良等疾病，本存在於發病部位的CK異酶會流失到血液中，因此，在臨床檢查中存在於血清和血漿等試樣中的CK的活性值就成為診斷上述疾病的重要指標。
CK在血液中會鈍化，要在生物試樣中加入CK活化劑後再進行活性測定。因此，CK活性測定用試劑中含有N-乙醯-L-半胱氨酸(以下稱NAC)和硫代丙三醇等含SH基的化合物(以下稱SH化合物)，作為CK活化劑。
CK活化劑為不穩定物質，受試劑中所含雜質銅、鐵等金屬離子的影響，CK活化劑的SH基在試劑保存過程中漸漸被氧化，變成二硫化物基，分子中的SH基變成二硫化物基的CK活化劑(變質的CK活化劑)將失去活化CK的作用。因此，為防止CK活化劑變質，穩定CK活化劑，常常用乙二胺四乙酸(EDTA)來螯合CK活化劑變質之源金屬離子。
但是，EDTA穩定CK活化劑的效果並不十分理想，用經長期保存的試劑並不能充分活化測定用試樣中的CK，有時無法進行準確的測定。
發明內容
本發明的目的在於提供長期保存後也能正確進行測定的CK活性測定用試劑。
本發明提供含有氨基甲烷磺酸和CK活化劑的肌酸激酶活性測定用試劑。
本發明提供一種長期保存後也能正確測定的CK活性測定用試劑。
圖1顯示CK活性測定反應原理的模式圖。
具體實施例方式
本實施方式的CK活性測定用試劑含有氨基甲烷磺酸和CK活化劑。試劑中的氨基甲烷磺酸濃度以能穩定CK活化劑為準，並無特別要求。
本發明中的氨基甲烷磺酸還「含有」氨基甲烷磺酸鹽。作為氨基甲烷磺酸鹽比如可以是鉀鹽、鈉鹽、銨鹽(包括與甲胺、二甲胺、甲基乙基胺、三乙胺等合成的鹽)等。
作為CK活化劑，沒有特定，只要具有活化試樣中的CK的作用即可。比如可以使用N-乙醯-L-半胱氨酸(NAC)、N-鳥苷-L-半胱氨酸、半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、穀胱甘肽、巰基琥珀酸、硫葡萄糖、二硫赤蘚糖醇、巰基醋酸、2-巰基乙醇、溴2-氨乙基異硫糖醛(aminoethyl isothiouronium)2-巰基乙烷磺酸及硫代丙三醇等SH化合物。這些CK活化劑也可以兩種以上組合使用，但最好單獨使用。混合試樣和試劑的反應液中CK活化劑的濃度(最終濃度)為0.1～200mM，優選10～100mM。
關於CK活性測定用試劑在溶液狀態下的pH值並無特別限定，最好是5.0～11.0。要維持pH值，最好在試劑中添加緩衝劑。作為緩衝劑比如可以使用樹枝狀鹽酸緩衝劑、咪唑醋酸緩衝劑、磷酸緩衝劑、檸檬酸緩衝劑、蘋果酸緩衝劑、草酸緩衝劑、酞酸緩衝劑、甘氨酸緩衝劑、醋酸緩衝劑、琥珀酸緩衝劑、硼酸緩衝劑、碳酸緩衝劑等良好緩衝劑。
CK活性測定用試劑中最好含有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙醯胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)和磷酸肌酸。
CK活性測定用試劑既可以將各種成份凍結乾燥為固態也可以將其溶解在溶液裡形成液態。
CK活性測定用試劑最好是含有第一試劑和第二試劑的套裝試劑，此時，第一試劑和/或第二試劑可以是凍結乾燥狀態，也可以兩個試劑都是液態。
當CK活性測定用試劑包括第一試劑和第二試劑時，優選第一試劑中含有G6 PDH、NAD或NADP、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)及CK活化劑，第二試劑含有磷酸肌酸。
G6PDH、HK和GK其來源無特定，可以來自細菌、酵母、動植物等，也可來源於用基因重組技術生成的物質。G6PDH的最終濃度為0.5～40U/ml之間，優選1～10U/ml。HK或GK的最終濃度為0.5～20U/ml之間，優選1～6U/ml。
CK活性測定用試劑中可以放入乙二胺四醋酸(EDTA)、二亞乙基三胺五醋酸(DTPA)、環己二胺四醋酸(以下稱Cy DTA)等螯合劑。當CK活性測定用試劑由第一試劑和第二試劑組成時，優選螯合劑放在第一試劑。CK活化劑變質的原因是試劑中含有金屬離子，螯合劑具有通過螯合試劑中的金屬離子來抑制CK活化劑變質的效果。
氨基甲烷磺酸可以含在第一試劑和第二試劑的任何一個當中，也可以兩者都含。除第一試劑和第二試劑外還可以製備含有氨基甲烷磺酸的第三試劑，在測定前混合進去。氨基甲烷磺酸接觸到CK活化劑，可以使變質的CK活化劑的二硫化物基還原為SH基。氨基甲烷磺酸不僅具有這種作用，它還有防止CK活化劑的SH基轉化為二硫化物基的作用。
含氨基甲烷磺酸的第一試劑和第二試劑組成的套裝試劑可以通過以下方法製備混合氨基甲烷磺酸、G6 PDH、NAD或NADP、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)和CK活化劑，配製第一試劑；再配製含有磷酸肌酸的第二試劑。
第一試劑和含氨基甲烷磺酸的第二試劑組成的套裝試劑可以通過以下方法製備混合G6 PDH、NAD或NADP、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)和CK活化劑，配製第一試劑；再配製含有氨基甲烷磺酸和磷酸肌酸的第二試劑。
在第一試劑中添加氨基甲烷磺酸，可以抑制長期保存造成的SH化合物變質，從而穩定SH化合物。當第二試劑中添加氨基甲烷磺酸時，可以使因長期保存而變質、從而失去CK活化作用的SH化合物還原到變質前的狀態(可以活化CK的狀態)。因此，通過在第一試劑或第二試劑中添加氨基甲烷磺酸，都可以保證即使使用長期保存後的試劑也能進行準確的CK活性測定。
本實施方式的CK活性測定用試劑的測定對象是試樣中含有的全部CK的活性、CK-MM的活性、CK-MB的活性和CK-BB的活性之中的任意一個。在臨床檢查中一般是測定試樣中的全部CK的活性或CK-MB的活性。通過在CK活性測定用試劑中加入與CK的M型亞組特異締合的抗體(以下稱抗CK-M抗體)，即可測定試樣中的CK-MB的活性(Wurzburg et al.，1977，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，15131-135)。作為抗CK-M抗體，只要是能特別識別M型亞組的抗體，它既可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，還可以將二者混合起來使用。另外，還可以使用抗體的碎片及其衍生物。抗體的碎片及其衍生物具體來說有Fab，Fab』，F(ab)2以及s Fv碎片等(Blazar et al.，1997，J.Immunol.，1595821-5833及Bird et al.，1988，Science，242423-426)。抗體的次類並不限定於IgG，也可以是IgM等。
用於測定的試樣，可以是血清，血漿、血液、髓液、尿液和精液等，以血漿或血清為好。
下面，根據圖1介紹CK活性測定的反應過程的一例。
在含有CK的試樣中加入含有上述成份的CK活性測定用試劑，將出現如圖1所示的反應。在圖1中，被CK活化劑活化的CK催化了由磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP的反應(反應1)。含在試劑中的乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)通過含在試劑中的葡萄糖和反應1生成的ATP生成葡萄糖-6-磷酸(G6P)和ADP(反應2)。含在試劑中的G6PDH又從反應2中生成的G6P和NAD或NADP生成6-二氧磷-D-葡糖酸和NADH或NADPH(反應3)。NADH或NADPH生成後試樣和試劑的混合液中波長340nm附近的吸光度就會升高。監視此吸光度升高過程，就可以測定試樣中CK的活性。
最好讓CK活性測定用試劑中含有鎂離子。在試劑中添加鎂鹽即可做到這一點。作為鎂鹽可以使用醋酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂等。
也可以在試劑中添加有防腐劑和表面活性作用的化合物。作為防腐劑，比如可以使用疊氮化鈉等。有表面活性作用的化合物可使用非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、兩性離子表面活性劑和白朊等，具體地說，可以使用三通類(Union Carbide Chemicals andPlastics Co.的註冊商標)、乳液類(花王(株)的註冊商標)、牛血清白蛋白(BSA)等等。
試樣中有時含有腺嘌呤脫氨酶。腺嘌呤脫氨酶特別是多含在溶血試樣中，給CK的活性測定帶來負面影響。為了避免這種負面影響，最好在試劑中添加阻止腺嘌呤脫氨酶作用的抑制劑。對抑制劑種類並無特定，只要是抑制腺嘌呤脫氨酶作用的東西即可，比如可以用腺苷一磷酸(AMP)和P1P5二腺苷-5』-五氯乙烷酸(AP5A)等。
用雙動法測定活性也可以避免腺嘌呤脫氨酶的負面影響。所謂雙動法就是先測定腺嘌呤脫氨酶等酶的活性，然後添加磷酸肌酸，讓CK進行酶反應，再測定試樣中的激酶的活性(CK活性和腺嘌呤脫氨酶等酶的活性之和)。這些測定結果的差即為CK的活性值。
(實施例1)以下列出了測定CK活性用第一試劑和第二試劑的基本構成。
第一試劑pH 6.6咪唑125mM醋酸鎂12.5mM環己二胺四醋酸2.0mMADP 2.5mM
AMP 6.25mMAP5A 12.5M葡萄糖25mMNADP 2.5mMG6PDH 1875U/L乙糖激酶3750U/LNAC 30mM第二試劑ApH 9.0磷酸肌酸150mM將上述物質按上述濃度溶解在蒸餾水中，配製第一試劑和第二試劑A。然後在第二試劑A中添加氨基甲烷磺酸5mM，配製第二試劑B；在第二試劑A中添加氨基甲烷磺酸10mM，配製第二試劑C；在第二試劑A中添加氨基甲烷磺酸20mM，配製第二試劑D；再配製與第二試劑A同樣成份的第二試劑E。
將上述第一試劑和第二試劑A～D在4℃的溫度下保存4個月，然後用日立7170S型自動分析儀將第一試劑180μl、第二試劑45μl作為試樣和酶校準品(calibrator)(Sysmex公司制)5.6μl混合，測定在340nm處的吸光度變化。第一試劑和第二試劑E不進行4℃環境下的4個月長期保存，配製試劑後馬上測定上述試樣的CK活性。測定進行二次，測定結果的平均值如下面表1所示。表1中顯示的值是將吸光度變化量放大10000倍後的值。
表1
如上所示，使用含有氨基甲烷磺酸並經長期保存的第二試劑B～C時獲得的吸光度變化量測定值(以下簡稱為測定值)比使用經長期保存的第二試劑A時的測定值更接近使用第二試劑E時的測定值。
這說明因長期保存而變質的NAC與氨基甲烷磺酸接觸後又回到變質前的狀態，得以充分活化CK。從以上可以看出，使用含氨基甲烷磺酸的試劑，即使試劑經過長期保存也能夠正確測定試樣中的CK活性。
(實施例2)以下是CK活性測定用第一試劑和第二試劑的基本構成。
第一試劑ApH 6.6咪唑125mM醋酸鎂12.5mMCyDTA 2.0mMADP 2.5mMAMP 6.25mMAP5A 12.5μM葡萄糖30mMNADP 2.5mMG6PDH 1875U/L乙糖激酶3750U/LNAC 30mM第二試劑pH 9.0磷酸肌酸150mM將上述物質按上述濃度溶解在蒸餾水中，配製第一試劑A和第二試劑。然後，在第一試劑A中添加氨基甲烷磺酸1mM，配製第一試劑B；再在第一試劑A中添加氨基甲烷磺酸2mM配製第一試劑C。
將上述第一試劑A～C和第二試劑在4℃的溫度下保存1個月，然後用日立7170S型自動分析儀將第一試劑180μl、第二試劑45μl作為試樣和酶校準品(calibrator)(Sysmex公司制)5.6μl混合，測定在340nm處的吸光度變化。測定進行二次，測定結果的平均值如下面表2所示。表2所示值是將吸光度變化量放大10000倍後的值。
表2
使用含有氨基甲烷磺酸並經長期保存的第一試劑B、C顯示出的測定值高於只經過長期保存的第一試劑A。
如上所示，氨基甲烷磺酸與NAC在一起可以抑制NAC經長期保存而變質，從而得以充分活化試樣中的CK。以上可以看出，使用添加了氨基甲烷磺酸的試劑，即使長期保存後也能正確地測定CK的活性。
(實施例3)使用含NAC以外的SH化合物的CK活性測定用試劑來評價氨基甲烷磺酸穩定SH化合物的作用。
將下列物質按下列濃度溶解在蒸餾水中，並將pH維持在6.6。
咪唑125mM醋酸鎂12.5mMEDTA 2.5mMADP 2.5mMAMP 6.25mMAP5A 12.5μM葡萄糖30mMNADP 2.5mMG6PDH 1875U/L乙糖激酶3750U/L
在上述成份中作為CK活化劑添加30mM半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、穀胱甘肽和硫代丙三醇中的一個和氨基甲烷磺酸10mM，配製5種第一試劑。同時，也作為CK活化劑添加30mM半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、穀胱甘肽和硫代丙三醇中的一個，不添加氨基甲烷磺酸，再配製5種第一試劑。對這十種試劑以37℃施加5天的溫度負荷後對試劑中的SH基進行定量。
另外，作為CK活化劑添加30mM半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、穀胱甘肽和硫代丙三醇中的一個，不添加氨基甲烷磺酸，配製5種第一試劑，不施加溫度負荷對試劑中的SH基進行定量。
SH基的定量是用DTNB 5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5，5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid))做的。在試劑中添加DTNB，如果有SH化合物，則相當於SH化合物所含SH基的量的二硫化物鍵斷裂，產生5-巰基-2-硝基苯(甲)酸(5-Mercapto-2-nitrobenzoic acid)。5-巰基-2-硝基苯(甲)酸一產生，則波長412nm處的吸光度升高，測定之以定量試劑中的SH基。定量結果如以下表3所示，定量結果是相對於使用未添加氨基甲烷磺酸的第一試劑、在未施加溫度負荷的情況下而定量的SH基的量的百分比。
表3
無論使用哪個CK活化劑，添加氨基甲烷磺酸的第一試劑其施加溫度負荷後的SH基殘留量比不添加氨基甲烷磺酸的第一試劑更多。這說明無論哪種CK活化劑都可以通過添加氨基甲烷磺酸抑制變質的發生。由此可知，氨基甲烷磺酸可以提高各種CK活化劑的保存穩定性。
如上所述，在第一試劑和第二試劑之一添加氨基甲烷磺酸，試劑即使長期保存也能正確地測定CK活性。
權利要求
1.一種肌酸激酶活性測定用試劑，其特徵在於含有氨基甲烷磺酸和肌酸激酶活化劑。
2.權利要求1描述的肌酸激酶活性測定用試劑，其特徵在於所述肌酸激酶活化劑是一種含有SH基的化合物。
3.權利要求1描述的肌酸激酶活性測定用試劑，其特徵在於所述肌酸激酶活化劑是選自N-乙醯-L-半胱氨酸(NAC)、N-鳥苷-L-半胱氨酸、半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、穀胱甘肽、巰基琥珀酸、硫葡萄糖、二硫赤蘚糖醇、巰基醋酸、2-巰基乙醇、溴2-氨乙基異硫糖醛(aminoethyl isothiouronium)、2-巰基乙烷磺酸及硫代丙三醇中的至少一種。
4.權利要求1或2描述的肌酸激酶活性測定用試劑，其特徵在於還至少含有以下一種化合物葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙醯胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)及磷酸肌酸。
5.權利要求1或2描述的肌酸激酶活性測定用試劑，其特徵在於還含有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙醯胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)及磷酸肌酸。
6.權利要求1描述的肌酸激酶活性測定用試劑，其特徵在於還含有與肌酸激酶M型亞組特異締合的抗體。
7.一種肌酸激酶活性測定用套裝試劑，其特徵在於包括二種試劑，其分別是含有肌酸激酶活化劑、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙醯胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)的第一試劑和含有氨基甲烷磺酸及磷酸肌酸的第二試劑。
8.一種肌酸激酶活性測定用套裝試劑，其特徵在於包含二種試劑，其分別是含有氨基甲烷磺酸、肌酸激酶活化劑、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙醯胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)的第一種試劑，含有磷酸肌酸的第二種試劑。
9.肌酸激酶活性測定用套裝試劑的製造方法，其特徵在於包括以下配製步驟a)將肌酸激酶活化劑、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙醯胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)混合，配製第一試劑；及b)將氨基甲烷磺酸和磷酸肌酸混合配製第二試劑。
10.肌酸激酶活性測定用套裝試劑的製造方法，其特徵在於包括以下配製步驟a)將氨基甲烷磺酸、肌酸激酶活化劑、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙醯胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)混合，配製第一試劑；及b)配製含有磷酸肌酸的第二試劑。
全文摘要
本發明提供含有氨基甲烷磺酸和肌酸激酶(CK)活化劑的肌酸激酶(CK)活性測定用試劑。
文檔編號G01N33/53GK1916623SQ20061010982
公開日2007年2月21日 申請日期2006年8月16日 優先權日2005年8月17日
發明者酒井康裕 申請人:希森美康株式會社