利用促進牡丹生長並拮抗病原菌的細菌使牡丹種子萌發和促進牡丹幼苗生長的方法

2023-05-27 21:29:36

利用促進牡丹生長並拮抗病原菌的細菌使牡丹種子萌發和促進牡丹幼苗生長的方法
【專利摘要】本發明公開了利用促進牡丹生長並拮抗病原菌的細菌使牡丹種子萌發和促進牡丹幼苗生長的方法。本發明的使牡丹種子生根和萌發的方法，包括將休眠的牡丹種子進行浸種處理得到浸種後的牡丹種子，用多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus?polymyxa）CSM1101處理所述浸種後的牡丹種子1-3小時，得到菌劑處理的牡丹種子，將所述菌劑處理的牡丹種子進行培養得到生根和發芽的幼苗；所述多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus?polymyxa）CSM1101在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?No.8527。
【專利說明】利用促進牡丹生長並拮抗病原菌的細菌使牡丹種子萌發和 促進牡丹幼苗生長的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及利用促進牡丹生長並拮抗病原菌的細菌使牡丹種子萌發和促進牡丹 幼苗生長的方法。

【背景技術】
[0002] 植物根際是指生物、化學和物理特性受到影響的緊密環繞植物根的區域，其範圍 內的微生物多而活躍，構成了根際特有的微生物區系。根際微生物區其中主要以細菌為主， 其中對植物有益的菌群稱為植物促生根際菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria， PGPR)。PGPR旺盛的代謝作用，如生物固氮、解磷作用、產生鐵載體等，可加強土壤中有機物 質的分解和植物營養元素的礦化，同時其分泌的多種植物生長激素可促進植物的根系發達 發育、從而加強對營養物質的吸收，促進植物的生長發育。
[0003] 牡丹歸芍藥科（Paeoniaceae)、芍藥屬（Paeonia)，一直以來都是中國最重要的觀 賞植物和藥用植物之一。近年來，牡丹的油用價值日漸凸顯，牡丹已經成為兼具觀賞價值、 藥用價值和油用價值的重要經濟植物。對於觀賞牡丹來講，一個突出的問題是，由於不同地 區氣候環境和土壤性質的差異造成的土壤微生態活性降低，是引種地區栽培牡丹生長狀況 不良、觀賞性狀下降的重要原因之一。而對於油用牡丹，如何科學施肥並顯著提高牡丹籽 的產量則是非常迫切的問題。在牡丹的栽培過程中，還面臨著一些真菌病害的威脅，主要 有灰黴病（Botrytis paeoniae)、紅斑病（Cladosporium aeoniae)和褐斑病（Cercospora paeoniae)等。此外，牡丹種子具有休眠特性，牡丹種子成熟當年秋播後，胚根逐步發育成 根，但是胚軸不伸長，處於休眠狀態，必須經過一定的低溫期(約60?90天）和一定的低溫 值(約0?10°C)以後，上胚軸才能解除休眠而發芽出土。如何促使牡丹種子儘早萌發，並 且得到較高的發芽率是改進牡丹播種育苗技術的關鍵之一。
[0004] 因此，研製促進牡丹生長並拮抗多種病原菌的微生物菌劑具有顯著和迫切的現實 意義。目前大多數菌劑的發酵都採用澱粉質原料，但我國耕地資源緊張，糧食生產壓力巨 大，難以支撐龐大發酵工業的可持續發展。因此，需要尋找更豐富的可再生資源作為原料用 於菌劑的生產。


【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的一個技術問題是提供一種利用促進牡丹生長並拮抗病原菌的 細菌提高牡丹種子的生根率、縮短牡丹種子生根時間、提高主根長度> 40mm的種子百分率 和增加牡丹種子主根長度的使牡丹種子生根(使牡丹種子胚根萌發）的方法。
[0006] 本發明所提供的使牡丹種子生根的方法，包括將休眠的牡丹種子進行浸種處理得 到浸種後的牡丹種子，用多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101處理所述浸 種後的牡丹種子1-3小時(如1小時)，得到菌劑處理的牡丹種子，將所述菌劑處理的牡丹 種子進行生根培養得到牡丹生根種子；所述多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 8527。
[0007] 上述使牡丹種子生根的方法中，所述生根培養為將所述菌劑處理的牡丹種子與層 積基質混合在l〇_25°C (如晝20-25°C，夜10-15°C)放置。
[0008] 上述使牡丹種子生根的方法中，所述層積基質可為珍珠巖或河沙等。
[0009] 上述使牡丹種子生根的方法中，用多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101處理所述浸種後的牡丹種子1-3小時為將所述浸種後的牡丹種子置於所述多粘類 芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101的菌懸液中浸泡1-3小時(如1小時)。
[0010] 上述使牡丹種子生根的方法中，所述多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101的菌懸液中所述多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101的含量為 108cfu/ml-109cfu/ml (如 109cfu/ml)。
[0011] 上述使牡丹種子生根的方法中，所述多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101的菌懸液按照包括如下步驟的方法製備：將促進牡丹生長並拮抗病原菌的菌劑懸 浮於無菌水中得到所述多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101的菌懸液，所 述多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101的菌懸液中所述多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa) CSM1101 的含量為 108cfu/ml-109cfu/ml (如 109cfu/ml);
[0012] 所述促進牡丹生長並拮抗病原菌的菌劑的製備方法包括：
[0013] (1)將玉米秸杆在180-20(TC和1. 0-2. OMpa條件下進行水熱處理，得到經過預處 理的玉米秸杆；
[0014] (2)將所述經過預處理的玉米秸杆粉碎後，用纖維素酶進行酶解，分別收集酶解液 和酶解殘渣；
[0015] (3)用所述酶解液、（NH4)2S04、MgS0 4、CaC03、玉米漿和水配製發酵培養基，每升所述 發酵培養基中所述酶解液的含量滿足每升所述發酵培養基的葡萄糖含量為20-50g ;
[0016] (4)向所述發酵培養基中接入促進牡丹生長並拮抗病原菌的細菌進行發 酵，發酵結束後收集發酵液，將所述發酵液和所述酶解殘渣混合，得到促進牡丹生長 並拮抗病原菌的菌劑；所述促進牡丹生長並拮抗病原菌的細菌為多粘類芽孢桿菌 (Paenibacilluspolymyxa) CSM1101，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 的保藏編號為CGMCC No. 8527。
[0017] 上述使牡丹種子生根的方法中，所述（1)中，所述水熱處理時間可為10_20min (如 10min 或 20min)。。
[0018] 上述使牡丹種子生根的方法中，所述（2)可為將所述經過預處理的玉米秸杆粉碎 後，按以乾重計每克秸杆加入10-15FPU (纖維素酶活單位）（如15FPU)的比例加入纖維素 酶，在55-80°C (如55°C )、pH為4. 8-5. 0的條件下在水中酶解24-48h (如48h)，得到玉米 秸杆酶解物，將所述玉米秸杆酶解物進行離心，分別收集上清液和沉澱，所述上清液即為所 述酶解液，所述沉澱即為所述酶解殘渣。
[0019] 上述使牡丹種子生根的方法中，每升所述發酵培養基中，（NH4)2S0 4的含量為10g， MgS04的含量為0. 4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g。所述（4)中，所述發酵液和 所述酶解殘渣可按照1:1的質量比進行混合。所述（2)中，所述粉碎是將所述經過預處理 的玉米秸杆粉碎至50-100目。
[0020] 上述使牡丹種子生根的方法中，所述（4)在30°C培養18-30小時（如24-30小時） 進行發酵。在本發明的一個實施方式中，在所述發酵培養基中培養14小時時補加所述酶解 液，使發酵培養基中的葡萄糖含量為20g/L，繼續培養16小時結束髮酵；在本發明的另一個 實施方式中，在所述發酵培養基中培養24小時結束髮酵。
[0021] 本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種利用促進牡丹生長並拮抗病原菌 的細菌縮短發芽時間、提高發芽率的使牡丹種子發芽(使牡丹種子胚芽萌發）的方法。
[0022] 本發明所提供的使牡丹種子發芽(使牡丹種子胚芽萌發）的方法，包括將上述任一 種使牡丹種子生根的方法得到的牡丹生根種子在3_5°C貯藏7-21天(如21天、7天或14天） 進行栽植，在10-25°C培養(如晝20-25°C，夜10-15°C)，得到萌芽的牡丹種子。
[0023] 上述使牡丹種子發芽(使牡丹種子胚芽萌發）的方法中，所述牡丹生根種子的主根 長度> 40mm。
[0024] 本發明所要解決的在一個技術問題是提供一種利用促進牡丹生長並拮抗病原菌 的細菌增加牡丹苗高和生物量的促進牡丹幼苗生長的方法。
[0025] 本發明所提供的促進牡丹幼苗生長的方法，包括將上述任一種使牡丹種子生根的 方法得到的牡丹生根種子在3-5°C貯藏7-21天(如21天、7天或14天)進行栽植，在10-25°C 培養(如晝20-25°C，夜10_15°C)，得到牡丹幼苗。
[0026] 上述促進牡丹幼苗生長的方法中，所述牡丹生根種子的主根長度> 40mm。
[0027] 上文中，所述牡丹可為鳳丹（Paeonia ostii)。
[0028] 實驗證明，以多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSMllOlCGMCCNo. 8527 為活性成分的促進牡丹生長並拮抗病原菌的菌劑顯著地促進了牡丹種子的生根(胚根萌 發）和發芽(胚芽萌發）和牡丹幼苗的生長：菌劑組層積處理的生根時間比對照組層積處 理提前了 10天；菌劑組層積處理的生根率達到95. 0%，比對照組層積處理的生根率提高了 33. 8% ;菌劑組層積處理的主根長度為69. 0mm，是對照組層積處理的1. 68倍；菌劑組層積處 理的主根長度彡40mm的種子百分率達到90±0. 5%，是對照組層積處理的1. 3倍；菌劑組層 積處理的發芽時間比對照組層積處理縮短了 10天；菌劑組層積處理的發芽率達到99. 0%， 是對照組層積處理的1. 2倍；菌劑組層積處理的苗高是對照組層積處理的1. 77倍，菌劑組 層積處理的乾重是對照組層積處理的2. 27倍。
[0029] 保藏說明
[0030] 菌種名稱：多粘類芽孢桿菌
[0031] 拉丁名：Paenibacillus polymyxa
[0032] 菌株編號：CSM1101
[0033] 保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0034] 保藏機構簡稱：CGMCC
[0035] 地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號
[0036] 保藏日期：2013年12月09日
[0037] 保藏中心登記入冊編號：CGMCC No. 8527

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1為菌劑組層積處理和對照組層積處理部分種子生根培養60天的照片。
[0039] a為對照組層積處理，b為菌劑組層積處理。

【具體實施方式】
[0040] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0041] 下述實施例中所用的牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae) ACCC36053和牡丹枝孢 黴（Cladosporium paeoniae)ACCC36063於本申請的申請日前均收藏於中國微生物菌種保 藏管理委員會農業微生物中心(簡稱ACCC，地址：北京市海澱區中關村南大街12號，中國農 業科學院農業資源與農業區劃研究所，郵編100081 )，這兩個菌株的收藏日均為2006年8月 31日，自收藏之日起，公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會農業微生物中心獲得該菌 株。
[0042] 下述實施例中所用的牡丹褐斑病病原菌為芍藥雜色尾孢黴菌 (Cercosporavarricolor Winter)(張建國，2001.牡丹的主要病害及防治.中國花舟園藝， 23 :32-34)公眾可從上海辰山植物園獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不 可作為其它用途使用。
[0043] 下述實施例中的牡丹為鳳丹（Paeonia ostii) (Jigang Han, Yao Song, Zhigang Liu, etc. 2011. Culturable bacterial community analysis in the root domains of two varieties of tree peony (Paeonia ostii). FEMS Microbiol Lett，322:15 - 24)公眾可從 上海辰山植物園獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使 用。
[0044] 下述實施例中所用的培養基如下：
[0045] 半固體 D6bereiner 無氮培養基：鹿糖，10g ;蘋果酸，5g ;KH2P04 · H20,0· 4g ; Κ2ΗΡ04 · Η20,0· lg ;MgS04 · 7Η20,0· 2g ;NaCl，0. lg ;CaCl2 · 2Η20,0· 02g ;FeCl3,0. Olg ; Na2Mo04 ·2Η20,0· 02g ;瓊脂，3g ;用蒸餾水定容至 1000ml、pH7. 0-7. 2。121°C蒸氣滅菌 20min。
[0046] D0bereiner無氮培養基：鹿糖，lOg ;蘋果酸，5g ;KH2P04 · H20,0· 4g ;K2HP04 · H20， 0· lg ;MgS04 · 7H20,0. 2g ;NaCl，0. lg ;CaCl2 · 2H20,0. 02g ;FeCl3,0. Olg ;Na2Mo04 · 2H20， 0· 02g ;瓊脂18g ;用蒸餾水定容至1000ml、pH7. 0-7. 2。121°C蒸氣滅菌20min。
[0047] NB培養基：葡萄糖5. 0g，蛋白腖5. 0g，牛肉膏3. 0g，用蒸饋水定容至1000ml, ρΗ7· 0-7. 2,121? 滅菌 20min。
[0048] ΝΑ培養基：葡萄糖5. 0g，蛋白腖5. 0g，牛肉膏3. 0g，瓊脂18g，用蒸饋水定容至 1000ml，ρΗ7· 0-7. 2,121? 滅菌 20min。
[0049] PDA培養基：葡萄糖20g，瓊脂18g，馬鈴薯200g，加水1000mL煮沸30min濾取汁 液，加水補足 1000ml，ρΗ6· 0-7. 0,121°C滅菌 20min。
[0050] 下述實施例中的纖維素酶購於生工生物工程(上海）股份有限公司。下述實施例 中的纖維素酶酶活力單位（FPU)定義為lg纖維素酶粉在55°C下60min內水解濾紙所得葡 萄糖μ mol數。纖維素酶酶活力的具體測定方法如下：取纖維素酶10. 00g，加100mlpH4. 85 的0. 05mol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液充分溶解，得到纖維素酶液，將纖維素酶液稀釋後，吸取 0. 5ml，加入0. 05mol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液1. 5ml，lX6cm新華一號濾紙條一張,δδ?下水 解60min。水解完畢後採用如下的DNS法測定體系中的葡萄糖含量，並計算纖維素酶的酶 活力。
[0051] 下述實施中，發酵培養基中葡萄糖含量的測定方法採用DNS法，具體如下：
[0052] (l)DNS試劑的配製：200g酒石酸鉀鈉，溶於一定量的水中，加熱溶解，添加 10. 0g3, 5-二硝基水楊酸，10g NaOH溶解後加入2g苯酚，0. 5g無水亞硫酸鈉，全部加熱溶解 後，冷卻至室溫，定容至l〇〇〇ml。
[0053] (2)葡萄糖標準曲線的繪製：準確稱取100. Omg分析純的無水葡萄糖(預先在 105°C乾燥至恆重)，用少量蒸餾水溶解後，定量轉移到100ml容量瓶中，再定容到刻度、搖 勻，濃度為lmg/mL。取10支試管，分別加入葡萄糖標準溶液0. 2mL、0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、 1. OmL、1. 2mL、1. 6mL後，用蒸餾水稀釋至2mL，再加入2. 5mL DNS試劑混合均勻，在沸水中加 熱5min。取出後即用水冷卻至室溫，定容到25ml，搖勻。30min後於520nm下測0D值。以 〇D 52(l值為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標繪製標準曲線，形式為Y=aX+b。
[0054] (3)發酵液中葡萄糖濃度的測定：取稀釋到一定濃度的發酵上清液（4000r/min， 離心20min)，加入2. 5mL DNS試劑混合均勻，在沸水中加熱5min。取出用水冷卻到室溫，定 容至25mL，搖勻，靜置30min後於520nm出測0D 52(I值。根據樣品的0D52(I值與標準曲線計算 發酵液中的葡萄糖含量。
[0055] 實施例1、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101的分離與鑑定
[0056] 一、多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101 的分離
[0057] 從安徽省銅陵市順安鎮金山村丹皮種植地的牡丹（Paeonia ostii，鳳丹）（株齡6 年）植株的根際採集土樣，將土樣放入裝有無菌水和滅菌玻璃珠的小三角瓶中，200rpm/min 振蕩20min ;取振蕩後的懸液做系列梯度稀釋，ΙΟ3、104稀釋度懸液各吸取200 μ 1均勻塗布 D0bereiner無氮培養基，置30°C培養4d後，挑取單菌落，在D0bereiner無氮培養基固體 培養基平板上用平板劃線法進行菌種純化。將分離純化所得的其中一個菌株命名為牡丹根 際固氮菌CSM1101。
[0058] 二、牡丹根際固氮菌CSM1101的鑑定
[0059] 1.形態特徵觀察和生理生化特性測定
[0060] 形態學和生理生化特性鑑定參考"伯傑氏系統細菌學手冊"(Garrity，2001)和"一 般細菌學常用鑑定方法"（東秀珠等，2001)，按照常規方法進行。
[0061] 牡丹根際固氮菌CSM1101的形態學特徵如下：革蘭氏陽性，運動，菌體呈杆狀，直 徑為0· 6-0. 8 μ m，長為2. 0-7. 6 μ m。芽孢柱狀，1. 6-3. 5 X 1. 2-1. 5 μ m，中生到次端生。孢 子囊明顯膨大成紡錘型或棒狀。其菌落邊緣不整齊裂片狀，半透明到不透明。後其菌落粗 糙，淺白色，中間略突起。菌落粘著在培養基表面。
[0062] 牡丹根際固氮菌CSM1101的生理生化特徵測定結果如下：
[0063] 水解澱粉：陰性；
[0064] 水解酪蛋白：陰性；
[0065] 水解明膠：陰性；
[0066] 利用檸檬酸鹽：陰性；
[0067] 酪氨酸分解：陰性；
[0068] 苯丙氨酸脫氨酶實驗：陰性；
[0069] 卵黃卵磷脂酶實驗：陰性；
[0070] 吲哚產生：陰性；
[0071] 馬尿酸鹽實驗：陰性；
[0072] 接觸酶實驗：陽性；
[0073] 硝酸鹽還原實驗：陽性；
[0074] 二羥丙酮產生：陽性；
[0075] 抗溶菌酶實驗：陽性；
[0076] 分解葡萄糖產酸產氣：陽性；
[0077] 分解阿拉伯糖產酸產氣：陽性；
[0078] 分解木糖產酸產氣：陽性；
[0079] 分解甘露醇產酸產氣：陽性；
[0080] 耐鹽性試驗：7%NaCl生長；
[0081] 在pH6. 8的營養肉湯培養基（NB)和pH5. 7的沙氏葡萄糖肉湯培養基中均可生長。 在MR-VP肉湯上產生乙醯甲基甲醇，pH6. 0。
[0082] 2. 16S rDNA的序列擴增和分析
[0083] 採用細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取基因組DNA作為PCR反 應的模板。PCR 引物（Pf5, -CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和 Pr5' -CGGGATCCAA GGAGGTGATCCAGCC-3'）由生工生物工程(上海）股份有限公司合成。使用Perkin-Elmer GeneAmp PCR System9700PCR 擴增細菌的 16S rDNA。反應體系為 10XPCR buffer，2.5uL; dNTP (2. 5mM) (TaKaRa)，2uL，Pf (10pmol/uL) 0· luL，Pr (10pmol/uL) 0· luL，Taq 聚合酶 (5U/uL) (TaKaRa)，0. 125uL，基因組 DNA0.5uL，加 ddH20 至 25uL。PCR 反應條件為，94°C預 變性5min，94°C變性lmin，52°C復性lmin，72°C延伸lmin，72°C最後延伸10min，30個循環。 PCR擴增產物由生工生物工程(上海）股份有限公司純化並測序。將菌株的16S rDNA序列 在GenBank核酸序列資料庫進行序列比較分析。
[0084] 結果表明測得的牡丹根際固氮菌CSM110116S rDNA序列全長1496bp，如SEQID No. 1。在GENBANK進行blastn分析的結果表明，其序列與Paenibacillus polymyxa strain M-l (EF656457)的相似性達到99%。
[0085] 根據牡丹根際固氮菌CSM1101的形態特徵、生理生化特徵和16s rDNA序列 同源性分析結果，將牡丹根際固氮菌CSM1101鑑定為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)。多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM1101 已於 2013 年 12 月 09 日 保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽 區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 8527。
[0086] 實施例2、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101的生物活性
[0087] 一、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101的固氮活性測定固氮活 性測定米用乙炔還原法。在15mmX 15mm螺口試管中加入2. 5mL半固體D5bereiner無氮培 養基，接種多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101CGMCC No. 8527後，塞好棉 塞，30°C培養24h ;再換無菌膠塞密封，抽出10%氣體，注入相同體積的乙炔，30°C培養24h。 抽取氣樣在Varian VISTA6000型氣相色譜儀上測定ARA(acetyiene reduction activity， 乙炔還原活性)。實驗設三個重複，取其平均值並計算方差不大於5%。
[0088] 測定結果表明，CSM1101在DSbereiner無氮培養基中表現出了較高的固氮活性。 其乙炔還原活性為12. 6C2H4nmol mdT1。
[0089] 二、多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101 的抑菌活性
[0090] 以牡丹葡萄抱菌（Botrytis paeoniae) ACCC36053、牡丹枝抱黴（Cladosporium paeoniae)ACCC36063、巧藥雜色尾抱黴菌（Cercospora varricolor Winter)中的任一菌株 單獨為病原菌，均採用平板對峙法測定抑菌率，具體方法如下：病原菌菌株在PDA斜面上活 化後，加入無菌水製成病原菌懸浮液，將病原菌懸浮液加到融化後冷卻到45-50°C的PDA培 養基中混勻倒平板，在30°C培養4天，得到病原菌平板，用直徑為6_的打孔器打取病原菌 菌餅。
[0091] 按照如下方法測定多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101對每種 病原菌的抑菌率：實驗重複三次，每次重複病原菌設兩個處理，即CSM1101組和對照組。將 20個無菌PDA平板均分為兩組，即CSM1101組和對照組，每組10個平板，進行以下接種處 理：在CSM1101組的無菌PDA平板中心接種直徑為6mm的病原菌菌餅，將多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM1101CGMCC No. 8527斜面活化菌種接種於距病原菌菌餅3cm 處。同時，在對照組的無菌PDA平板中心只接種直徑為6mm的病原菌菌餅。將經過上述接 種處理的CSM1101組平板和對照組平板在30°C培養5-7天，待對照組平板(僅接種病原菌） 長滿整個培養皿時，測量對照組的病原菌菌落直徑和CSM1101組的病原菌菌落直徑，計算 抑菌率。
[0092] 抑菌率（％)=(對照組的病原菌菌落直徑-CSM1101組的病原菌菌落直徑)/對照組 的病原菌菌落直徑X 100。
[0093] 結果如表1所不，表明多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM1101CGMCC No. 8527 對牡丹葡萄抱菌（Botrytis paeoniae) ACCC36053、牡丹枝抱黴（Cladosporium paeoniae) ACCC36063 和巧藥雜色尾抱黴菌（Cercospora varricolor Winter)均具有較強 的平板抑菌活性，其抑菌率分別達到了 57. 2%、65. 7%和88. 3%。
[0094] 表 1 多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101CGMCC No. 8527 對病原 菌的抑菌率
[0095]

【權利要求】
1. 使牡丹種子生根的方法，包括將休眠的牡丹種子進行浸種處理得到浸種後的牡丹 種子，用多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101處理所述浸種後的牡丹種子 1-3小時，得到菌劑處理的牡丹種子，將所述菌劑處理的牡丹種子進行生根培養得到牡丹生 根種子；所述多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 8527。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：用多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101處理所述浸種後的牡丹種子1-3小時為將所述浸種後的牡丹種子置於 所述多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101的菌懸液中浸泡1-3小時。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於：所述多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa) CSM1101的菌懸液中所述多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa) CSM1101 的含量為 108cfu/ml-109cfu/ml。
4. 根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特徵在於：所述多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa) CSM1101的菌懸液按照包括如下步驟的方法製備：將促進 牡丹生長並拮抗病原菌的菌劑懸浮於無菌水中得到所述多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa) CSM1101的菌懸液，所述多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa) CSM1101的菌懸液中所述多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa) CSM1101 的含量為 108cfu/ml-109cfu/ml ; 所述促進牡丹生長並拮抗病原菌的菌劑的製備方法包括： (1) 將玉米秸杆在180-200°c和1.0_2.0Mpa條件下進行水熱處理，得到經過預處理的 玉米結杆； (2) 將所述經過預處理的玉米秸杆粉碎後，用纖維素酶進行酶解，分別收集酶解液和酶 解殘渣； (3) 用所述酶解液、（順4)2504、]\%304、〇3〇) 3、玉米漿和水配製發酵培養基，每升所述發酵 培養基中所述酶解液的含量滿足每升所述發酵培養基的葡萄糖含量為20-50g ; (4) 向所述發酵培養基中接入促進牡丹生長並拮抗病原菌的細菌進行發酵，發酵結束 後收集發酵液，將所述發酵液和所述酶解殘渣混合，得到促進牡丹生長並拮抗病原菌的菌 齊U ;所述促進牡丹生長並拮抗病原菌的細菌為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa) CSM1101，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.8527。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於：所述水熱處理時間為10-20min。
6. 根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於：所述（2)為將所述經過預處理的玉 米秸杆粉碎後，按以乾重計每克秸杆加入10-15FPU的比例加入纖維素酶，在55-80°C、pH為 4. 8-5. 0的條件下在水中酶解24-48h，得到玉米秸杆酶解物，將所述玉米秸杆酶解物進行 離心，分別收集上清液和沉澱，所述上清液即為所述酶解液，所述沉澱即為所述酶解殘渣。
7. 根據權利要求4或5或6所述的方法，其特徵在於：每升所述發酵培養基中， (NH4)2S0 4的含量為10g，MgS04的含量為0· 4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g ;和/ 或，所述發酵液和所述酶解殘渣按照1:1的質量比進行混合。
8. 根據權利要求4或5或6或7所述的方法，其特徵在於：所述（4)在30°C培養18-30 小時進行發酵。
9. 使牡丹種子發芽的方法，包括將權利要求1-8中任一所述的使牡丹種子生根的方法 得到的牡丹生根種子在3-5°C貯藏7-21天進行栽植，在10-25°C培養，得到發芽的牡丹種 子。
10. 促進牡丹幼苗生長的方法，包括將權利要求1-8中任一所述的使牡丹種子生根的 方法得到的牡丹生根種子在3-5°C貯藏7-21天進行後進行栽植，在10-25°C培養，得到牡丹 幼苗。
【文檔編號】A01G7/00GK104054426SQ201410116389
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】韓繼剛, 王雲山, 胡永紅 申請人:上海辰山植物園