人kctd10基因啟動子的製作方法

2023-05-28 10:42:11

專利名稱：人kctd10基因啟動子的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因表達調控領域，具體是指人KCTD10(鉀離子通道四聚化結構域包含蛋白10)基因的啟動子以及它的用途。
背景技術：
周建林等人克隆了小鼠KCTD10基因(鉀離子通道四聚化結構域包含蛋白基因10)(周建林等人，Biochimica et Biophysica Acta.1729，200-203(2005))。研究分析表明KCTD10基因胺基酸序列與PDlP1(DNA聚合酶δ相互作用蛋白1)以及TNFAIP1(TNF-α誘導蛋白因子1)高度保守，與PDIP1和TNFAIP1一樣，KCTD10蛋白在氨基末端包含一個BTB/POZ結構域以及一個鉀離子通道四聚化結構域，在碳末端包含一PCNA(增殖細胞核抗原)結合結構域，因此把他們歸納為同一基因家族-PDIP1基因家族。同時發現小鼠KCTDI0基因主要在肺部表達，在心臟和睪丸也有適量的表達，並且KCTD10基因可以被TNF-α(腫瘤致死因子α)所誘導。進一步實驗表明KCTD10可以與P50(DNA聚合酶δ小亞基)以及PCNA(增殖細胞核抗原)能相互作用(周建林等人，Biochimica et Biophysica Acta.1729，200-203(2005)；何華等人，PNAS.98，11979-11974(2001))。
KCTD10蛋白能與DNA聚合酶δ和PCNA相互作用，DNA聚合酶δ是真核細胞DNA複製的主要聚合酶，而PCNA則為一多功能的蛋白，它通過與其它蛋白的相互作用參與一系列細胞內必需的生命過程，而研究最為透徹的是它作為一個滑動夾鉗結構為DNA聚合酶δ結合到DNA模板上提供了便利，從而參與DNA複製，並且在DNA修復以及細胞周期的控制中發揮功能。因此，KCTD10很可能參與了DNA的複製，而且還具有促進DNA修復和抗細胞凋亡作用。KCTD10基因的表達可以被TNF-α所誘導，而TNF-α是一種多功能的細胞因子，參與細胞的複製、凋亡等的調控，因此可以推斷PDIP1基因家族包括KCTD10可能在TNF-α誘導和DNA複製/修復之間起到了一個「橋梁」作用(周建林等人，J.Exp.Zool.303A，227-240(2005)；周建林等人，Biochimica et Biophysica Acta.1729，200-203(2005))。
鼠KCTD10基因位於5號染色體，人KCTD10基因位於12號染色體，它們間具有相似的基因組結構，胺基酸序列也高度保守，它們在體內應發揮相似的功能。
啟動子在基因表達調控中起關鍵作用，然而目前還沒有獲得人KCTD10基因的啟動子有關的調控序列。鑑於KCTD10基因在DNA複製、DNA修復以及細胞周期調控中可能存在的重要作用，因此，本領域迫切需要開發人KCTD10基因啟動子以及其調控序列。

發明內容
本發明的目的是提供人KCTD10基因的啟動子及含有該啟動子的載體。
本發明提供的人KCTD10基因啟動子，包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發明提供的載體，它包含本發明上述的啟動子。
本發明的人KCTD10基因啟動子無論是在理論研究還是在現實應用方面都具有廣闊的前景。實驗證明PDIP1基因家族(包括KCTD10)能結合PCNA，並刺激PCNA依賴的DNA聚合酶δ的活性，而DNA聚合酶δ又是真核生物DNA複製及修復的主要酶，這就說明KCTD10能刺激DNA複製和修復，並參與抗凋亡的過程。因此可以利用本發明的啟動子篩選與DNA複製及修復等有關疾病(比如腫瘤)的藥物；可以利用該發明的啟動子作為導向元件，對一些因與DNA複製及修復有關基因的缺失或表達不足而造成的疾病如腫瘤進行基因治療；除此之外，通過作用於該啟動子，可以對與DNA複製、修復和細胞凋亡過程中重要分子的功能進行研究，並且通過對該啟動子的控制，可以在特定時間、特定組織能改變KCTD10基因的表達，對與DNA複製、修復以及細胞凋亡有關的疾病如腫瘤的治療提供一條可行的途徑。


圖1.人KCTD10基因啟動子序列(對應於SEQ ID NO1所示的核苷酸序列)。圖中下劃線表示沒有或僅有弱調控活性的轉錄因子結合位點；方框表示強調控活性轉錄因子結合位點；向右的箭頭表示轉錄起始位點，標註為+1位；向右的空心箭頭表示第一個內含子的起始位點；向左的箭頭表示其相鄰基因UBE3B(泛素化蛋白連接酶E3B)mRNA的起始位點；黑方框標示的鹼基(ATG)為翻譯起始位點。
圖2.引物延伸實驗結果，左側為雙脫氧測序法所測得的核苷酸序列，星號表示轉錄起始位點，箭頭所示為以HeLa細胞RNA為模板進行反轉錄的產物。
圖3.人KCTD10基因啟動子的一系列缺失突變體的相對螢光值。
圖4.人KCTD10基因啟動子的一系列位點特異性突變體的相對螢光值。圖中橢圓表示c-myb結合位點，圓圈表示Sp1結合位點，方框表示SREBP-1結合位點，向右的梯形表示AP-2結合位點，叉號表示對應的位點被突變。
圖5.轉錄因子AP-2α對人KCTD10基因啟動子-203～+30區轉錄活性的影響。
圖6.轉錄因子Sp1對人KCTD10基因啟動子-203～+30區轉錄活性的影響。
具體實施例方式本發明提供的人KCTD10基因啟動子驅動人KCTD10基因在細胞或組織中的特性表達。發明人在實驗中首次分離克隆得到人KCTD10基因啟動子序列，並對其進行了進一步分析，通過引物延伸確定了該啟動子的轉錄起始位點。同時，分別構建了不同長度的人KCTD10基因啟動子的表達載體，轉染哺乳動物細胞使報告基因獲得瞬時表達，以確定人KCTD10基因啟動子的轉錄活性及轉錄活性主要存在的區段。除此之外，還找出了該啟動子中起調控作用的主要反式作用因子及結合位點。
本發明的全長序列或其片段可以通過多種方法獲得，包括PCR(聚合酶鏈式反應)擴增法、重組法、從含有DNA序列的基因組中分離該DNA序列的方法以及體外合成法，但PCR擴增法被優先應用獲得本發明的啟動子。
如應用PCR擴增法，可以根據本發明所公開的有關寡核苷酸序列來設計引物，並以人基因組DNA或所構建的人基因組DNA文庫作為模板獲得相應的序列。
當獲得該序列以後，就可以通過重組的方法批量獲得此種序列，方法是先把序列克隆到能自主複製和增殖的適當載體，然後把載體轉入到能快速繁殖和擴增的細胞如大腸桿菌中，再通過常規方法從增殖的的大腸桿菌中分離得到有關的序列。
從含有DNA序列的基因組中分離DNA序列的方法主要是通過篩選DNA文庫，以鑑定包含人KCTD10基因啟動子全長序列或其片段的方法。
除此之外，還可以用體外化學合成的方法獲得相關的序列，一般是先合成多個小片段序列，再通過末端合適的限制位點把這些序列依次連接，形成正確的核苷酸序列，從而得到包含KCTD10基因啟動子或其片段的DNA序列，然後可將該DNA序列引入本領域中已知的的DNA分子如載體或細胞中。
本發明也包括包含了人KCTD10基因啟動子的載體，以及用所述載體轉化或轉導宿主細胞，並涉及經過重組技術產生外源蛋白的方法。
本發明的啟動子適用於在宿主細胞中驅動外源基因的表達。KCTD10基因啟動子或其片段都可操作性地連接任何一個感興趣的基因編碼序列，並指導與之相連的核酸分子的轉錄。
除此之外，當本發明所公開的啟動子或元件能夠控制其它異源啟動子的功能時，它們也可操作性地連在一起，共同指導下遊外源基因的表達。
能用於本發明中的外源基因沒有特殊限制，包括各種報告基因和功能相關基因等。特別是宿主固有基因應用於該啟動子在基因治療中能發揮作用，比如某些基因的先天缺陷病，或由於基因表達不足造成的病症，可以從人體分離這種基因，並把它構建在本發明所涉及的啟動子下遊，得到能表達外源基因的構建物，這種構建物能用於基因治療。
運用本發明中人KCTD10基因啟動子或片段來表達外源基因，其中涉及表達載體的使用。本發明的表達載體為「質粒」形式，為圓形雙鏈DNA分子。在表達載體中，除本發明所涉及的人KCTD10基因啟動子或片段序列以外，還應包括複製起點、篩選標記基因、轉錄終止序列等等。同時還可以運用體外DNA重組技術和DNA合成技術等可以在載體恰當位置引入合適的轉錄和翻譯控制序列，從而指導mRNA的合成和蛋白質的表達。
表達載體複製起點用於在宿主細胞中擴增該質粒載體，所用的複製起點應與宿主細胞相匹配。若在原核細胞中表達，則在表達載體中應包含原核基因的起始序列如Co1E1複製起始序列ori；若在真核細胞中表達，則應包含真核基因的複製起始序列如SV40病毒的複製序列。此外，表達載體應包含一個或多個選擇標記基因，以提供用於篩選轉化細胞的表型性狀，如在真核細胞中培養用的二氰葉酸還原酶(DHFR)、新黴素抗性基因(neo)及綠色螢光蛋白(GFP)等，或在大腸桿菌中培養用的卡那黴素(Kan)和氨苄青黴素(Amp)等。
宿主細胞包括多種細胞類型，可以是原核細胞或是真核細胞，原核細胞如細菌，最有代表性的有大腸桿菌和鏈黴菌屬；低等真核細胞如酵母細胞；高等真核生物如哺乳動物細胞，COS、CHO、HeLa等比較常用。本發明優先利用哺乳動物細胞。
根據所用的宿主細胞不同，採用各種細胞常用的培養基在適於宿主細胞生長和增殖的條件下進行培養。重組DNA導入宿主細胞可以利用本領域專業人員熟知的方法進行，對於原核細胞如大腸桿菌，可以用氯化鈣處理製備感受態細胞的轉化法以及電擊轉化法，對於真核生物細胞特別是培養的哺乳動物細胞，採用的常用轉化方法包括磷酸鈣共沉澱法、脂質體包裝法以及顯微注射法等等。
在本發明的一個實施例中，通過PCR的手段獲得了人KCTD10基因的啟動子序列，並且發現KCTD10基因與人UBE3B基因(泛素蛋白連接酶E3B)頭頭相對，兩者間的距離只有大約300bp，進一步對KCTD10基因啟動子序列分析表明，這段序列富含GC，達到65％以上，儘管沒有TATA框和CCAAT框，但存在多個潛在的轉錄因子的結合位點，其中包括兩個Sp1，兩個AP-2，兩個c-Myb，一個CACCC-box等。現在已經證明許多富含GC的啟動子缺乏典型的TATA或DPE核心元件，但Sp1和其它相關的轉錄因子結合於啟動子，並通過與其它基本轉錄複合物相互作用組裝成轉錄起始複合體，啟動基因的轉錄(Brandeis等人，Nature.371，435-438(1994)；Macleod等人，Genes Dev.8，2282-2292(1994))。這說明分離的序列包含了典型的啟動子區域。
本發明還通過引物延伸方法確定了人KCTD10基因啟動子的轉錄起始位點為腺嘌呤A，位於KCTD10基因翻譯起始位點上遊63bp。
在另一實施例中，本發明將含有不同長度的人KCTD10基因啟動子的表達載體導入哺乳動物細胞，使報告基因得到瞬時表達，分析了人KCTD10基因啟動子的活性以及轉錄活性主要存在的區段，並找出了起調控作用的主要反式作用因子以及其作用位點。
下面結合實施例，進一步闡述該發明。
實施例1人KCTD10基因啟動子的克隆、測序設計併合成一對引物，引物序列如下正向5』-GGGGTACCTGGAGCACACACGCCAGATC-3』(SEQ ID NO2)
反向5』-CCAAGCTTCGGACTGAGAGAGGCAGGAA-3』(SEQ ID NO3)以人基因組DNA為模板進行PCR擴增。反應體系為12.5μl 2×GC buffer，0.1mM dNTP(2.5mM)，正向和反向引物各0.2μM，1單位的LA Taq DNA聚合酶(購自大連寶生物)，50ng的模板DNA，加無菌水至25μl。反應程序為94℃預變性2分鐘，然後進行5個循環(每個循環包括94℃變性45秒，49℃退火45秒，72℃延伸1.2分鐘)，接著進行30個循環(每個循環包括94℃變性45秒，68℃退火45秒，72℃延伸1.2分鐘)，最後72℃延伸5分鐘。
得到的PCR產物即為人KCTD10基因的啟動子，其長度為639bp。將該產物用KpnI和HindIII酶切，並將此酶切產物克隆到用同樣酶切處理的帶有螢光素酶報告基因的pTAL-Luc載體(購自Clontech公司)中，得到質粒P(-609/+30)，並測序。序列如圖1和SEQ ID NO1所示。
實施例2人KCTD10基因啟動子的序列分析將人KCTD10基因啟動子的序列(SEQ ID NO1)用PromoterInspector在線軟體(網址http//www.genomatix.de)和TFSEARCH軟體(網址http//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)進行分析，發現該段序列沒有典型的TATA盒，但含有CpG島。其中-108～+30bp之間有2個c-myb結合位點、1個SREBP-1結合位點、2個Sp1結合位點和2個AP-2結合位點。如圖1所示，c-myb.1位點位於-100～92之間，SREBP-1位點位於-61～-53之間，Sp1.1位點位於-68～-62之間，AP-2位點位於-16～-8之間。
實施例3人KCTD10基因轉錄起始位點的確定採用Promega公司的引物延伸試劑盒並按說明書上的方法進行。設計併合成引物，引物序列為5』-TCTCCAAACCCGGACTGAGA-3』(SEQ ID NO4)。用T4多聚核苷酸激酶和[γ-32P]ATP標記引物。然後將10fmol已標記的引物、10μg的小鼠RNA混合併在60℃下溫育30分鐘，然後加入1單位的AMV反轉錄酶，在42℃溫度條件下溫育40分鐘。同時，以人KCTD10基因啟動子序列為模板，用Cycler DNA測序試劑盒(構自MBI公司)進行測序，測序的引物與反轉錄引物相同。最後，將反轉錄產物和測序產物在同一個測序膠上電泳，然後按常規方法進行幹膠、壓X光片和衝洗X光片。結果如圖2所示，左邊序列為測序膠所測得的核苷酸序列，人KCTD10基因轉錄起始位點被定位於核苷酸A，位於翻譯起始點(ATG)上遊63bp處。
實施例4人KCTD10基因啟動子的真核表達質粒的構建為了確定人KCTD10基因啟動子的主要轉錄活性區段，我們通過PCR手段以實施例一中所構建的P(-609/+30)載體為模板，將質粒P(-609/+30)中所包含的SEQ ID NO1所顯示的人KCTD10基因啟動子序列分割成六段不同長度的片段，然後連接到螢光素酶報告基因載體pTAL-Luc中，構建一系列重組表達質粒。用引物PLuc-KCTD10-R(SEQ ID NO3)和引物P(-343/+30)-F2GGGGTACCCGACGCACTACCGCCATCGT(SEQ ID NO5)得到一373bp片段，然後此片段經過KpnI和HindIII酶切，插入pTAL-Luc的KpnI和HindIII之間，得到質粒P(-343/+30)。用引物P(-609/+30)-F1GGGGTACCTGGAGCACACACGCCAGATC(SEQ ID NO2)以及引物P(-609/-241)-RCCAAGCTTTTCCTTCCCGGGCGAAGAAG(SEQ ID NO6)得到一368bp片段，此片段經過KpnI和HindIII酶切，插入pTAL-Luc的KpnI和HindIII之間，得到質粒P(-609/-241)。
此外，我們分別上遊引物P(-241/+30)-F3、P(-203/+30)-F4、P(-108/+30)-F5及P(-13/+30)-F6和共有的下遊引物PLuc-KCTD10-R(SEQ ID NO3)PCR分別得到271bp、233bp、138bp和43bp的片段，這些片段都用KpnI和HindIII酶切，插入pTAL-Luc的KpnI和HindIII之間，分別得到質粒P(-241/+30)、P(-203/+30)、P(-108/+30)和P(-13/+30)。引物P(-241/+30)-F3、P(-203/+30)-F4、P(-108/+30)-F5及P(-13/+30)-F6的序列如下P(-241/+30)-F3GGGGTACCCTTCTTCGCCCGGGAAGGAA(SEQ ID N07)P(-203/+30)-F4GGGGTACCGCAGCTGAAATAGCGGAGGT(SEQ ID NO8)P(-108/+30)-F5GGGGTACCAACGGACGGCTTAAGACGTT(SEQ ID N09)P(-13/+30)-F6GGGGTACCCCGGCTGGCGTGAGCTGGGT(SEQ ID NO10)除了上述的按照5』到3』的方向對小鼠PDIP1基因啟動子作系列缺失外，本發明還採用重疊PCR的方法(參見薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002年，第1109-1112頁)對質粒P(-203/+30)中啟動子序列上的c-myb.1、SREBP-1、AP-2.2和Sp1.1結合位點進行了突變。所用的引物(小寫字母表示突變核苷酸)如下c-myb.1位點的突變引物正向CTAGGCGaAtcAtGGACGGC(SEQ ID NO11)反向GCCGTCCaTgaTaCGCCTAC(SEQ ID NO12)SREBP-1位點突變引物正向GCGGAAtTaGtGTGCGGACA(SEQ ID NO13)反向TGTCCGCACaCtAaTTCCGC(SEQ ID NO14)Sp1.1位點突變引物正向CCTCTGCGaGtCaGAAGTGG(SEQ ID NO15)反向CCACTTCtGaCtCGCAGAGG(SEQ ID NO16)AP-2.2位點突變引物正向CGCCTCCGtCaCCGtCTGGC(SEQ ID NO17)
反向GCCAGaCGGtGaCGGAGGCG(SEQ ID NO18)實施例5人KCTD10基因啟動子的主要轉錄活性區段的確定(1)在5％CO2培養箱中用DMEM完全培養液(含10％新生牛血清、2mM L-穀氨酸，100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素)培養HeLa細胞。
(2)至細胞密度為90％左右時，完全培養液換成沒有抗生素和血清的培養液，換液3小時以後分別將實施例5所述的包含KCTD10基因啟動子不同區段的重組表達質粒和β-半乳糖苷酶報告質粒pCMV-LacZ(作為內對照，購自Promega公司)共轉染人HeLa細胞，轉染試劑採用LipofectamineTM2000(購自Invitrogen/Gibco公司)，並按產品說明書所述的方法進行轉染。24孔板每一孔轉染0.5μg樣品DNA、0.5μg pCMV-LacZ。
(3)轉染6小時以後，再把培養液換成完全培養液，36小時後，收穫細胞。使用Luciferase Assay System試劑盒(購自Promega)，在TD-20/20型螢光照度計(購自Promega)下測量螢光強度。以共表達的β-半乳糖苷酶活性作為內標，用來校正因轉染率不同而造成的螢光素酶活性差異。β-半乳糖苷酶活性的測定按照凱裡等人的方法(參見凱裡等，真核生物轉錄調控-概念、策略與方法，科學出版社，2002，p178-179)進行。
實驗結果如圖3所示。結果表明，其轉錄活性主要區段在-108～+30bp之間(對應於SEQID NO1中501-639位的核苷酸序列)。
實施例6轉錄因子c-myb、SREBP-1、AP-2和Sp1對人KCTD10基因啟動子轉錄活性的分析如實施例4所述，對質粒P(-203/+30)中啟動子序列上的c-myb、SREBP-1、AP-2和Sp1結合位點進行了突變。然後將各種突變轉入HeLa細胞中並按實施例5所述的方法分析各個突變體的轉錄活性。實驗結果如圖4所示，突變了c-myb.1位點，轉錄活性降低了28.6％；突變SREBP-1位點，轉錄活性增加了27.4％；突變Sp1.1位點，轉錄活性降低了46.9％；突變AP-2.2位點，轉錄活性升高了88.1％。說明c-myb和Sp1對人KCTD10基因啟動子起正調控作用，而SREBP-1和AP-2則起負調控作用。
為了進一步證實Sp1和AP-2在KCTD10基因調控中的功能，我們將野生型質粒P(-203/+30)或Sp1.1位點突變的突變型質粒MT-Sp1.1和pCMV-Myc-Sp1(Sp1的真核表達質粒)共轉染HeLa細胞。結果如圖5所示，野生型質粒P(-203/+30)在Sp1過表達下，啟動子活性上調58.3％，而突變型質粒MT-Sp1.1在Sp1過表達下，啟動子活性只增加了15.4％。說明轉錄因子Sp1激活KCTD10基因轉錄。此外，我們將質粒P(-203/+30)和pCMV-Myc-AP-2α(AP-2α的真核表達質粒)共轉染HepG2細胞。結果如圖6所示，隨著pCMV-Myc-AP-2α的量的增加，啟動子的活性逐漸下降，進一步說明轉錄因子AP-2α抑制KCTD10基因轉錄。
序列表110湖南師範大學120人KCTD10基因啟動子130生物領域1601170PatentIn version 3.12101211700212DNA213Homo sapiens220
221promoter222(1)..(700)223
4001tggagcacac acgccagatc ccagcacttg ttcctccgac ctggccaggc agggactgtg60ccctagagcc aactccctca aagtccccag ccccaccact cggaggactg acgacccagt120tctcccgcag gccggaccgc aggccctacc ggcctacccg caggccgacc tttattcgcc180ggaggtcccc gcacttgggg tcggggccgc agctgccact gtctcagccc aaaacacccg240agttctgcca gacccggggc agcagccgac gcactaccgc catcttgccc cgcggtgttc300gctttcagaa ccccgccagg aagcaagcat ccagttccgg aaaatgacag ttccgcagag360cttcttcgcc cgggaaggaa aacttcccca caccttgcct cccctctggc agctgaaata420gcggaggtgg gataaatgcc ctccccagcc gagaaaagct ggaacccact ccggccgggg480aggctggaaa gaaaactggc ccctaggcgc acaacggacg gcttaagacg ttgccctctg540cggggcggaa gtggggtgcg gacagcggaa gttatcgctc cggccccgcc tccgcccccg600gctggcgtga gctgggtgtt tcctgcctct ctcagtccgg gtttggagac tcctgcgtcc660tccgactttt catggtaggg agggcggtgc ccatggacta 700
權利要求
1.一種人KCTD10基因啟動子，其特徵在於它包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的人KCTD10基因啟動子，其特徵在於它具有SEQ ID NO1中501-639位的核苷酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的人KCTD10基因啟動子，其特徵在於對其起調控作用的主要轉錄因子有c-myb、CACCC-box、Sp1和AP-2。
4.一種載體，其特徵在於包含權利要求1所述的啟動子的載體。
5.根據權利要求4所述的載體，其特徵在於它還含有所述的啟動子可操作地連接的外源基因。
6.根據權利要求5所述的載體，其特徵在於所述的基因是報告基因。
全文摘要
本發明提供了人KCTD10基因(鉀離子通道四聚化結構域包含蛋白10基因)啟動子，它包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發明的人KCTD10基因啟動子元件可用於研究DNA複製、修復和細胞凋亡過程中重要分子的功能，以及用來篩選DNA複製、修復和細胞凋亡相關疾病的藥物等。
文檔編號C12N15/65GK1844389SQ200610031279
公開日2006年10月11日 申請日期2006年2月28日 優先權日2006年2月28日
發明者張健, 周愛東, 周建林, 胡翔, 劉如石, 楊利平 申請人:湖南師範大學