一種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及其應用的製作方法

2023-05-28 06:43:36 2

專利名稱：一種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及其應用的製作方法
技術領域：
本發明是關於一種用於男性不育症檢測的抗體或抗體片段及其應用。
背景技術：
在全世界範圍內，大約15%的夫婦受到不育症的影響，其中男性不育症已經成為一個主要的生殖健康問題。隨著社會工業化程度的提高和生活節奏的加快，加上環境汙染和不良生活習慣等因素，男性精液質量日趨下降，男性不育人數呈逐年上升趨勢，男性生殖健康的問題越來越受到全社會的關注。精子發生是一個複雜的過程，它分為精原細胞有絲分裂、精母細胞減數分裂和精子形成三個階段。體內這一獨特的生命現象，需要一系列睪丸特異性表達基因的參與，各自發揮著特定的功能。目前已知一些基因與精子發生密切相關，例如CREM， Ddrl， TESP-1等皆被證明為睪丸特異性表達基因並在精子發生過程中起重要作用，這些基因的缺失或突變將導致嚴重少精子症或無精子症，從而造成不育。因此，篩選和鑑定生精相關基因有助於進一步了解人類精子形成的分子機制和部分男性不育的原因。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種能夠用於男性不育症檢測的抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及其應用。 為解決上述技術問題，本發明提供一種分離的雜交瘤細胞株，其保藏號為CCTCCNO :C200952。 —種由雜交瘤細胞株hTSC29分泌的抗體或抗體片段。 進一步的，抗體或抗體片段為特異性結合抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段。該雜交瘤細胞株hTSC29也可以分泌出能夠特異性結合其它蛋白的抗體或抗體片段。
進一步的，抗體為特異性結合hTSC29蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體。[OOOS] 進一步的，單克隆抗體為IgG，亞類為IgG2b ( k )。 —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段的應用，所述抗體或抗體片段與耦聯物耦聯，所述耦聯物為酶、螢光標記物、化學發光標記物或藥物。 —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段複合物，包括抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體及與其耦聯的耦聯物，所述耦聯物選自標記物、藥物。
所述標記物為酶、螢光標記物或化學發光標記物。 —種藥物組合物，包括藥學上有效量的抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及藥學上可接受的載體。 —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段在男性不育檢測上的應用。
本發明的有益效果是，申請人篩選出一個人睪丸特異性基因hTSC29，根據同源性、抗原性、親水性等參數預測的結果進行綜合考慮，最後選取hTSC29的224-241位胺基酸序列進行合成。經小鼠免疫、細胞融合、篩選及克隆化，獲得了能穩定分泌抗hTSC29 mAb的雜交瘤細胞株，Western blot鑑定表明，該mAb在人正常睪丸蛋白中相對分子質量(M》約為
360kDa處檢測到特異條帶；免疫組織化學顯示hTSC29蛋白主要在正常人睪丸的精母細胞及 圓形精子細胞中表達，此抗體效價高、特異性強，為進一步研究與hTSC29基因表達相關的 男性不育症提供了特異的檢測工具。


圖1是Western blot檢測hTSC29 mAb的特異性圖，其中，字符1代表人子宮內膜 細胞，2代表白血病細胞，3代表人睪丸組織，GAPDH作為內參； 圖2是hTSC29的免疫組化定位圖，箭頭所指是hTSC29蛋白質，免疫組化結果顯 示，hTSC29 mAb所識別的分子主要定位在正常人睪丸組織的精母細胞及精子細胞，A為陰性 對照； 圖3是免疫螢光染色技術檢測hTSC29蛋白在睪丸組織中的表達圖，其中，A為陰 性對照，B為hTSC29蛋白在人睪丸組織中的定位(箭頭所指)。
具體實施例方式
本申請的申請人採用Affyymetrix公司的成人睪丸基因組表達譜晶片，成功篩選 出一個人睪丸特異性新基因，並將其命名為hTSC29(GenBank登陸號BC032957)，為了更深 入的研究該基因的表達特徵及其在精子發生過程中的生物功能，申請人製備了鼠抗hTSC29 合成肽的單克隆抗體；申請人對hTSC29全長蛋白序列與其他睪丸特異性表達的蛋白進行 同源性分析，選取同源性低的片段，再用DNAstar軟體對蛋白質的抗原表位及親水性進行 了分析，根據同源性、抗原性、親水性等參數預測的結果進行綜合考慮，最後選取hTSC29的 224-241位胺基酸序列進行合成。經小鼠免疫、細胞融合、篩選及克隆化，獲得了能穩定分泌 抗hTSC29 mAb的雜交瘤細胞株hTSC29，該細胞株的保藏號為CCTCC NO :C200952，分泌的抗 體為IgG2b(K)亞型，效價達到1 : 10、Western blot鑑定表明，該mAb在人正常睪丸蛋 白中相對分子質量(Mr)約為60kDa處檢測到特異條帶；免疫組織化學顯示hTSC29蛋白主 要在正常人睪丸的精母細胞及圓形精子細胞中表達，此抗體效價高、特異性強，為進一步研 究與hTSC29基因表達相關的男性不育症提供了特異的檢測工具。 本發明採用生物信息學方法對hTSC29的蛋白質序列進行分析和預測，依據同
源性、抗原性、親水性等理化性質設計出一段由19個胺基酸組成的多肽(多肽序列為
SPENTCPREATKKSRHGLD)，將其與載體蛋白鑰孔戚血藍素(keyhole limpet hemocyanin，
KLH)偶聯後腹腔注射免疫BALB/c小鼠，應用淋巴細胞雜交瘤技術製備抗hTSC29單克隆抗
體，運用這種新抗體，通過ELISA法、Western blot、免疫組織化學和免疫螢光染色等方法檢
測人體hTSC29蛋白質的存在及其表達特徵。 雜交瘤細胞株hTSC29的保藏信息如下 培養物名稱雜交瘤細胞株hTSC29 保藏日期2009年8月27日 保藏單位中國典型培養物保藏中心(CCTCC) 保藏編號CCTCC NO :C200952 抗hTSC29蛋白的抗體或抗體片段的製備方法如下
1.材料
小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/0購自ATCC ;高糖DMEM和胎牛血清購自Gibco ;完全福氏 佐齊U、不完全福氏佐齊U、HAT、HT和PEG (1450)購自美國Sigma公司；HRP-羊抗小鼠IgG購自 KPL公司；FITC標記的羊抗鼠二抗購自Sigma公司；3， 3， 5， 5-四甲基聯苯胺(TMB)購自科 華生物公司；牛血清白蛋白(BSA)購自Merck公司；小鼠亞類(型)檢測試劑盒購自HBT公 司；ECL發光試劑盒購自PIERCE公司；硝酸纖維素膜(PVDF)購自Millipore公司；其他試 劑均為國產分析純。電泳槽、電泳儀(Mini-protean Teta cell型)、酶標儀(680型)和熒 光影像掃描儀均為BIO-RAD產品；半乾轉膜裝置為Wealtec corp產品；BALB/c小鼠(7 8周齡、雌性、清潔級)由中山大學實驗動物中心提供；正常人睪丸組織由北京大學深圳醫 院病理科提供；多肽合成以及其與KLH、BSA的偶聯由西安華辰生物科技有限公司完成。
2.hTSC29抗原的獲取及動物免疫 利用DNAstar軟體包對不同種屬的hTSC29胺基酸序列進行多序列比對以及 hTSC29的親疏水性、抗原性及表面暴露性預測，選取hTSC29蛋白中的一段胺基酸序列委託 西安華辰生物科技有限公司合成，經質譜分析表明合成的多肽片段與理論的Mr —致，反相 HPLC檢測純度在95%以上；多肽與KLH和BSA的交聯採用戊二醛連接法，將5mg合成多肽 分別加入7mg KLH和BSA中，邊振蕩邊緩慢加入新鮮配製的3g/L的戊二醛溶液(lmL)，室溫 作用2h。以pH8.5硼酸緩衝液透析過夜。交聯形成多肽-KLH、多肽-BSA偶聯物。取50 y g 多肽-KLH偶聯物加200 y L滅菌PBS與等體積的完全福氏佐劑混合進行充分乳化，腹腔注 射免疫BALB/c小鼠。首次免疫後每隔2周加強免疫1次，劑量同前，用不完全福氏佐劑充 分乳化後，注射小鼠腹腔。第3次加強免疫後斷尾取血，分離血清，測定血清效價。選擇血 清效價高的小鼠，用不加佐劑的多肽-KLH再加強免疫1次，3天後取小鼠脾細胞融合。
3.雜交瘤細胞株的建立 (1)細胞融合無菌條件下，取對數生長的Sp2/0細胞，1000r/min離心8min，棄上 清，用DMEM不完全培養基混懸細胞後計數，取所需的細胞數。製備免疫小鼠脾細胞懸液，將 Sp2/0細胞與脾細胞按1 : 5的比例混合，37t:水浴500mL/L PEG作用下進行融合，融合後 1200r/min離心15min，棄上清，用HAT選擇培養液輕輕混懸，接種在預先培養了飼養細胞的 96孔細胞培養板中，置37t:、50mL/L C02培養箱中培養。第10天換HT選擇培養液，第14 天換含100mL/L胎牛血清的DMEM完全培養液。 (2)篩選及克隆化2 3周後當雜交瘤細胞長至孔底面積1/10以上時， 以5mg/L的多肽-BSA偶聯物包被聚苯乙烯微孔板，加入雜交瘤上清，37t:孵育lh後， PBST (PBS+0. 5mL/L Tween-20)洗滌，加入HRP-羊抗小鼠IgG抗體，以TMB顯色後，用酶標 儀測定A45。/63。值。以正常BALB/c小鼠血清作為陰性對照，已免疫BALB/c小鼠血清作為陽 性對照，以P/N > 2為陽性，採用有限稀釋法對選取陽性孔細胞連續克隆2 3次，直到克 隆生長孔的mAb陽性率達100%，建立單克隆細胞株，該單克隆細胞株即為保藏號為CCTCC NO :C200952的細胞株。將陽性雜交瘤細胞株擴大培養後，進行細胞凍存和腹水製備。單克 隆細胞株經凍存、復甦後仍保持穩定分泌mAb的能力。
4.mAb腹水的製備及其效價測定 每隻BALB/c小鼠腹腔內注射0. 5mL滅菌液體石蠟，7天後將建株的雜交瘤細胞以 1 X 106個細胞接種於小鼠腹腔中，按常規法收集、製備mAb腹水。採用上述ELISA法檢測 mAb腹水效價。
5. mAb的IgG亞類鑑定 按照HBT公司的小鼠mAb亞類檢測試劑盒說明書進行。在分別放有不同類及 亞類檢測試紙條的玻璃管中，相繼加入緩衝液、待檢mAb及其相應類及亞類的檢測抗體， 輕輕振蕩試管，直至檢測試紙條上出現斑點。結果顯示雜交瘤細胞株分泌的mAb，亞類為 IgG2b(K )，效價達到1 : 104。
6. mAb特異性檢測 (1) Western blot分析取正常人睪丸組織，剪成細小碎片，細胞漂洗液漂洗1遍， 加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑1 : 100，混勻組織，勻漿樣品，冰上孵育30min後，12000g 離心20min，獲得正常人睪丸組織裂解液。待子宮內膜細胞和白血病K-562細胞的密度達 到約2X107L時，用上述方法獲得細胞裂解液。上述3種蛋白按比例加入5XSDS Loading buffer, IO(TC加熱15min，進行常規SDS-PAGE電泳後，半乾法轉至PVDF膜上，用lOg/L BSA 4。C封閉過夜。次日加入l : 1000稀釋的mAb，室溫下孵育4h，TBST(TBS+0. 5mL/L Tween-20) 緩衝液洗膜3次，10min/次，加入1 : 2000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，室溫下孵育 lh， TBST徹底洗滌後，ECL試劑處理後，置螢光影像掃描儀上曝光，計算機自動將每隔20s鍾 檢測到的信號保存。 (2)免疫組織化學分析人睪丸組織取材後多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片。切 片經過二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。滴加30mL/L H202-甲醇，室溫避光孵育20min，以消除 內源性過氧化氫酶的作用。1Ommol/L的擰檬酸鹽緩衝液微波加熱(92°C 98°C， 15min)進 行抗原修復，正常山羊血清室溫下封閉30min，然後依次滴加雜交瘤細胞的培養上清，4t:孵 育過夜。PBS充分洗滌後加入羊抗小鼠生物素化二抗，室溫孵育lh， PBS洗滌3次，再加入 HRP-鏈酶親和素，室溫孵育lh。 PBS洗片後進行DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，返藍 後封片，顯微鏡下觀察、拍照。陰性對照採用正常小鼠血清代替雜交瘤上清。
(3)免疫螢光分析正常人睪丸組織石蠟包埋切片用二甲苯常規脫蠟、入水、抗原 修復。PBS洗滌5次，滴加30mL/L H202-甲醇，室溫孵育20min，以消除內源性過氧化氫酶 的作用。PBS洗滌後滴加正常山羊血清室溫下封閉10min，然後依次滴加雜交瘤細胞的培養 上清，溼盒內孵育2h。 PBS洗滌2次，加入FITC標記的羊抗鼠二抗，避光孵育30 40min。 PBS洗滌3次，甘油封片，螢光顯微鏡觀察，拍照。陰性對照採用正常小鼠血清代替雜交瘤上 清。 7.抗體應用效果實驗 (1).抗hTSC29 mAb雜交瘤細胞株的建立 經小鼠免疫、細胞融合、篩選及克隆化，獲得抗hTSC29的陽性克隆，進行3次克隆 化後得到可以穩定分泌特異性抗hTSC29 mAb的雜交瘤細胞株，其亞克隆分別命名為4F9、 2F7和4F2。經凍存、復甦後仍保持穩定分泌mAb的能力。
(2)mAb的IgG亞類鑑定 用HBT公司提供的小鼠IgG亞類檢測試劑盒鑑定雜交瘤分泌的mAb，亞類均為 IgG2b(K )，效價達到1 : 104。
(3)mAb的特性鑑定
(3. l)Western blot分析 Western blot結果顯示，本發明雜交瘤細胞株hTSC29分泌的mAb均可特異性地識
6別人睪丸組織中Mr約為60 000的蛋白，而與子宮內膜細胞蛋白和白血病K-562細胞蛋白 之間沒有結合。GAPDH作為內參，在三種蛋白的Mr為36 000處都可檢測到特異條帶，如圖 l所示。 (3. 2)mAb的免疫組化鑑定 免疫組化結果顯示，hTSC29 mAb所識別的分子主要定位在正常人睪丸組織的精母 細胞及精子細胞，說明了 hTSC29蛋白在睪丸中有表達，如圖2所示。
(3. 3) mAb的免疫螢光鑑定 在正常人睪丸組織中精母細胞及精子細胞中有明顯的綠色螢光，呈環狀著色，表 明hTSC29 mAb可與睪丸中的hTSC29蛋白結合，如圖3所示。 本發明抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段能特異性與包含有人睪丸hTSC29多 肽的蛋白質結合；抗體或抗體片段可以與一定的標記物如酶、螢光標記物、化學發光標記物 結合，該抗體或抗體片段可以應用於Westernblot、ELISA、免疫組織化學或免疫螢光染色檢 測。對本領域的技術人員，很容易得知該抗體或抗體片段還可以與藥物耦聯，用於耙向治療。 以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬於本發明的 保護範圍。
權利要求
一種雜交瘤細胞株hTSC29，其保藏號為CCTCC NOC200952。
2. —種由權利要求1所述的雜交瘤細胞株hTSC29分泌的抗體或抗體片段。
3. 根據權利要求2所述的抗體或抗體片段，其特徵在於所述抗體或抗體片段為特異性結合抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段。
4. 根據權利要求3所述的抗體或抗體片段，其特徵在於所述抗體為特異性結合抗睪丸hTSC29蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體。
5. 根據權利要求4所述的抗體或抗體片段，其特徵在於所述單克隆抗體為IgG，亞類為IgG2b(K)。
6. —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段的應用，其特徵在於所述抗體或抗體片段與耦聯物耦聯，所述耦聯物為酶、螢光標記物、化學發光標記物或藥物。
7. —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段複合物，其特徵在於包括抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體及與其耦聯的耦聯物，所述耦聯物選自標記物、藥物。
8. 根據權利要求7所述的抗體或抗體片段複合物，其特徵在於所述標記物為酶、螢光標記物或化學發光標記物。
9. 一種藥物組合物，其特徵在於包括藥學上有效量的權利要求3-5中任意一項所述的抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及藥學上可接受的載體。
10. —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段在男性不育檢測上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及其應用，該抗體或抗體片段由保藏號為CCTCC NOC200952的雜交瘤細胞株hTSC29分泌。通過該抗體或抗體片段能夠了解人類精子形成的分子機制和能夠對部分男性不育症提供特異性的檢測。
文檔編號G01N33/577GK101775371SQ200910188640
公開日2010年7月14日 申請日期2009年12月2日 優先權日2009年12月2日
發明者唐愛發, 桂耀庭, 蔡志明, 顏秋霞 申請人:唐愛發;顏秋霞;桂耀庭;蔡志明