用於研究肝細胞癌上皮間質樣變的動物模型的構建方法

2023-05-28 10:48:01 1

專利名稱：用於研究肝細胞癌上皮間質樣變的動物模型的構建方法
技術領域：
本發明涉及構建一種用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型， 本發明也可成為針對肝癌細胞上皮間質樣變過程的靶向抗腫瘤藥物研發的理想驗證平臺。
背景技術：
原發性肝癌是高度惡性的腫瘤之一，其死亡率位於我國惡性腫瘤的第二位。絕大多數肝癌病人死亡與肝癌復發、轉移相關。研究表明肝癌復發、轉移是多基因參與、多步驟完成複雜過程，包括腫瘤細胞粘附、遷移和腫瘤細胞對細胞外基質的降解等，目前，其發生的分子機制尚不完全清楚，進一步探索研究肝癌復發、轉移分子機制，對設計靶向藥物、改善肝癌患者預後及提高我國肝癌的治療水平具有重要意義。近年來腫瘤細胞轉移過程中常出現上皮細胞間質樣轉變(EMT)受到關注。上皮細胞間質樣轉變是指具有極性的上皮細胞轉換成為活動能力的間質細胞並獲得侵襲和遷移能力的過程，在動物胚胎發育過程中普遍存在。當前認為90%以上的上皮細胞惡性腫瘤在發生侵襲與轉移過程中發生上皮細胞間質樣轉變，例如乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺、肝癌等。上皮細胞間質樣轉變以上皮細胞標記缺失，如上皮型鈣粘素(E-cadherin)、β 連環蛋白(β-catenin)和角質蛋白18 (cytokeratin 18)等及間葉組織標記的獲得，如波形蛋白(Vimentin)，神經型鈣粘素(N-cadherin)和α平滑肌肌動蛋白(α -SMA)等為重要特徵，涉及到多個信號轉導通路和複雜的分子機制，具體包括細胞粘附分子的表達減少；角蛋白為主的細胞骨架轉變為波形蛋白為主的細胞骨架，從而引起細胞形態的改變。這種表型的轉換使得腫瘤細胞容易擺脫細胞-細胞間黏附，並具有更強的穿透和遊走能力， 因此上皮間質樣改變與腫瘤細胞的侵襲、轉移關係密切。研究腫瘤上皮間質樣改變的發生過程和調控機制，針對上皮間質樣改變發生過程設計靶向藥物對於惡性腫瘤的幹預及治療具有重要意義。上皮間質樣改變與原發性肝癌侵襲和轉移的關係及其分子機制已成為目前肝癌研究的熱點。這些研究常包括上皮間質樣改變相關基因表達的改變引起肝癌細胞形態改變的體外研究，然後通過裸鼠接種體內驗證上皮間質樣改變相關基因的表達改變，最後在臨床肝癌標本中證實上皮間質樣變的現象。目前應用較為廣泛的用於研究上皮間質樣改變的動物模型是肝癌細胞皮下接種法，這種方法雖然簡單易行，但與肝癌復發轉移的臨床生理、 病理相差甚遠，因此不能真實反映肝癌轉移中上皮間質樣改變的作用。近年來，研究者嘗試用經腹盲目穿刺原位接種法製造動物模型，但這種方法具有穿刺成功率低，容易出血，腹腔播散較多等缺點。而且現有的動物模型只反映肝癌侵襲轉移過程中某一時點的上皮間質樣改變現象，與上皮間質樣改變是一個動態的過程相違背，因此這些研究不能確切反映上皮間質樣改變與肝癌侵襲轉移的關係。構建能符合肝癌轉移臨床特點、體現上皮間質樣改變動態發生過程的肝癌原位動物模型是獲得可靠結果的前提和基礎。然而，目前尚缺乏這樣的動物模型。

發明內容
本發明的目的在於解決腫瘤細胞侵襲轉移過程中發生的上皮間質樣改變難以觀察的問題，開發一種簡單易行、能廣泛推廣應用的、成功率高的、可真實模擬肝癌臨床的原位移植瘤上皮間質樣變動態發生過程的一種動物模型構建的方法。為了達到上述目的，本發明提供了一種用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，其特徵在於，取實驗動物，在超聲設備引導下肝臟原位接種腫瘤細胞，動態觀察上皮間質樣變相關指標變化以及肺轉移情況。所述的實驗動物為BALB/c裸鼠。所述的超聲設備為配備有高頻(5-12MHZ)探頭的彩色都卜勒超聲設備。所述的肝臟原位接種腫瘤細胞的方法為肝實質注射肝癌細胞。所述的動態觀察上皮間質樣變相關指標變化以及肺轉移情況的方法為接種後第一周開始，每隔一周處死動物，直到接種後第六周；將處死的動物解剖、取出肝臟及肺臟，脫水包埋成蠟塊；將肝臟切片，免疫組織化學染色檢測不同時期肝癌組織及癌旁組織中上皮間質樣變相關指標變化，將肺臟連續切片，計數肺轉移率和轉移病灶數。所述的免疫組織化學染色方法為鏈黴菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP 法)。所述的上皮間質樣變相關指標為上皮型鈣粘素(E-cadherin)、神經型鈣粘素 (N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin), α平滑肌肌動蛋白(α -SMA)和Snail蛋白中的一種或幾種。所述的肺轉移灶計數方法為肺連續切片，經蘇木精-伊紅染色(HE)，顯微鏡下觀察計數肺轉移率和病灶轉移數。本發明採用在高頻彩色都卜勒引導下將腫瘤細胞注入肝實質，隔周處死實驗動物，原位移植腫瘤、癌旁組織及肺包埋蠟塊切片，通過對上皮間質樣變的相關指標進行免疫組織化學染色和肺連續切片來觀察肝細胞癌經歷上皮向間質樣細胞轉變的動態過程及轉移情況，該模型可為研究肝癌細胞上皮間質樣改變機制和驗證新的抗上皮間質樣改變靶向治療提供平臺。本發明具有如下優點
(1)製作過程簡單易行，成功率高，能廣泛推廣應用；
(2)製作的動物模型能真實地模擬臨床肝癌轉移的病理過程；
(3)製作的動物模型能動態反映肝癌細胞上皮間質樣改變發生過程。


圖1為接種後第一周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達圖2為接種後第二周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達
圖3為接種後第三周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達
圖4為接種後第四周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達圖5為接種後第五周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達
圖6為接種後第六周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達圖。
具體實施例方式下面結合實施例來具體說明本發明。實施例1
(1)取BALB/c裸鼠(4-6周，雄性)作為實驗動物，每組5隻裸鼠，用1.5% (1.5克溶於 IOOml雙蒸水中)戊巴比妥鈉(40mg/kg，國藥集團產品，貨號B1202)腹腔注射麻醉；
(2)將Matrigel基質膜(BD公司產品，貨號3M234)和無血清高糖DMEM(GIBIC0公司產品，貨號11995081)按體積比1 :1混合，分別用上述混合溶液將8X IO6個對數生長期肝癌細胞HCCIiO-control (HCCLM3細胞轉染慢病毒空載體，HCCLM3細胞為復旦大學肝癌研究所構建、保存及公開使用；慢病毒空載體為上海吉凱基因化學技術有限公司產品，貨號 GC080357)、shRNA-CD151-HCCLM3 (HCCLM3 細胞轉染幹擾 CD151 表達質粒的慢病毒，HCCLM3 細胞復旦大學肝癌研究所構建、保存及公開使用；幹擾CD151表達質粒的慢病毒為上海吉凱基因化學技術有限公司產品，貨號GC080357)、shRNA- α 6-HCCLM3 (HCCLM3細胞轉染幹擾整合素α 6表達質粒的慢病毒，HCCLM3細胞復旦大學肝癌研究所構建、保存及公開使用，幹擾整合素α 6表達質粒的慢病毒為上海吉凱基因化學技術有限公司產品，貨號GC92064)、 H印G2-control(H印G2細胞轉染慢病毒空載體，IfepG2細胞為ATCC產品，貨號HB8065，慢病毒空載體為上海吉凱基因化學技術有限公司產品，貨號GC080357)和H印G2-CD151 (HepG2 細胞轉染以慢病毒為載體的過表達⑶151質粒，!fepG2細胞系ATCC產品，貨號HB8065，慢病毒為載體的過表達⑶151質粒為上海吉凱基因化學技術有限公司產品，貨號GC921783)定容成50ul ；
(3)將裸鼠仰臥，固定於平板上，75%酒精消毒皮膚，用無菌紗布鋪巾，用配備有高頻 (5-12MHZ)探頭的彩色都卜勒超聲設備(Aloka公司產品)對裸鼠肝臟定位，在超聲波引導下經劍突下0. 5cm用0. 4mm針頭刺入肝實質，潛行0. 5cm後注射上述腫瘤細胞溶液50ul，拔出穿刺針，用幹棉籤在穿刺點向肝臟方向按壓5分鐘，超聲波確認穿刺點周圍無明顯積液；
(4)在無特定病原體(SPF級)的環境下飼養，從接種後第一周到六周每隔一周用1.5% (1. 5克溶於IOOml雙蒸水中)戊巴比妥鈉(40mg/kg，國藥集團產品)腹腔注射麻醉處死實驗動物，解剖、取出肝臟及肺臟，用10%福馬林(IOml福馬林溶入IOOml生理鹽水中)固定，脫水包埋成蠟塊；
(5)肝臟腫瘤及癌旁組織蠟塊切成4um厚的連續切片，用鏈黴菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP法)染色烤片68°C，20分鐘；常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水二甲苯I 20分鐘，二甲苯II 20分鐘，100%酒精I 10分鐘，100%酒精II 10分鐘，95%酒精5分鐘， 80%酒精5分鐘，70%酒精5分鐘；阻斷滅活內源性過氧化物酶3%雙氧水(H2O2) 37°C孵育 10分鐘，ρΗ7· 0磷酸鹽緩衝液(PBS)衝洗3次，每次5分鐘；抗原修復置0. 01M(0. Olmmol 枸櫞酸融入1升雙蒸水)枸櫞酸緩衝液(PH 6.0)中煮沸(95°C，15-20分鐘)，自然冷卻20分鐘以上，再用冷水衝洗缸子，加快冷卻至室溫，PH7. 0磷酸鹽緩衝液衝洗3次，每次5分鐘。 10%正常羊血清工作液(中杉生物產品，貨號ZLI-9022 )封閉，37°C，10分鐘，傾去勿洗；滴加一抗(兔抗人上皮型鈣粘素多克隆抗體，AbCAM公司產品，貨號abl5148，l :250稀釋；兔抗人 α平滑肌肌動蛋白多克隆抗體，AbCAM公司產品，貨號ab5694，1 :500稀釋；兔抗人Snail 多克隆抗體，AbCAM公司產品，貨號ab85931，1 :300稀釋)4°C冰箱孵育過夜，pH7. 0磷酸鹽緩衝液衝洗3次，每次5分鐘(用磷酸鹽緩衝液代替一抗作陰性對照);滴加生物素標記二抗 (中杉生物產品，貨號zb2030，1 2000稀釋)，37°C孵育30分鐘，磷酸鹽緩衝液衝洗3次，每次5分鐘；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈黴素卵白素工作液(中杉生物產品，貨號zbM04， 1 :2000稀釋)，37°C孵育30分鐘，PBS衝洗3次，每次5分鐘；二氨基聯苯胺(DAB，邁新生物產品，貨號C0009，A、B、C各一滴，加入0. 85ml磷酸鹽緩衝液中現配現用，30分鐘內有效) 反應染色，自來水充分衝洗後，蘇木素(中杉生物產品，貨號ZLI-9039)復染，常規脫水，透明，乾燥，封片。檢測不同時間點肝癌組織及癌旁組織中上皮型鈣粘素、α平滑肌肌動蛋白和Snail蛋白等與上皮間質樣變密切相關指標的表達，來觀察肝癌細胞上皮間質樣變的動態變化過程(陽性染色判斷標準和定位顯微鏡下觀察棕黃色為強陽性，淡黃色為陽性，無染色為陰性；上皮型鈣粘素定位於腫瘤細胞胞漿，α平滑肌肌動蛋白表達與腫瘤細胞胞漿和外基質，Snail定位於腫瘤細胞胞核和細胞漿)；
(6)肺包埋石蠟塊進行連續切片，蘇木精-伊紅染色，(切片脫蠟、復水二甲苯I 20分鐘，二甲苯II 10分鐘，100%、95%、90%、80%、70%各級酒精，每級5分鐘；蘇木素液(中杉生物產品，貨號ZLI-9039)染5分鐘；流水洗3分鐘，1 %鹽酸酒精(1 :100體積)中蘸3下，流水衝洗20分鐘使切片由淡紅色變為灰蘭色；伊紅染液(中杉生物產品，貨號ZLI-9044)5分鐘； 脫水、透明70%、80%、90%的酒精中每級各蘸3下，再經95%、100% I、100% II梯度酒精，每級各5分鐘。二甲苯I、二甲苯II分別透明10分鐘；封片組織切片上滴加適量樹膠(中杉生物產品，貨號ZLI-9555)，加蓋玻片封固)。用Leica DFC420相差顯微鏡採集圖像，計數肺轉移病灶數，肺轉移灶計數方法為肺石蠟塊連續切片，經蘇木精-伊紅染色(HE)，顯微鏡下觀察計數肺轉移灶。 如圖1所示，為接種後第一周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達圖。肝癌細胞接種後第一周，所有移植瘤中上皮型鈣粘素呈強陽性表達，而 α平滑肌肌動蛋白和Snail呈陰性表達，說明無上皮間質樣改變發生。如圖2所示，為接種後第二周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達圖；接種後第二周HCCLM3對照組細胞(HCCIiO-control)開始侵襲正常肝臟組織和細胞外基質，侵襲的腫瘤細胞顯示α平滑肌肌動蛋白(α -SMA)和細胞核內Snail強陽性表達，而上皮型鈣粘素(E-cadherin)表達很弱，其餘各組則呈現強陽性表達上皮型鈣粘素(E-cadherin)，而 α平滑肌肌動蛋白(α -SMA)和Snail呈陰性表達，說明HCCIiO-control最先發生上皮間質樣改變；如圖3所示，為接種後第三周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達圖；接種後3周通過轉染過表達⑶151的!fepG2細胞(!fepG2-⑶151)在腫瘤與癌旁交界處開始出現間質樣細胞，S卩α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和細胞核內Snail 強陽性表達，而上皮型鈣粘素表達(E-cadherin)很弱，腫瘤細胞向正常肝組織侵襲，說明 !fepG2-⑶151開始發生上皮間質樣改變。如圖4所示，為接種後第四周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達圖；接種後4周HCCLM3_control和H印G2-CD151組α平滑肌肌動蛋白和細胞核內Snail強陽性表達，而上皮型鈣粘素(E-cadherin)表達很弱，而 HCCLM3-shCD151，HCCLM3_sh α 6 和 H印G2_control 組上皮型鈣粘素(E-cadherin) 呈強陽性表達，而α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Snail呈陰性表達。如圖5所示，為接種後第五周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達圖；接種後第5 周通過轉染幹擾CD151或整合素α 6的HCCLM3細胞(HCCLM3_shCD151，HCCLM3_sh α 6)開始形成腫瘤，並表現出侵襲的特性，S卩α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和細胞核內Snail強陽性表達，而上皮型鈣粘素(E-cadherin)表達很弱。如圖6所示，為接種後第六周肝癌及癌旁組織上皮型鈣粘素、Snail和α平滑肌肌動蛋白表達圖，轉染空載體的H印G2_對照組 (HepG2-control)到接種後6周始終未出現間質樣細胞，即上皮型鈣粘素(E-cadherin)呈強陽性表達，而α平滑肌肌動蛋白(α -SMA)和Snail呈陰性表達。肺轉移計數顯示HCCLM3對照組(HCCLM3_control)的肺轉移率為100% (5/5)， 轉移病灶數平均為M7士65個；轉染幹擾CD151的HCCLM3細胞(HCCLM3-shCD151)的肺轉移率為40% 0/5)，轉移病灶數平均為114士46個；轉染幹擾整合素α 6的HCCLM3細胞 (HCCLM3-sha 6)的肺轉移率為40% 0/5)，轉移病灶數平均為119士21個；通過轉染過表達 CD151的H印G2細胞(!fepG2-CD151)的肺轉移率為60% (3/5)，轉移病灶數平均為145士43 個；而轉染空載體的H印G2-對照組(!fepG2-C0ntr0l)的肺轉移率為0% (0/5)，轉移病灶數為0個。本發明採用肝臟原位接種腫瘤細胞，與傳統的構建方法相比，更符合肝癌臨床實際，能客觀反映肺的轉移率和轉移病灶數；其次以往研究上皮間質樣改變的傳統肝癌轉移動物模型，多盲目取某一時間點來反映肝癌細胞上皮間質樣改變的特點，這與上皮間質樣改變是一個動態的過程相違背，本發明採用逐周處死動物來觀察上皮間質樣改變發生的動態過程，更符合上皮間質樣改變的病理過程。
權利要求
1.一種用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，其特徵在於， 取實驗動物，在超聲設備引導下肝臟原位接種腫瘤細胞，動態觀察上皮間質樣變相關指標變化以及肺轉移情況。
2.如權利要求1所述的用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，其特徵在於，所述的實驗動物為BALB/c裸鼠或非肥胖糖尿病/重症聯合免疫缺陷小鼠。
3.如權利要求1所述的用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，其特徵在於，所述的超聲設備為配備有高頻探頭的彩色都卜勒超聲設備。
4.如權利要求1所述的用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，其特徵在於，所述的肝臟原位接種腫瘤細胞的方法為肝實質注射肝癌細胞。
5.如權利要求1所述的用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，其特徵在於，所述的動態觀察上皮間質樣變相關指標變化以及肺轉移情況的方法為接種後第一周開始，每隔一周處死動物，直到接種後第六周；將處死的動物解剖、取出肝臟及肺臟，脫水包埋成蠟塊；將肝臟切片，免疫組織化學染色檢測不同時期肝癌組織及癌旁組織中上皮間質樣變相關指標變化，將肺臟連續切片，計數肺轉移率和轉移病灶數。
6.如權利要求5所述的用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，其特徵在於，所述的免疫組織化學染色方法為鏈黴菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法。
7.如權利要求5所述的用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，其特徵在於，所述的上皮間質樣變相關指標為上皮型鈣粘素、神經型鈣粘素、波形蛋白、 α平滑肌肌動蛋白和Snail蛋白中的一種或幾種。
8.如權利要求5所述的用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，其特徵在於，所述的肺轉移灶計數方法為肺連續切片，經蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察計數肺轉移率和病灶轉移數。
全文摘要
本發明提供了一種用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，其特徵在於，取實驗動物，在超聲設備引導下肝臟原位接種腫瘤細胞，動態觀察上皮間質樣變相關指標變化以及肺轉移情況。本發明具有如下優點製作過程簡單易行，成功率高，能廣泛推廣應用；製作的動物模型能真實地模擬臨床肝癌轉移的病理過程；製作的動物模型能動態反映肝癌細胞上皮間質樣變發生過程。
文檔編號G01N33/48GK102178568SQ20111004326
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月23日 優先權日2011年2月23日
發明者周儉, 施國明, 柯愛武, 樊嘉, 黃曉勇 申請人:復旦大學附屬中山醫院