一種抗菌脂肽皮脂膜修復組合物及其應用的製作方法
2023-05-27 19:00:36
本發明涉及一種抗菌脂肽皮脂膜修復組合物及其應用，屬於生物醫藥技術領域。
背景技術：
枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)由cohn於1872年正式命名，現屬於芽孢桿菌科。枯草芽孢桿菌是一類嗜熱、好氧、內生抗逆孢子的革蘭式陽性桿菌，容易分離培養，且能產生多種抗菌素和酶。研究表明該菌的抗菌物質能產生40多種具有不同結構和功能的抗菌物質。因其具有發達的分泌系統，近年來，科學家從枯草芽孢桿菌中分離純化出多種有效的抗菌物質，根據產生抗菌物質的途徑可分為核糖體和非核糖體合成兩種。核糖體合成途徑主要包括酶類、細菌素以及活性蛋白質類。非核糖體合成途徑主要包括脂肽類、多肽類、磷脂類、多烯類等。其中脂肽類和肽類有很高的應用價值。目前，相關研究表明枯草芽孢桿菌所產生的抗菌物質對植物病原菌、食品腐敗菌、致病菌都有抑制作用，其通過分解細菌和真菌的細胞膜或細胞壁，來造成細胞中原生質的洩露，導致菌絲斷裂或畸形，同時其對孢子的萌發也有抑制作用。由於枯草芽孢桿菌產生的抗菌素是天然合成、無汙染，具有廣譜抗菌活性，不易產生耐藥性，是目前解決抗生素和農藥濫用導致耐藥菌株出現和藥物殘留等問題的理想替代品之一。
枯草芽孢桿菌產生的抗菌物質種類豐富，其中肽類和脂肽類物質被認為是具有潛力的抗菌類藥物。抗菌肽含有10～50個胺基酸，帶有2～9個正電荷，具有高穩定性，對酸、鹼、高溫等環境條件有著很高的耐性，且抗菌活性高、抗菌譜廣、無毒副作用、無殘留和無汙染等優點。脂肽類抗生素由arima等人於1968年在枯草芽孢桿菌中發現，商品名為表面活性素(surfaction)。其表現出兩親性特徵，含有親水性胺基酸，在中性ph下分子帶負電荷，具有良好的水溶性；含有脂肪酸鏈和疏水性基團，具有良好的脂溶性，易與細菌磷脂層相互反應，有很好的抗菌效果。
皮膚作為人體最大的器官，為保護人體不受外界環境侵害的重要保護屏障。而當皮膚因各種原因缺損時，往往會導致皮膚感染、體液流失，所以在早期採取有效的措施來封閉創面可避免這些症狀的產生。製作一種皮脂膜修復貼，在皮膚受損傷時可以暫時替代皮膚的部分功能，保護傷口、減少感染。其主要成分包括羧甲基殼聚糖、幾丁糖、抗菌肽和脂肽類抗生素。鄭立等人提出羧甲基殼聚糖具有良好的吸收、保溼、止血、促進癒合等作用，且有優良的成膜性，被廣泛應用於藥物緩釋載體(羧甲基殼聚糖膜對皮膚成纖維細胞相容性研究；鄭立，陳西廣等；生物化學與生物物理進展；2003,30(2)：314-320)。朱其聰等人提出，幾丁糖可促進上皮細胞、內皮細胞生長而抑制成纖維細胞生長的醫用高分子多糖物質，臨床上應用於燒傷、褥瘡、外傷、潰瘍、膿腫等治療均有良好效果(幾丁糖、透明質酸酶治療多烯紫杉醇外滲性大鼠皮膚損傷；朱其聰，李愛民等；癌症；2007,26(4)：346-350)。
中國專利文獻cn101892177a(申請號201010129850.3)公開了一種微生物發酵生產抗真菌脂肽和其抗真菌脂肽的皮膚擦劑，屬於生物技術領域。具體涉及一種發酵糖質原料生產抗真菌脂肽的微生物枯草芽孢桿菌bi1(bacillussubtilisbi1)，保藏號為cgmccno.3412，同時本發明還涉及利用該微生物發酵生產的抗真菌脂肽提取物和含該提取物的塗膜劑及其塗膜劑的製備方法。採用本發明的塗膜劑治療皮膚癬病，平均治癒時間7天，治癒率達到100％，為患者治療皮膚癬病提供了一種良好的治療藥物。
中國專利文獻cn205181606u(申請號cn201520835574.0)公開了一種創面修復貼。該創面修復貼採用生物玻璃作為主要材料，可吸附和穩定創面組織，有抑菌、促進癒合的功效。但生物玻璃是一種矽酸鹽玻璃，屬於人工生物材料。
技術實現要素：
本發明針對現有技術的不足，提供一種抗菌脂肽皮脂膜修復組合物及其應用。
本發明技術方案如下：
一種皮脂膜修復組合物，藥效成分如下，均為重量份：
羧甲基殼聚糖2～5份，幾丁糖0.5～2份，聚丙烯酸鈉1～2份，抗菌肽2～3份，脂肽類抗生素2～3份；
所述抗菌肽、抗脂肽類抗生素為將枯草芽孢桿菌發酵液經分離步驟後，通過提取抗菌肽、抗脂肽類抗生素獲得；
所述為將枯草芽孢桿菌發酵液經分離步驟後，通過提取抗脂肽類抗生素步驟獲得。
根據本發明優選的，藥效成分如下，均為重量份：
羧甲基殼聚糖5份，幾丁糖2份，聚丙烯酸鈉1.5份，抗菌肽3份，脂肽類抗生素3份。
根據本發明優選的，所述枯草芽孢桿菌發酵液採用如下方法製備：
(1)將枯草芽孢桿菌接種於液體培養基中進行活化培養至對數生長期，製得活化菌體；
所述液體培養基組分如下，均為重量百分比：
酵母膏0.5～1％，蛋白腖0.7～1％，氯化鈉0.5～1.2％，餘量水，ph7.0～7.2；
(2)將步驟(1)製得的活化菌體按體積百分比3～5％接種於液體發酵培養基中，在28～38℃下，發酵培養24～48小時，製得微生物發酵液；
所述液體發酵培養基組分如下，均為重量百分比：
酵母膏0.1～0.3％，蛋白腖0.7～1％，葡萄糖1～1.5％，l-穀氨酸0.1～0.5％，穀氨酸鈉0.1～0.5％，l-苯丙氨酸0.1～0.5％，澱粉0.05～0.1％，糊精0.05～0.1％，磷酸二氫鉀0.07～0.1％，硫酸鎂0.01～0.05％，氯化鉀0.01～0.05％，餘量水，ph7.0～7.2。
根據本發明優選的，所述分離步驟如下：
(i)將微生物發酵液在4℃、8000r/min的條件下離心15～20min，取上清，調ph至2.0～2.5，4℃沉澱1h，然後10000r/min的條件下離心15～20min，取沉澱，用體積百分比濃度為70％的甲醇溶液溶解提取2～4次，調ph值至中性，經旋轉蒸發儀除去甲醇後真空乾燥，製得抗菌粗提物；
(ii)將步驟(i)製取的抗菌粗提物經甲醇溶解，0.45μm微孔濾膜過濾，上樣於sephadexlh-20柱，分段收集樣品，通過tlc檢測，獲得含抗菌肽和脂肽類抗生素的餾分。
根據本發明進一步優選的，所述步驟(i)中，ph調節劑為5.5～6.5mol/l的hcl。
根據本發明進一步優選的，所述步驟(i)中，真空乾燥條件為40℃真空乾燥55～65min。
根據本發明進一步優選的，所述步驟(i)中，所述甲醇溶液溶解提取時間為2小時，提取過程中磁力攪拌，提取後過濾去除沉澱。
根據本發明進一步優選的，所述步驟(ii)中，所述含抗菌肽和脂肽類抗生素的餾分用hplc進行進一步純化。
根據本發明優選的，所述枯草芽孢桿菌為購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmcc)，保藏編號為1.1413的枯草芽孢桿菌。
一種枯草芽孢桿菌抗菌脂肽皮脂膜修復貼，包括透氣層、壓敏膠層和保護層，壓敏膠層設置於透氣層與保護層之間，上述皮脂膜修復組合物塗覆於壓敏膠層的外表面。
上述枯草芽孢桿菌抗菌脂肽皮脂膜修復貼的製備方法，步驟如下：
a、按重量份比例將羧甲基殼聚糖、幾丁糖和聚丙烯酸鈉混合均勻，然後加入抗菌肽和脂肽類抗生素，加入生理鹽水溶液按重量份補足100份，製得皮脂膜修復組合物溶液；
b、將步驟a製得的皮脂膜修復組合物溶液塗敷於壓敏膠層外表面，然後封裝透氣層和保護層，製得枯草芽孢桿菌抗菌脂肽皮脂膜修復貼。
有益效果
1、本發明首次將羧甲基殼聚糖、幾丁糖與枯草芽孢桿菌發酵液中提取的抗菌肽和脂肽類抗生素以及聚丙烯酸鈉混合製得皮脂膜修復組合物，通過實驗發現，抗菌肽和脂肽類抗生素除具有抗病毒、抗真菌和抗細菌等廣譜抗菌活性和不易產生抗藥性的原有優點外，還可以促進羧甲基殼聚糖與幾丁糖在皮膚損傷修復過程中的效果；
2、本發明所述的皮脂膜修復組合物中，枯草芽孢菌產生的脂類物質與皮膚表面的脂類物質非常相似，可與創面的水份通過乳化作用產生脂類膜，對創面進行保護；另外，羧甲基殼聚糖和幾丁質有很好的修復功效，具有保溼、止血、促進癒合的作用。當使用皮脂膜修復貼時，會在傷口處成膜，保護皮膚不受外界微生物的侵入，可以更好的對受損皮膚組織進行修復；
3、本發明所述的皮脂膜修復組合物中，聚丙烯酸鈉做為增稠劑，對人體無害，主要起乳化分散的作用，可以促進皮脂膜修復組合物成分的均勻，提高使用效果；
4、本發明所述皮脂膜修復組合物原料非人工合成材料，其來源純天然、無汙染，對人體安全、無害，所述枯草芽孢桿菌抗菌脂肽皮脂膜修復貼製作簡單，成本低，臨床上對燒傷、褥瘡、外傷、潰瘍、膿腫等治療均有良好效果，可在臨床上廣泛應用。
附圖說明
圖1為本發明所述的一種枯草芽孢桿菌抗菌脂肽皮脂膜修復貼及其生產方法，的結構示意圖；
圖中：1、壓敏膠層，2、保護層，3、透氣層。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步闡述，但本發明所保護範圍不限於此。
實例中涉及的儀器設備：
amiconultra-15超濾管，上海俊晟生物科技有限公司；sephadexg-50凝膠柱，反相hplc；製備型hplc系統，waters公司；kromasilc18色譜柱，250×21.2mm；fd5-4真空冷凍乾燥機，美國sim公司；re-3000b旋轉蒸發儀，上海普渡生化科技有限公司。
實施例中所述枯草芽孢桿菌所述枯草芽孢桿菌為購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmcc)，保藏編號為1.1413的枯草芽孢桿菌。
實施例1
一種皮脂膜修復組合物，藥效成分如下，均為重量份：
羧甲基殼聚糖2份，幾丁糖0.5份，聚丙烯酸鈉1份，抗菌肽2.5份，脂肽類抗生素2.5份；
所述抗菌肽、抗脂肽類抗生素為將枯草芽孢桿菌發酵液經分離步驟後，通過提取抗菌肽、抗脂肽類抗生素獲得；
枯草芽孢桿菌發酵液採用如下方法製備：
(1)將枯草芽孢桿菌接種於液體培養基中進行活化培養至對數生長期製得活化菌體；
液體培養基組分如下，均為重量百分比：
酵母膏0.5％，蛋白腖0.7％，氯化鈉0.5％，餘量水，ph7.0；
(2)將步驟(1)製得的活化菌體按體積百分比5％接種於液體發酵培養基中，在37℃下，發酵培養30小時，製得微生物發酵液；
液體發酵培養基組分如下，均為重量百分比：
蛋白腖0.7％，酵母膏0.1％，葡萄糖1％，l-穀氨酸0.1％，穀氨酸鈉0.1％，l-苯丙氨酸0.1％，澱粉0.05％，糊精0.05％，磷酸二氫鉀0.07％，硫酸鎂0.01％，氯化鉀0.01％，餘量水，ph7.0。
根據本發明優選的，所述分離步驟如下：
(i)將微生物發酵液在4℃、8000r/min的條件下離心20min，取上清，6.0mol/l的hcl調ph至2.5，4℃沉澱1h，然後10000r/min的條件下離心20min，取沉澱，用體積百分比濃度為70％的甲醇溶液溶解提取3次，調ph值至中性，經旋轉蒸發儀除去甲醇後-20℃真空乾燥60min，製得抗菌粗提物；
所述甲醇溶液溶解提取時間為2小時，提取過程中磁力攪拌，提取後過濾去除沉澱；
(ii)將步驟(i)製取的抗菌粗提物經甲醇溶解，0.45μm微孔濾膜過濾，上樣於sephadexlh-20柱，分段收集樣品，通過tlc檢測，獲得含抗菌肽和脂肽類抗生素的餾分；所述含抗菌肽和脂肽類抗生素的餾分利用hplc進行進一步純化，製得抗菌肽、抗脂肽類抗生素。
實施例2
如實施例1所述的皮脂膜修復組合物，不同之處在於藥效成分如下，均為重量份：
羧甲基殼聚糖3.5份，幾丁糖1.5份，聚丙烯酸鈉2份，抗菌肽2份，脂肽類抗生素2份。
實施例3
如實施例1所述的皮脂膜修復組合物，不同之處在於藥效成分如下，均為重量份：
羧甲基殼聚糖5份，幾丁糖2份，聚丙烯酸鈉1.5份，抗菌肽3份，脂肽類抗生素3份。
實施例4
如實施例1所述的皮脂膜修復組合物，不同之處在於枯草芽孢杆購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmcc)，保藏編號為1.1216的枯草芽孢桿菌。
對比例1
如實施例1所述的皮脂膜修復組合物，不同之處在於藥效成分如下，均為重量份：
羧甲基殼聚糖2份，幾丁糖0.5份，聚丙烯酸鈉1份，甲殼素2.5份，雄黃2.5份。
對比例2
如實施例1所述的皮脂膜修復組合物，不同之處在於藥效成分如下，均為重量份：
聚乙烯醇2份，透明質酸0.5份，聚丙烯酸鈉1份，抗菌肽2.5份，脂肽類抗生素2.5份。
實施例5
一種枯草芽孢桿菌抗菌脂肽皮脂膜修復貼，包括透氣層、壓敏膠層和保護層，壓敏膠層設置於透氣層與保護層之間，皮脂膜修復組合物塗覆於壓敏膠層的外表面；
所述枯草芽孢桿菌抗菌脂肽皮脂膜修復貼的製備方法，步驟如下：
a、按重量份比例將羧甲基殼聚糖、幾丁糖和聚丙烯酸鈉混合均勻，然後加入抗菌肽和脂肽類抗生素，加入生理鹽水溶液按重量份補足100份，製得皮脂膜修復組合物溶液；
b、將步驟a製得的皮脂膜修復組合物溶液塗敷於壓敏膠層外表面，然後封裝透氣層和保護層，製得枯草芽孢桿菌抗菌脂肽皮脂膜修復貼。
實驗例
分別將實施例1～4及對比例1～2製得的皮脂膜修復組合物按照實施例5製備成皮脂膜修復貼，分別標號樣品1～4及對照1～2，按照如下方法進行檢測：
準備重量(200±10)gspf級大鼠30隻，雌雄各半。將大鼠隨即分為6組，每組5隻。用電動剪刀去除30隻大鼠後肢的毛髮，暴露皮膚直徑至少5cm，觀察24小時，剪毛部位未產生炎症反應。稱大鼠重量，隨後進行麻醉，常規消毒，製作大鼠皮膚潰瘍模型(參考《不同品種大黃油糊外用抗炎作用及對大鼠皮膚潰瘍、痔瘡模型的影響》；白明，劉丹丹等；中國現代應用藥學；2013，30(6)：575-581)，在其暴露皮膚切割一個圓形潰瘍(1.8cm×2.5cm)，將製作的皮脂膜修復貼覆蓋在其創傷處，每組大鼠放置在同一籠裡飼養，自由進食進水，每2h觀察傷口變化，每24h更換新的修復貼，至傷口修復(潰瘍面積＜0.2cm×0.3cm)完全再次稱大鼠重量，結果如表1所示：
表1
根據本發明實驗結果，實施例1～3通過改變一種皮脂膜修復貼的藥效成分比例，均能對創傷部位進行修復，療效顯著，且創口處未見流膿、發紅、腫脹等感染情況。
根據本發明實驗結果，實施例4通過改變提取抗菌物質的枯草芽孢桿菌型號，證實只要能產抗菌物質的枯草芽孢桿菌均能應用於本發明，但修復時間和效果較實施例1～3稍差。
根據本發明實驗結果，對比例1通過替換皮脂膜修復組合物中抗菌成分，雖然對創口也有一定的治療效果，但創口處附近出現輕微發紅的感染現象，證實其沒有抗菌肽、脂肽類抗生素抑菌效果好。
根據本發明實驗結果，對比例2通過將皮脂膜修復組合物中的羧甲基殼聚糖和幾丁質替換為功能類似的聚乙烯醇和透明質酸後，治療時間長，效果較差，創口處出現流膿和發紅的感染現象，從而證明本發明所述的技術效果是羧甲基殼聚糖和幾丁質與其他成分互相作用的結果，簡單採用類似功能的替代物替換後，無法獲得類似的技術效果。
根據本發明實驗結果可以看出，羧甲基殼聚糖、幾丁糖、聚丙烯酸鈉、抗菌肽和脂肽類抗生素共同作用時，脂肽類抗生素可在皮膚表面快速形成脂膜，有效防止感染，起到快速癒合創傷的技術效果。