一種遠端關節彎曲致病基因及其檢測方法和應用的製作方法

2023-05-28 14:01:51 2

專利名稱：一種遠端關節彎曲致病基因及其檢測方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及TNNI2基因，具體地說是一種遠端關節彎曲致病基因及其檢測方法和應用。
背景技術：
TNNI2基因編碼蛋白的功能人類的肌絲主要由原肌凝蛋白(Tropomysin，TMP)、肌鈣蛋白(Troponin，TNN)和肌動蛋白(Actin)組成，TPM-TNN-Actin複合物與肌凝蛋白(Myosin)協調作用控制肌肉的收縮與舒張。(文獻1.Sung SS，Brassington AME，Grannatt K，Rutherford A，WhitbyFG.，Krakowiak PA，Jorde LB，Carey JC，Bamshad M.Mutations in genesencoding fast-twitch contractile proteins cause distal arthrogryposis syndromes.Am.J.Hum.Genet，2003，72681-690.)，人體的肌鈣蛋白(Troponin，TNN)呈球形，由TNNI、TNNT、TNNC三個亞單位組成，TNNC有一些帶雙負電荷的結合位點，因而對肌漿中出現的Ca2+有很大的親和力，TNNT的作用是把整個肌鈣蛋白分子結合於TPM，TNNI將TNNC結合Ca2+的信息傳遞給TPM，引起TPM的構象變化，解除它對肌纖蛋白和橫橋相互結合的阻礙作用，使肌肉收縮。TNN的複合物是骨骼肌中Ca2+的傳感器和調節器，TNNI是通過阻止肌動肌凝蛋白ATP酶激活來阻止肌肉收縮，因此至少胺基酸殘基的羧基部分決定了對Ca2+的敏感度。當組成TNNI2的胺基酸缺失、替換時改變了對Ca2+的敏感度，影響肌肉的收縮。(文獻2.Stefancsik R，Randall JD，Mao C，Sarkar S.Structure and sequence of the human fast skeletaltroponin T(TNNT3)geneinsight into the evolution of the gene and the origin ofthe developmentally regulated isoforms.Comp.Funct.Genomics，2003，4(6)609-625.)TNNI2基因跨越4KB，由8個外顯子組成，外顯子長度從4～222bp不等，mRNA長701bp，編碼182個胺基酸.
8個外顯子，422-425，1067-1096，1241-1247，1795-1836，1920-2048，2211-2300，2423-2599，2845-3066；7個內含子，426-1065，1070-1240，1248-1794，1837-1919，2049-2210，2301-2422，2560-2844。
遠端關節彎曲家系致病突變基因的TNNI2結構(下劃線部分為外顯子)GCTGACCTCGGGTGAGATGGGCTGAGGCGAGGTGTGGATACTCGCAGCTACCCCTCAGCTGACCCGAGCTGTGTGCCCGGCTGAGGCCACAGGCAAAGCCAGGCACACTGTCCTCAGGCTCCTTACGAGAACGACAGAGGCATCTCCAGCGCGTCACCGAGCCCTAAATAGAGTAGCCCAGCCACGGCACCCCCCACCAAGACTTCTTGGACTGGGCGGCAGCACGCGGCCAGGCCAGGCGGCCGGACAGGTGGGGAGGTCTCTGTGGCTCTCCACGCCCCCATTGGTCTGAGGAGGACTCTATGCCCTTTCTGAGCAGGGGCCCAGCCTGGGGGAGGCCATTTATACCCCTCCCCCTGGGCCCACCAGCCCAACTCGCCGCTGCCGGCCTGACCTCGCTCCCAGCCCTGCTGCCCAGATTCTAGGTGAGGCCCAGCCCGGCCCGCCGAG
GCCGGGGGACAGGGCGTGGCTCGAGCTGGTTTGAGGGAGGACTTCCTGGGGCGGGGGTCTGGGGGCCTGGGGGATGCCACCAGCAGCCCCCTTTGGGGCCTGCACGGGTCCGGGAGTGAGAAGGAGAGGGTTTGGGGAGGCAGGTGTAGCGAGAGGCAGGTATTAGACACTCCCTGACCACCAGGCTTCACCTCTGGGGACCCTGGAAGGAGAGTTTAGGGGTCAAGAAGCCCCAGAACCTGAGCCCCCAGGCCAAACTGAGGAGGGATTTCTTCCATGCACTTAGGCCCAAAGCCAAAGAGAGAGGGTTAAAAATAACAGCGTCACTCAGGCGGCCACCTGCGCTGGCCCATCCCACCCTCCCTCGGGGACAGCTGCAGCTCCTCAGGCTATGCCTGGGACATTTTGGGAACACTTTCTCCTCTTACTTCTCACCCTGGGGAATTCCAAGACATTGTCCTTGAAGGAGGTGAGAGTAGGGGGAGGAGGTGAGAGTAGGGGGTGGGCGGGAGGGGGCTGTCATCAGGAGCCCTGAACCCCTCACCACCTACCTGATGGGCACAGGCATCACGGTGGCAAGGGCCTGGCCAACACCTCTGTCTTCCTCTCCCCACAGGCTCCAAGCTCAGGACCTCAGGATGGGAGAGTAAGTGGTACCCCTGTACCCCCATACAGTGACCCTGCCCACCTCCTGCCCTGTCCACCCCATCACACACTCCGACCCCGCCAGCCATGGCCCTAACCTCTGTCTTCTCTCCCCGTCCTGCCTGCGTCCTCCCTCCCTGGACAGTGAGGAGGTAAGTAGTTGCTGGGGGCTCAAAACATGACGAGGAGGGGGCTCCCCCAACTCAGCATAGGTCATAGGTCACAGCCTCAAGGCCCTAAGGCCCAGAGAAGATGGCCTGGCCCTCCCCGCTGGCAAAAGTGCCCCACCCAACCACCAAGACGCTGCTGAAAGAGAGGAAGTGGCTGCCCCAAGCCTTCTGGGGCAGGGGAAGTGTGGCTGTGGCCTGGTCACAGGGGAATCACTTCTTCTTTCTGATTCCTGCACTTCCCGCCCCCACCTCACCGGCCGACCTGCCCCCAACTGGCCCTCCTCTCCCCCAGCCTCTGGCCTCCCAGCACCATGTGCCACCTGGCAAAGTGTCACACACCACACAGCACCATGTCCCAGTGCAAGGTCTGGGGCCAGGGAGGCCCAGCCTGCCCATCATGGCCTCAGGAGCCCCCAGGCTCTGCTGGTCCCGGAGCCGGAGCCCCTGACCTGGCCAGGGAGCGTGGAAGGGGGTGGGGGTGCTCCAGGCCTGGAGGCCCTGACTCGACCCCCTGTCCCCTGCCCTGCAGAAGCGGAACAGGGCCATCACGGCCCGCAGGCAGCACCTGAAGGTAGGTGTGGGCTCCCGGGGGGGTGGCCCAGGTGGGTCTGCAGGGGAGCTGGCTGCAGCCCCTCACCGCCTGCCCCACCGCAGAGCGTGATGCTGCAGATAGCGGCCACGGAGCTGGAGAAGGAGGAGAGCCGCCGTGAGGCAGAGAAGCAGAACTACCTGGCGGAGCACTGCCCGCCGCTGCATATCCCGGGCTCCATGTCTGAAGTGCAGGTACCAGCCCCTCCCCGGCCACCCCGCCTCCCCAGCAGCAGGCCTGCCTGCTAACTCAGTTTCCCCACTTGTCAAGAGGGCCAGTGGGGTGGTCAGGGCAGGGGCAGGTGACCGTGGCTGCCAAGTGTCAGGACGGCCGCCCGCCCCCACACCCACCCCTAGGAGCTCTGCAAACAGCTGCACGCCAAGATCGATGCGGCTGAAGAGGAGAAGTACGACATGGAGGTGAGGGTGCAGAAGACCAGCAAGGAGGTGAGTGGTGGCGGCGGGCCGGCGGCAGGTGGGTAGGCGGTGGCCCAGCGGGCAGGCGGGGCGGGCCGGGGAGGCCGAGACCACCGGGACCTCGGGCTCCCACCCGGCTCCCCTGCCCACAGCTGGAGGACATGAACCAGAAGCTATTTGATCTGCGGGGCAAGTTCAAGCGGCCCCCACTGCGGAGGGTGCGCATGTCGGCCGATGCCATGCTCAAGGCCCTGCTGGGCTCGAAGCACAAGGTGTGCATGGACCTGAGGGCCAACCTGAAGCAGGTCAAGAAGGAGGACACAGAGAAGGTGCGTGCCACGGGGGGAGCACCACCACACCTACCCTGCCGGGGAAGCACCTCCCACACCTGCCCCGCCTGGGACCACCTCCCACACCTGCCTGCCGGGGCCCTGTACCACTGCCCCTCCAGGGTGCCATGCAGGGGACACTCCACTGCCCAATGCAGAGGGTAAACTGAGGCTGAAGGTGGTGTGGACCAGGGTGCGTGCATAAGTGGGTGAGCCTGAGCTCTCTCCTGCCCTCTCCTCCACAGGAGCGGGACCTGCGAGACGTGGGTGACTGGAGGAAGAACATCGAGGAGAAGTCTGGCATGGAGGGCCGGAAGAAGATGTTTGAGTCCGAGTCCTAGGCCACTCGCTGCCCCTACGCCTGCCCCGGTGCCCGGCTCCCAGCAGAACATACTAGGGAGATGCACCCAGAGCCTGCCAGGGAGGGCTGGCCTCACCACCACCGTCAATAAAGGATTTGAATCCCCATGGCTGGTCTGGTCTGGCTCTCCCCAGCCTCTTGGGCCATGCTCTGGGCCCCCGCATCGGTGGCCTGCAGTGTGGTCAGTGGCCAGCGGGGAAAGCCTGGGAGGAGGCCACACGGGGCCTGGGATTTCAGGTTGGGAGGGAAGCTGCTTCCAGCAAGGAGGTGAGCCTGGGAAGGCCCCTACAGGGGAATCCACCCCAGGCTGCACGGGGCTGTTTGGTGAGGGCCCTGATAGTGCCCCAGGCGTTCCTGGGGCTCGGCCTGGGCACATCCAACATGCAGGGCTGGGGATGGAGGCTGTGGGACCGAGCCAGGTCTGGGTGGGAGTTCCTGAGATAAGTGGGTCTCACATTTGCACAGCCACGCAAAGGGCCTCCCGGGGCTCCAGAGAGATCCACACATGTGACACACGTGTGGCCCCCGCAGTGCTGGGGGCAGCCCCCTATGCCTCCCAAGCTGCCCCTCCTCAGGGAGCTCATCTGAGGCAGGAAGCCAAGGGCCACATTAGACCCCAGGCTGCTGTCCACGCGTGCCCACCCCCAGATCCTCCTGCTCATCCCCCTCCCACATCACTTTGGGACAGACCCCCAGCCCCGGGGCCTCCCTGCTTTTCCTATCTGCCCCCTGCCCTGAGCACTGAGGCTGGGCACGGGGAGCGTGGAGGGGCGAGCCTGCACGGTGGGCC
ATGACCAGGCCAAATTGGCAGTCTCCGGGCTGGGGACCAGCATGGTGCTGGGGGTTGGCCAGCCTGGTCTCTGGTCCTTACTGCCACCCTGAAAGGCAGGCTGTGTCACTCCTCACCATGCCAGGGGACCAAGAGACCTGTGCCCATCAGGCAGGGGCTAGGCCTGGCCCTGACCTGGCTCCAGTGTGGCTCCCAAGTCTCGTTTCCACTCAGCCCCAAGACCCAGCCCCATCTGGCCACCAAGGACAAGGCAGCTGACAGGTTCTGACAAGGCCGGTGACAGCAAGGCCACGTTATCAGCCCTGCTCTTTGAAGGCTGACAGAGCAGGCACGCCAAGGTCCCTGTGCTCAGATCTGCGCTGGGGAGGCTGCCAGCCTGCGCTGTGCCCTTGCCCCCGGGAGGTCCCATCGAT編碼的胺基酸序列(下劃線部分為第8外顯子編碼胺基酸)MGDEEKRNRAITARRQHLKSVMLQIAATELEKEESRREAEKQNYLAEHCPPLHIPGSMSEVQELCKQLHAKIDAAEEEKYDMEVRVQKTSKELEDMNQKLFDLRGKFKRPPLRRVRMSADAMLKALLGSKHKVCMDLRANLKQVKKEDTEKERDLRDVGDWRKNIEEKSGMEGRKKMFESES發明內容本發明的目的在於提供一種遠端關節彎曲致病基因及其檢測方法和應用。申請人首次在中國一個7代遺傳的2B型遠端關節彎曲大家系中發現了致病的基因突變，肌鈣蛋白亞單位I2(TNNI2)第8外顯子175位編碼賴氨酸密碼子AAG缺失，該突變為世界首次發現。同時針對該類疾病研製診斷試劑盒，該試劑盒方法簡便、快捷、價位低廉、高效，適於在科研及醫療單位推廣。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種遠端關節彎曲致病基因，具有序列表SEQ ID No1中胺基酸序列。
所述遠端關節彎曲致病基因的檢測方法，應用巢式PCR方法檢測1)提取受檢者血液模板DNA；2)引物設計及反應條件第一輪PCR正向引物TNNI2-1F5』-GGTGACCGTGGCTGCCAAGTGTC-3』反向引物TNNI2-1R5』-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3』；反應體系共20ul，受檢者模板DNA 1ng，10×buffer(緩衝液)2ul/管，Taqase(耐熱聚合酶)1U/管，2.5mMdNTP2ul/管，無菌水14ul/管；將上述液體混勻，瞬間離心，在PCR擴增儀上擴增，擴增條件為95℃，4min；94℃ 40sec，61℃ 1min，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min；在電泳儀上用PAGE凝膠電泳分離目的帶，目的帶為885bp或883bp，正常人為885bp片段長，異常為883bp片段長；第二輪PCR引物序列5』-TGGGTGACTGGAGGAAGAACAT-3』5』-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3』反應體系共20ul，受檢者第一輪PCR產物做模板DNA 10ng，10×buffer2ul/管，Taqase1U/管，2.5mMdNTP2ul/管，無菌水14ul/管；將上述液體混勻，瞬間離心，在PCR擴增儀上擴增，擴增條件為95℃，4min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min；在電泳儀上用PAGE凝膠電泳分離目的帶，目的帶片段正常人為一條143bp帶，患者為兩條帶140/143bp。
所述遠端關節彎曲致病基因用於製備診斷遠端關節彎曲2B型、DAS、手足彎曲畸形、馬蹄內翻足或馬蹄外翻足疾病的試劑或試劑盒。
1.申請人首次在中國一個7代遺傳的2B型遠端關節彎曲大家系中發現了致病的基因突變，肌鈣蛋白亞單位I2(TNNI2)第8外顯子175位編碼賴氨酸密碼子AAG缺失，該突變為世界首次發現。
2.申請人針對該類疾病研製出診斷試劑盒，該試劑盒方法簡便、快捷、價位低廉、高效，應用廣泛，適於在科研及醫療單位推廣。可方便、準確地診斷手足畸形疾病。
3.手足畸形在人群中發病率高，至今許多病因沒有明確的診斷。申請人在中國首次發現的遠端關節彎曲疾病，勢將掀開手足畸形疾病的秘密，為該病的研究提供方法學的幫助。
具體實施例方式
實施例1正常的第8外顯子序列GAGCGGGACCTGCGAGACGTGGGTGACTGGAGGAAGAACATCGAGGAGAAGTCTGGCATGGAGGGCCGGAAGAAGATGTTTGAGTCCGAGTCCTAG，其中帶下劃線部分為缺失位點；一種遠端關節彎曲致病基因，具有序列表SEQ ID No1中胺基酸序列。
本發明突變了的第8外顯子SEQ ID No1序列為GAGCGGGACCTGCGAGACGTGGGTGACTGGAGGAAGAACATCGAGGAGAAGTCTGGCATGGAGGGCCGGAAGATGTTTGAGTCCGAGTCCTAG(1)SEQ ID No1的信息(參見序列表)(A)序列特徵*長度93鹼基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型DNA(C)假設否(d)反義否(e)最初來源肌鈣蛋白亞單位I2(TNNI2)第8外顯子(f)與核苷酸序列相關的特徵關鍵詞為「mutation」(2)基因的製備正向引物5』-CTACAAGGAAAGCTGGGTC-3』，反向引物5』-AAGGGCTGGAAGAGGTGG-3』反應體系共20ul，受檢者模板DNA 1ng，10×buffer 2ul/管，Taqase1U/管，2.5mMdNTP2ul/管，無菌水14ul/管；擴增條件95℃，4min；94℃ 40sec，61℃ 1min，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min；
實施例2本發明突變了的第8外顯子檢測方法應用巢式PCR方法檢測，(1)DNA提取採5毫升靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝，用常規的酚氯仿提取DNA，分光光度計測DNA含量，10鈉克/微升；(2)引物設計及反應條件第一輪PCR引物序列正向引物TNNI2-1F5』-GGTGACCGTGGCTGCCAAGTGTC-3』反向引物TNNI2-1R5』-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3』反應體系共20ul①受檢者模板DNA 10ng(1ul)②10×buffer 2ul/管③Taqase1U/管(1ul)④2.5mMdNTP2ul/管⑤無菌水14ul/管將上述液體混勻，瞬間離心，在PCR擴增儀上擴增，擴增條件為95℃，4min；94℃ 40sec，61℃ 1min，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min.
在電泳儀上用PAGE凝膠電泳分離目的帶，目的帶為885bp或883bp，正常人為885bp片段長，異常為883bp片段長。
第二輪PCR引物序列5』-TGGGTGACTGGAGGAAGAACAT-3』5』-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3』反應體系共20ul①受檢者第一輪PCR產物做模板DNA 1ul②10×buffer 2ul/管③Taqase1U/管④2.5mMdNTP2ul/管⑤無菌水14ul/管將上述液體混勻，瞬間離心，在PCR擴增儀上擴增，擴增條件為95℃，4min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min.
在電泳儀上用PAGE凝膠電泳分離目的帶，目的帶片段正常人為一條143bp帶，患者為兩條帶140/143bp。
實施例3試劑盒組成
(1)引物管

第一輪擴增試劑組成管1(18ul體系)2.5mMdNTP、10×buffer、10mM第一輪引物；管2液體石蠟與Taqase混合液4ul；(Taqase1U/管)第一輪擴增方法將管1與管2混合，加1ul受檢者模板DNA，混勻，瞬間離心，在PCR擴增儀上擴增。擴增條件為95℃，4min；94℃ 40sec，61℃ 1min，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min.
擴增的產物可以直接用於DNA測序，也可以用於第二輪PCR模板。測序可以檢測該片段的任何突變。
第二輪擴增試劑組成管3(18ul體系)2.5mMdNTP、10×buffer、10mM第二輪引物；管4液體石蠟與Taqase混合液4ul；(Taqase1U/管)第二輪擴增方法將管3與管4混合，加1ul第一輪PCR擴增產物，混勻，瞬間離心，在PCR擴增儀上擴增。擴增條件為95℃，4min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min。
在垂直板電泳儀進行變性凝膠電泳。8％凝膠，7mol尿素，40％去離子甲醯胺，電泳40瓦4～5小時。正常人為143bp一條帶，患者為為140/143bp兩條帶。
試劑盒應用的範圍對診斷為遠端關節彎曲2B型的患者；對診斷為DAS的患者；對手足彎曲畸形的患者；對馬蹄內翻足或馬蹄外翻足的患者。
關節彎曲SEQUENCE LISTING110遼寧省計劃生育科學研究院120一種遠端關節彎曲致病基因及其檢測方法和應用130
1609170PatentIn version 3.1210121193212DNA213TNNI2第8外顯子220
221mutation222(1)..(93)223
4001gagcgggacc tgcgagacgt gggtgactgg aggaagaaca tcgaggagaa gtctggcatg60gagggccgga agatgtttga gtccgagtcc tag 9321022114163212DNA213TNNI2220
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關節彎曲223
220
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220
221CDS222(2845)..(3066)223
4002gctgacctcg ggtgagatgg gctgaggcga ggtgtggata ctcgcagcta cccctcagct60gacccgagct gtgtgcccgg ctgaggccac aggcaaagcc aggcacactg tcctcaggct120ccttacgaga acgacagagg catctccagc gcgtcaccga gccctaaata gagtagccca180gccacggcac cccccaccaa gacttcttgg actgggcggc agcacgcggc caggccaggc240ggccggacag gtggggaggt ctctgtggct ctccacgccc ccattggtct gaggaggact300ctatgccctt tctgagcagg ggcccagcct gggggaggcc atttataccc ctccccctgg360gcccaccagc ccaactcgcc gctgccggcc tgacctcgct cccagccctg ctgcccagat420tctaggtgag gcccagcccg gcccgccgag gccgggggac agggcgtggc tcgagctggt480ttgagggagg acttcctggg gcgggggtct gggggcctgg gggatgccac cagcagcccc540ctttggggcc tgcacgggtc cgggagtgag aaggagaggc tttggggagg cagctgtagc600gagaggcagg tattagacac tccctgacca ccaggcttca cctctgggga ccctggaagg660agagtttagg ggtcaagaag ccccagaacc tgagccccca ggccaaactg aggagggatt720tcttccatgc acttaggccc aaagccaaag agagagggtt aaaaataaca gcgtcactca780ggcggccacc tgcgctggcc catcccaccc tccctcgggg acagctgcag ctcctcaggc840tatgcctggg acattttggg aacactttct cctcttactt ctcaccctgg ggaattccaa900
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關節彎曲gac atg aac cag aag cta ttt gat ctg cgg ggc aag ttc aag cgg ccc 2476Asp Met Asn G1n Lys Leu Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro100 105 110 115cca ctg cgg agg gtg cgc atg tcg gcc gat gcc atg ctc aag gcc ctg 2524Pro Leu Arg Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Lys Ala Leu120 125 130ctg ggc tcg aag cac aag gtg tgc atg gac ctg agg gcc aac ctg aag 2572Leu Gly Ser Lys His Lys Val Cys Met Asp Leu Arg Ala Asn Leu Lys135 140 145cag gtc aag aag gag gac aca gag aag gtgcgtgcca cggggggagc2619Gln Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys150 155accaccacac ctaccctgcc ggggaagcac ctcccacacc tgccccgcct gggaccacct2679cccacacctg cctgccgggg ccctgtacca ctgcccctcc agggtgccat gcaggggaca2739ctccactgcc caatgcagag ggtaaactga ggctgaaggt ggtgtggacc agggtgcgtg2799cataagtggg tgagcctgag ctctctcctg ccctctcctc cacag gag cgg gac ctg2856Glu Arg Asp Leu160cga gac gtg ggt gac tgg agg aag aac atc gag gag aag tct ggc atg 2904Arg Asp Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu Lys Ser Gly Met165 170 175gag ggc cgg aag aag atg ttt gag tcc gag tcc tag gcc act cgc tgc 2952Glu Gly Arg Lys Lys Met Phe Glu Ser Glu Ser Ala Thr Arg Cys180 185 190ccc tac gcc tgc ccc ggt gcc cgg ctc cca gca gaa cat act agg gag 3000Pro Tyr Ala Cys Pro Gly Ala Arg Leu Pro Ala Glu His Thr Arg Glu195 200 205atg cac cca gag cct gcc agg gag ggc tgg cct cac cac cac cgt caa 3048Met His Pro Glu Pro Ala Arg Glu Gly Trp Pro His His His Arg Gln210 215 220taa agg att tga atc ccc atggctggtc tggtctggct ctccccagcc 3096Arg Ile Ile Pro225tcttgggcca tgctctgggc ccccgcatcg gtggcctgca gtgtggtcag tggccagcgg3156ggaaagcctg ggaggaggcc acacggggcc tgggatttca ggttgggagg gaagctgctt3216ccagcaagga ggtgagcctg ggaaggcccc tacaggggaa tccaccccag gctgcacggg3276gctgtttggt gagggccctg atagtgcccc aggcgttcct ggggctcggc ctgggcacat3336ccaacatgca gggctgggga tggaggctgt gggaccgagc caggtctggg tgggagttcc3396tgagataagt gggtctcaca tttgcacagc cacgcaaagg gcctcccggg gctccagaga3456gatccacaca tgtgacacac gtgtggcccc cgcagtgctg ggggcagccc cctatgcctc3516ccaagctgcc cctcctcagg gagctcatct gaggcaggaa gccaagggcc acattagacc3576ccaggctgct gtccacgcgt gcccaccccc agatcctcct gctcatcccc ctcccacatc3636actttgggac agacccccag ccccggggcc tccctgcttt tcctatctgc cccctgccct3696gagcactgag gctgggcacg gggagcgtgg aggggcgagc ctgcacggtg ggccatgacc3756aggccaaatt ggcagtctcc gggctgggga ccagcatggt gctgggggtt ggccagcctg3816gtctctggtc cttactgcca ccctgaaagg caggctgtgt cactcctcac catgccaggg3876gaccaagaga cctgtgccca tcaggcaggg gctaggcctg gccctgacct ggctccagtg3936
關節彎曲tggctcccaa gtctcgtttc cactcagccc caagacccag ccccatctgg ccaccaagga3996caaggcagct gacaggttct gacaaggccg gtgacagcaa ggccacgtta tcagccctgc4056tctttgaagg ctgacagagc aggcacgcca aggtccctgt gctcagatct gcgctgggga4116ggctgccagc ctgcgctgtg cccttgcccc cgggaggtcc catcgat 4163210321110212PRT213TNNI24003Ala Pro Ser Ser Gly Pro Gln Asp Gly Arg1 5 10210421114212PRT213TNNI24004Lys Arg Asn Arg Ala Ile Thr Ala Arg Arg Gln His Leu Lys1 5 10210521143212PRT213TNNI24005Ser Val Met Leu Gln Ile Ala Ala Thr Glu Leu Glu Lys Glu Glu Ser1 5 10 15Arg Arg Glu Ala Glu Lys Gln Asn Tyr Le uAla Glu His Cys Pro Pro20 25 30Leu His Ile Pro Gly Ser Met Ser Glu Val Gln35 40210621130212PRT213TNNI2
關節彎曲4006Glu Leu Cys Lys Gln Leu His Ala Lys Ile Asp Ala Ala Glu Glu Glu1 5 10 15Lys Tyr Asp Met Glu Val Arg Val Gln Lys Thr Ser Lys Glu20 25 30210721159212PRT213TNNI24007Leu Glu Asp Met Asn Gln Lys Leu Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys1 5 10 15Arg Pro Pro Leu Arg Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Lys20 25 30Ala Leu Leu Gly Ser Lys His Lys Val Cys Met Asp Leu Arg Ala Asn35 40 45Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys50 55210821131212PRT213TNNI24008Glu Arg Asp Leu Arg AspVal Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu1 5 10 15Lys Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Met Phe Glu Ser Glu Ser20 25 30210921136212PRT213TNNI24009Ala Thr Arg Cys Pro Tyr Ala Cys Pro Gly Ala Arg Leu Pro Ala Glu1 5 10 15
關節彎曲His Thr Arg Glu Met His Pro Glu Pro Ala Arg Glu Gly Trp Pro His20 25 30His His Arg Gln3權利要求
1.一種遠端關節彎曲致病基因，其特徵在於具有序列表SEQ ID No1中胺基酸序列。
2.一種權利要求1所述遠端關節彎曲致病基因的檢測方法，其特徵在於應用巢式PCR方法檢測1)提取受檢者血液模板DNA；2)引物設計及反應條件第一輪PCR正向引物TNNI2-1F5』-GGTGACCGTGGCTGCCAAGTGTC-3』反向引物TNNI2-1R5』-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3』；反應體系共20ul，受檢者模板DNA 10ng ul，10×buffer 2ul/管，Taqase1U/管，2.5mMdNTP2ul/管，無菌水14ul/管；將上述液體混勻，瞬間離心，在PCR擴增儀上擴增，擴增條件為95℃，4min；94℃ 40sec，61℃ 1min，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min；在電泳儀上用PAGE凝膠電泳分離目的帶，目的帶為885bp或883bp，正常人為885bp片段長，異常為883bp片段長；第二輪PCR引物序列5』-TGGGTGACTGGAGGAAGAACAT-3』5』-AGCTCAGGCTCACCCACTTATGCA-3』反應體系共20ul，受檢者第一輪PCR產物做模板DNA 10ng，10×buffer2ul/管，Taqase1U/管，2.5mMdNTP2ul/管，無菌水14ul/管；將上述液體混勻，瞬間離心，在PCR擴增儀上擴增，擴增條件為95℃，4min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 45sec，35cycles，72℃ 8min；在電泳儀上用PAGE凝膠電泳分離目的帶，目的帶片段正常人為一條143bp帶，患者為兩條帶140/143bp。
3.一種權利要求1所述遠端關節彎曲致病基因的應用，其特徵在於所述遠端關節彎曲致病基因用於製備診斷遠端關節彎曲2B型、DAS、手足彎曲畸形、馬蹄內翻足或馬蹄外翻足疾病的試劑或試劑盒。
4.按照權利要求3所述遠端關節彎曲致病基因的應用，其特徵在於所述試劑或試劑盒採用的第一輪引物正向5』-CTACAAGGAAAGCTGGGTC-3』，反向5』-AAGGGCTGGAAGAGGTGG-3』；第二輪引物正向5』-TGGGTGACTGGAGGAAGAACAT-3』，反向5』-GTGCATCTCCCTAGTATGTTCTGC-3』。
全文摘要
本發明涉及TNNI2基因，具體地說是一種遠端關節彎曲致病基因及其檢測方法和應用，其具有序列表SEQ ID No1中胺基酸序列。申請人首次在中國一個7代遺傳的2B型遠端關節彎曲大家系中發現了致病的基因突變，肌鈣蛋白亞單位I2(TNNI2)第8外顯子175位編碼賴氨酸密碼子AAG缺失，該突變為世界首次發現。同時針對該類疾病研製診斷試劑盒，該試劑盒方法簡便、快捷、價位低廉、高效，適於在科研及醫療單位推廣。
文檔編號A61P19/02GK101054412SQ20061004629
公開日2007年10月17日 申請日期2006年4月12日 優先權日2006年4月12日
發明者姜淼, 韓維田, 邊超英, 李學付, 王格, 李蘊青, 易冬旭, 李建新 申請人:遼寧省計劃生育科學研究院