含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的細胞生長抑制劑的製作方法

2023-05-28 06:08:51 2

專利名稱：含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的細胞生長抑制劑的製作方法
含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的細胞生長抑制劑本申請為國際申請PCT/JP2002/006237於2003年12月22日進入 中國國家階段、申請號為02812570.3、發明名稱為"含有抗磷脂醯肌 醇蛋白聚糖3抗體的細胞生長抑制劑"的分案申請。發明領域本發明涉及含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分的細 胞生長抑制劑。發明背景磷脂醯肌醇蛋白聚糖家族一直被報導為細胞表面上存在的硫酸乙 醯肝素蛋白聚糖的新家族。迄今，5種磷脂醯肌醇蛋白聚糖(磷脂醯肌 醇蛋白聚糖l、磷脂醯肌醇蛋白聚糖2、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3、磷脂 醯肌醇蛋白聚糖4和磷脂醯肌醇蛋白聚糖5)已被報導成磷脂醯肌醇蛋 白聚糖家族的成員。這些家族成員具有大小一致的核心蛋白(約 60kDa)，享有特異和完全保守的半胱氨酸序列，並且通過糖基磷脂醯 肌醇(GPI)錨結合到細胞膜上。通過對在中樞神經系統發育中具有異常細胞分裂模式的果蠅 (Drosophila melanogaster)變體的基因進行篩選已鑑定了 Dally(分裂異 常延遲的)基因。已知Dally的cDNA代表一可讀框(ORF)，所述ORF 編碼其序列顯示與含有所有磷脂醯肌醇蛋白聚糖特徵的脊椎動物的跨 膜蛋白聚糖(GRIP)同源(24-26。/。的同源性)的產物。並且還已提示dally 基因在調節dpp(decapentaplegia)受體機制中發揮作用。這暗示哺乳動物 的磷脂醯肌醇蛋白聚糖可調節TGF和BMP之間的信號轉導。具體而 言，已提示磷脂醯肌醇蛋白聚糖可起到一些肝素結合生長因子(例如 EGF、 PDGF、 BMP2和FGF)的共同受體的作用。磷脂醯肌醇蛋白聚糖3已被分離為大鼠腸中發育調節下的轉錄物(Filmus, J.， Church， J.G.和Buick， R.n. (1988) Mol. Cell Biol. 8， 4243-4249)，然後鑑定成一種磷脂醯肌醇蛋白聚糖家族的GPI-連接的硫 酸乙醯肝素蛋白聚糖OCT-5，其核心蛋白的分子量為69kDa(Filmus， J.， Shi， W.， Wong， Z,M.和Wong, M丄(1995) Biochem. J. 311， 561-565)。同 樣在人中，編碼磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的基因已從人胃癌細胞系中被 分離為MXR-7(Hermann Lage等，Gene 188 (1997) 151-156)。已有報導， 磷脂醯肌醇蛋白聚糖3與胰島素樣生長因子-2形成蛋白一蛋白複合體， 以便調節生長因子的作用(Pilia, G.等，(1996) Nat. Genet. 12， 241-247)。 此報導提出磷脂醯肌醇蛋白聚糖3不總是與含有硫酸乙醯肝素鏈的生 長因子相互作用。已有報導建議磷脂醯肌醇蛋白聚糖3可用作肝癌標記(Hey-Chi Hsu等，CANCER RESERCH 57， 5179-5184 (1997))。然而，沒有發現 說明磷脂醯肌醇蛋白聚糖3和癌細胞增殖之間的明確關係。此外，也有提示磷脂醯肌醇蛋白聚糖可起到內皮抑素(endostatin) 受體的作用，所述內皮抑素可用作血管形成抑制劑(MolecularCell (2001), 7, 811-822)。但是，這種功能與細胞增殖之間的關係仍然未加以 闡述。如上所述，已說明了磷脂醯肌醇蛋白聚糖3參與細胞增殖。然而， 細胞增殖機制等是未知的，以及磷脂醯肌醇蛋白聚糖3對細胞增殖的 調節的應用從未嘗試過。發明概述深入研究的結果發現，抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體通過ADCC(抗體依賴的細胞介導的細胞毒性)活性和CDC(補體依賴的細胞 毒性)活性而施加細胞增殖抑制活性，由此完成了本發明。此外，還預 測抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體也通過抑制生長因子的作用而施加細 胞增殖抑制活性。而且，抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體也通過與諸如 放射性同位素、化療劑或細菌衍生的毒素等的細胞毒性物質結合而施 加細胞增殖抑制活性。本發明的主題如下(1) 一種細胞生長抑制劑，其含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體作 為活性成分；(2) (l)所述的細胞生長抑制劑，其中抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體 具有細胞毒性活性；(3) (2)所述的細胞生長抑制劑，其中細胞毒性活性為抗體依賴的細 胞介導的細胞毒性(ADCC)活性或補體依賴的細胞毒性(CDC)活性；(4) (1)-(3)中任一項所述的細胞生長抑制劑，其中細胞為癌細胞；(5) (4)所述的細胞生長抑制劑，其中細胞選自肝癌細胞、肺癌細胞、 結腸癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、白血病細胞、淋巴瘤細胞 和胰腺癌細胞-，(6M5)所述的細胞生長抑制劑，其中細胞為肝癌細胞；(7) (1)-(6)中任一項所述的細胞生長抑制劑，其中抗體為單克隆抗體；(8) (1)-(6)中任一項所述的細胞生長抑制劑，其中抗體為人源化抗 體或嵌合抗體；(9) 一種抗體，.其磷脂醯肌醇蛋白聚糖3結合；(10) (9)所述的抗體，其具有細胞毒性活性；(11) (10)所述的抗體，其具有針對肝癌細胞的細胞毒性活性；以及(12) (ll)所述的抗體，其具有針對HuH-7肝癌細胞系的細胞毒性 活性。下文將詳細說明本發明。本發明為一種含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖抗體作為活性成分的細 胞生長抑制劑。此外，本發明為一種含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖抗體 作為活性成分的細胞生長抑制劑，其可用於針對基於異常細胞增殖的 疾病的治療，特別是針對癌症的治療。本發明的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的例子包括已知抗體，例如人源化抗體、人抗體(W096/33735)、嵌合抗體(日本專利公布(Kokai) 號4-228089 A(1992))或小鼠抗體以及本發明中公開的抗體。另外，抗 體可以為多克隆抗體，並且優選單克隆抗體。本發明中所用的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體可來自任何起源， 可屬於任何類型(單克隆或多克隆抗體)以及可以是任何形式，只要其能 夠抑制細胞增殖。1. 抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體本發明中所用的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體可通過已知途徑以 多克隆抗體或單克隆抗體的形式獲得。本發明中所用的特別優選的抗 磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體為源自哺乳動物的單克隆抗體。源自哺乳 動物的單克隆抗體的例子包括由雜交瘤產生的抗體以及通過基因工程 技術利用含有抗體基因的表達載體轉化的宿主所產生的抗體。該抗體 結合到磷脂醯肌醇蛋白聚糖3上以便抑制細胞增殖。這樣一種抗體的例子為由本發明的雜交瘤克隆所產生的單克隆抗體。2. 產抗體的雜交瘤產單克隆抗體的雜交瘤可基本上利用如下已知的技術進行製備。 即，雜交瘤的製備方法如下根據標準免疫方法，利用磷脂醯肌醇蛋白聚糖3作為免疫原進行免疫接種，通過標準細胞融合方法將上述獲 得的免疫細胞與已知的親本細胞融合，然後採用標準篩選方法對產單 克隆抗體的細胞進行篩選。具體而言，單克隆抗體可如下製備。如Lage， H.等所公開(Gene 188 (1997), 151-156)，通過表達磷脂醯 肌醇蛋白聚糖3(MXR7)基因(胺基酸序列)，首先獲得準備用作免疫原誘 導抗體的人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3。具體而言，將編碼磷脂醯肌醇蛋白 聚糖3的基因序列插入在一已知的表達載體系統中，轉化適當的宿主 細胞，然後通過己知方法從宿主細胞或培養物上清液中純化出靶人磷 脂醯肌醇蛋白聚糖3蛋白。 接著，該純化的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3蛋白用作免疫原。或者， 磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的部分肽可用作致敏抗原。這時，部分肽可以 從人磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的胺基酸序列中通過化學合成獲得。抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體與ADCC作用、CDC作用和生長因 子的活性一起抑制細胞增殖活性。此外，抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗 體還可通過與諸如放射性同位素、化療劑或源自細菌的毒素的細胞毒 性物質結合而抑制細胞增殖。因此，在本發明中，磷脂醯肌醇蛋白聚 糖3分子上的表位被抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體所識別，其不限於 特定的表位。抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體可識別任何表位，只要所 述表位存在於磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子上。因而，任何片段可用作 抗原來製備本發明的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，只要其在磷脂醯 肌醇蛋白聚糖3分子上含有所述表位。用免疫原進行免疫接種的哺乳動物不是特別受限，考慮到與準備 用於細胞融合的親本細胞的相容性而優選加以選擇。例如，通常使用 諸如小鼠、大鼠、倉鼠或兔子或猴子的嚙齒類動物。根據已知方法，用免疫原對動物進行免疫接種。例如，將免疫原 腹膜內或皮下注射哺乳動物，採用這種常規方法進行免疫接種。具體 而言，將免疫原用適當體積的PBS(磷酸鹽緩衝液)、生理鹽水等稀釋或 懸浮於其中；如果需要，把適當體積的諸如弗氏完全佐劑的標準佐劑 與產物混合；乳化；然後每4-21天，將溶液施用給哺乳動物若干次。 此外，適當的載體也可在免疫接種時與免疫原一起使用。如上所述對哺乳動物進行免疫接種，然後確認血清中所需抗體的 效價增加。隨後，從哺乳動物中收集免疫細胞，並進行細胞融合。優 選的免疫細胞尤其為脾細胞。作為準備與上述免疫細胞相融合的配偶體細胞，使用哺乳動物的 骨髓瘤細胞。此處優選使用的骨髓瘤細胞的細胞系的例子包括各種已 知的細胞系，例如P3(P3x63Ag8.653)(J. Immuol. (1979) 123, 1548-1550)、 P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7)、 NS-l(Kohler. G.和Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519)、 MPC-1 l(Margulies. D.H.等，Cell (1976) 8， 405-415)、 SP2/0(Shulman, M.等，Nature (1978) 276, 269-270)、 FO(de St. Groth， S. F.等，J. Imimmol. Methods (1980) 35， 1-21)、 S194(Trowbridge， I. S. J. Exp. Med. (1978) 148， 313-323)和R210(Galfre， G.等，Nature (1979) 277, 131-133)。上述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合可基本上按照已知方法， 例如Kohler和Milstein等(Kohler. G.和Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73， 3-46)的方法進行。更具體而言，上述細胞融合在含有例如細胞融合加速劑的標準營 養培養液中進行。作為細胞融合加速劑，例如，可使用聚乙二醇(PEG)、 日本血細胞凝集病毒(HVJ)等。如果需要，可加入佐劑，例如二甲亞碸，以進一步增強融合效率。對此處所用的免疫細胞與骨髓瘤細胞的任何比例可加以設定。例 如，免疫細胞數優選高出骨髓瘤細胞數i-io倍。作為準備用於上述細 胞融合的培養液，例如，可使用對上述骨髓瘤細胞系生長合適的RPMI1640培養液或MEM培養液，或者使用用於這種細胞培養的其他 標準培養液。此外，諸如胎牛血清(FCS)的血清流體可以組合形式使用。細胞融合的方法如下在上述培養液中混合足夠數量的上述免疫 細胞和骨髓瘤細胞，加入在約37'C預先加熱的PEG(例如，平均分子量 約為1000-6000)溶液(濃度一般為30-60%(w/v))，然後混合上述溶液， 以便形成靶融合細胞(雜交瘤)。隨後，相繼加入適當的培養液，並且重 復通過離心除去上清液的步驟，從而去除對雜交瘤生長不利的細胞融 合的試劑等。通過在諸如HAT培養液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷的培養 液)的標準選擇性培養液中培養雜交瘤而對上述獲得的雜交瘤加以選 擇。在上述HAT培養液中持續培養一段時間，足夠讓細胞(未融合細胞) 而非靶雜交瘤死亡(通常數天至數周)。隨後，採用標準限制稀釋方法，從而對產生耙抗體的雜交瘤進行篩選和單克隆。除了用抗原對非人動物進行接種免疫來獲得上述雜交瘤的方法以 外，通過用磷脂醯肌醇蛋白聚糖3體外致敏人淋巴細胞，並使致敏淋 巴細胞與具有永久分裂潛力的人衍生的骨髓瘤細胞融合的方法也可獲 得與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3具有結合活性的所需的人抗體(參見日本專 利公布(Kokoku)號1-59878 B (1989))。此外，將磷脂醯肌醇蛋白聚糖3作為抗原施用給具有全部人抗體基因庫的轉基因動物以獲得產抗磷脂 醯肌醇蛋白聚糖3抗體的細胞，然後磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的人抗體 可從無限增殖化的產抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的細胞中獲得(參見 國際專利公布號WO 94/25585、 WO 93/12227、 WO 92/03918和WO94/02602)。這樣製得的產單克隆抗體的雜交瘤可在標準培養液中傳代培養， 或者可長時間儲存在液氮中。用於從雜交瘤中獲得單克隆抗體的方法的一個例子包括根據標準 方法培養雜交瘤以及在培養物上清液中獲得單克隆抗體。另一方法包 括將雜交瘤施用給與雜交瘤相容的哺乳動物以使它們增殖，並在腹水 中獲得單克隆抗體。前一方法適用於獲得高純度的抗體。而後一方法 適用於大量生產抗體。3.重組抗體 .可用於本發明的單克隆抗體為重組單克隆抗體，其製備方法如下 採用基因工程技術從雜交瘤中克隆抗體基因，把基因整合到合適的載 體中，將載體導入宿主，然後使宿主產生重組單克隆抗體(例如，參見Vandamme， A. M.等，Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775， 1990)。具體 而言，將編碼抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的可變(V)區的mRNA從產 抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的雜交瘤中分離出來。mRNA的分離方 法是已知的，例如胍超速離心法(Chirgwin, J. M.等，Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)或AGPC法(Chomczynski, P等，Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)，由此製備總RNA。然後採用mRNA純化試劑盒 (Pharmacia)等製備耙mRNA。除此之外，mRNA也可利用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接製備。.利用反轉錄酶從上述製得的mRNA中合成抗體V區的cDNA。 cDNA的合成採用AMV反轉錄酶第一條鏈cDNA合成試劑盒 (SEIKAGAKU CORPORATION)等。此外，為了合成和擴增cDNA,例 如，可採用5，-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech)和5，-RACE法 (Frohman， M. A.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A.等，Nucleic Acids Res. (1989) 17， 2919隱2932)通過PCR進行。從這樣獲得的PCR產物中純化靶DNA片段，然後連接到一載體 DNA上。而且，重組載體從產物中製備，並繼續將載體導入大腸桿菌 (Escherichia coli)等中，挑選克隆，由此製備所需的重組載體。靶DNA 的核苷酸序列通過已知方法，例如雙脫氧核苷酸鏈終止法而確認。在編碼靶抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的V區的DNA獲得之後， 將該DNA整合到一表達載體中，所述表達載體含有編碼所需抗體的恆 定區(C區)的DNA。為了產生本發明所用的抗磯脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，將抗體基 因整合到表達載體中，以便基因在包括例如增強子和啟動子的基因表 達控制區的調節下得以表達。下一步，用表達載體轉化宿主細胞，使 宿主表達抗體。抗體基因的表達可將編碼抗體重鏈(H鏈)的DNA或編碼抗體輕鏈 (L鏈)的DNA分別整合到表達載體中，然後同時把這兩個表達載體轉 化宿主細胞；或者將編碼H鏈和L鏈的DNA整合到單一表達載體中， 然後把此載體轉化宿主細胞(參見WO 94/11523)。除了上述宿主細胞以外，轉基因動物也可用來產生重組抗體。例 如，將抗體基因插入編碼奶中獨特產生的蛋白(例如，山羊P酪蛋白) 的基因，從而製備融合基因。將其中已插入抗體基因的含有融合基因 的DNA片段注射到山羊胚胎中，然後將此胚胎導入雌性山羊。從由轉 基因山羊或已接受了胚胎的山羊生出的後代所產生的奶中獲得期望的 抗體。此外，為了增加含有由轉基因山羊所產生的期望抗體的奶量， 可對轉基因山羊施用激素(Ebert, K.M.等，Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。4.變造抗體(altered antibody)在本發明中，除了上述抗體外，諸如嵌合抗體或人源化抗體的人 工變造的基因重組抗體可用於例如降低針對人的異種抗原性。這些變 造抗體可採用已知的方法產生。嵌合抗體的製備方法如下將編碼上述抗體V區的DNA連接到 編碼人抗體C區的DNA上，把此產物整合到表達載體上，然後使載體 導入宿主以使宿主產生抗體。利用這種已知方法，可獲得本發明中有 用的嵌合抗體。人源化抗體也稱重構人抗體，其製備方法是將除人以外的哺乳動 物例如小鼠的抗體CDR(互補決定區)嫁接到人抗體的CDR。其總的基 因重組技術也是己知的(參見歐洲專利申請公布號EP 125023和WO 96/02576)。具體而言，DNA序列的合成是通過PCR方法利用若干寡核苷酸 作為引物進行的，所述寡核苷酸已事先製備，具有使小鼠抗體CDR的 終止區和人抗體的框架區(FR)重疊的部分(參見WO 98/13388中所述的 方法)。對與具有良好抗原結合部位的CDR連接的框架區加以選擇。如果 需要，可替換抗體可變區中的框架區的胺基酸，以便重構人抗體的CDR 形成合適的抗原結合部位(Sato， K.等，Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。對於嵌合抗體和人源化抗體的C區使用人抗體區。例如，對於H 鏈，可使用CYl、 Cy2、 Cy3或Cy4，而對於L鏈，可使用Ck或 C入。此外，為了提高抗體或其生產的穩定性，人抗體C區可加以修飾。嵌合抗體由源自除人以外的哺乳動物的抗體的可變區和衍生自人 抗體的恆定區組成。詞時，人源化抗體由源自除人以外的哺乳動物的抗體的CDR和衍生自人抗體的框架區和C區組成。由於人源化抗體的 抗原性預定在人體中是低的，因此，其可用作本發明治療劑的活性成 分。5.修飾抗體用於本發明的抗體不限於整個分子，只要其能與磷脂醯肌醇蛋白 聚糖3結合以及抑制細胞增殖即可，並且可以是抗體片段或其修飾產 物。二價抗體和單價抗體均包括在內。抗體片段的例子包括Fab、 F(ab，)2、 Fv、含有一個Fab和完整Fc的Fab/c以及單鏈Fv(scFv)，其 中H鏈或L鏈的Fv與適當的接頭相連接。具體而言，通過採用諸如木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶處理抗體而合成抗體片段，或者構建編碼這 些抗體片段的基因，將這些基因導入表達載體，然後通過適當的宿主 細胞表達基因(參見例如，Co., M.S.等，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976， Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckth叫A. & Skerra， A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496， Academic Press, Inc., Lamoyi, E,， Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663， Rousseaux, J.等，Methods in Enzymology (1989) 121， 663-669，以及Bird, R. E.等，TIBTECH (1991) 9， 132-137)。將抗體的H鏈V區與L鏈V區連接獲得scFv。在scFv中，H鏈 V區和L鏈V區通過接頭或優選通過肽接頭連接(Huston， J. S.等，Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85， 5879-5883)。 scFv中的H鏈V區和L鏈V區可源自如本說明書中所述抗體的任一種。作為連接V區的肽接 頭，例如，使用任一含有12-19個胺基酸殘基的單鏈肽。編碼scFv的DNA可如下獲得。通過PCR方法利用編碼所需氨基 酸序列的整個或部分DNA(編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區的DNA 以及編碼L鏈或L鏈V區的DNA)作為模板以及規定兩端的引物對進 行擴增。然後通過組合使用編碼肽接頭部分的DNA和規定使兩端各自與H鏈和L鏈連接的引物對，進一步進行擴增。此外，一旦製備了編碼scFv的DNA，含有DNA的表達載體以及 轉化有表達載體的宿主可根據標準方法獲得。另外，通過使用宿主，scFv 可根據標準方法獲得。利用宿主通過以與上述方法相似的方式獲得其基因並且使基因表 達，可產生這些抗體片段。本發明中的"抗體"也包括這些抗體片段。作為修飾抗體，可採用與聚乙二醇(PEG)或諸如細胞毒性物質的各 種各樣的分子之一結合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖抗體。本發明中的"抗 體"也包括這些修飾的抗體。這種修飾抗體可通過化學修飾得到的抗 體而獲得。此外，抗體修飾方法在本技術領域中也已建立。而且，用於本發明中的抗體可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體 可具有識別磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子上不同表位的抗原結合部位。 或者， 一個抗原結合部位可識別磷脂醯肌醇蛋白聚糖3，而另一抗原結 合部位可識別諸如化療劑、源自細胞的毒素、放射性物質等的細胞毒 性物質。在這種情況下，細胞毒性物質允許直接作用於表達磷脂醯肌 醇蛋白聚糖3的細胞上以特異性破壞腫瘤細胞，從而腫瘤細胞的增殖 可以得到抑制。雙特異性抗體可通過結合兩種抗體的H-L對而製備， 它也可通過融合產不同單克隆抗體的雜交瘤以製備產雙特異性抗體的 融合細胞來獲得。此外，雙特異性抗體也可通過基因工程技術製備。6.重組抗體或修飾抗體的表達和生產如上所述構建的抗體基因可通過已知方法表達和獲得。在哺乳動 物細胞的情況下，基因可通過可操作連接常用的有用啟動子和待表達 的抗體基因以及通過連接位於其3'端下遊的polyA信號而得以表達。例如，啟動子/增強子是人巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子。此外，另一可在本發明中用於抗體表達的啟動子/增強子的例子包 括病毒啟動子/增強子，如反轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒或猿猴病毒40(SV40)，或者源自哺乳動物細胞的啟動子/增強子，如人延伸因子 la(HEFla)。當採用SV40啟動子/增強子時，通過Mulligan等(Nature (1979) 277， 108)的方法可容易地進行基因表達，而當採用HEFla啟動子/增強子時， 通過Mizushima等(Nucleic Acids Res. (19卯)18, 5322)的方法可容易地 進行基因表達。在大腸桿菌的情形下，將常用的有用啟動子、用於抗體分泌的信 號序列以及待表達的抗體基因可操作連接，以便基因可得以表達。啟 動子的例子包括lacz啟動子和araB啟動子。當採用lacz啟動子時，通 過Ward等(Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) 的方法可表達抗體基因，而當採用araB啟動子時，通過Better等(Science (1988) 240， 1041-1043)的方法可表達抗體基因。作為抗體分泌的信號序列，當抗體在大腸桿菌的周質中產生時， 可採用pelB信號序列(Lei， S. P.等，J. Bacteriol. (1987) 169， 4379)。在周質中產生的抗體被分離後，將抗體的結構適當地加以摺疊和使用。可用的複製起點源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV) 等。此外，為了在宿主細胞系統中擴增基因拷貝數，表達載體可含有 氨基糖苷轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌 呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇 標記。為了生產用於本發明的抗體，可採用任何表達系統，例如真核細 胞系統或原核細胞系統。真核細胞的例子包括動物細胞，如建立的哺 乳動物細胞系統或昆蟲細胞系統的細胞，以及絲狀真菌細胞和酵母細胞。原核細胞的例子包括諸如大腸桿菌細胞的細菌細胞。優選地，用於本發明中的抗體在諸如CHO、 COS、骨髓瘤、BHK、 Vero或Hda細胞的哺乳動物細胞中表達。接著，將轉化的宿主細胞體外或體內培養，以便使宿主細胞產生 靶抗體。根據已知方法，培養宿主細胞。例如，作為培養液，可採用 DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDM等。諸如胎牛血清(FCS)的血清流 體可以組合形式使用。7. 抗體的分離和純化-如上所述表達和生產的抗體可從細胞或宿主動物中分離，並純化 成一致的水平。準備用於本發明中的抗體的分離和純化可利用親和柱 進行。利用蛋白A柱的例子為HyperD、 POROS、 Sepharose F.F.(Pharmacia)。其他用於蛋白的標準分離和純化方法也可使用，對其 應用沒有限制。例如，除了上述親和柱以外的層析柱、滲濾、超濾、 鹽析方法、透析等可適當加以選擇並組合使用，以便分離和純化抗體 (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring ■Harbor Laboratory, 1988)。8. 抗體活性的確認已知方法可用來分析本發明中所用的抗體的抗原結合活性 (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow， David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)以及抑制配體受體結合的活性(Harada， A.等， International Immunology (1993) 5， 681-690)。作為測定本發明中所用的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原結 合活性的方法，可採用ELISA(酶聯免疫吸附測定)、EIA(酶免疫測定)、 RIA(放射免疫測定)或螢光抗體技術。例如，當採用酶免疫測定時，將 含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的樣品，如產抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的細胞的培養物上清液，或者純化的抗體加入到塗覆有磷脂 醯肌醇蛋白聚糖3的平板上。加入標記有諸如鹼性磷酸酶的酶的第二 抗體。然後將平板溫育，洗滌，加入酶底物，如對硝基苯基磷酸，接 著測定吸光度，以便對抗原結合活性加以評價。為了證實用於本發明的抗體的活性，對抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 抗體的中和活性進行測定。9. 細胞毒性活性用於本發明中的抗體具有ADCC活性或CDC活性作為細胞毒性 活性。通過混合效應細胞、靶細胞和抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，然 後檢測ADCC的水平，可對ADCC活性進行測定。作為效應細胞，例 如，可採用小鼠脾細胞、人外周血或分離自骨髓的單細胞。作為靶細 胞，例如，可釆用人建立的細胞系，如HuH-7人肝癌細胞系。耙細胞 事先用"Cr標記，將抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體加入到細胞中，然 後進行溫育。接著，以效應細胞與靶細胞適當的比例加入效應細胞， 然後進行溫育。溫育後，收集上清液，對上清液中的放射性進行計數， 從而可測定ADCC活性。CDC活性的測定方法如下混合上述標記的靶細胞和抗磷脂醯肌 醇蛋白聚糖3抗體，加入補體，溫育，培養，然後對上清液中的放射 性進行計數。抗體需要Fc部分施加細胞毒性活性。當本發明的細胞生長抑制劑 利用抗體的細胞毒性活性時，用於本發明的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 抗體需要含有Fc部分。10. 抑制血管形成本發明的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體可用於抑制血管形成。 11.給藥方法以及藥物製劑本發明的細胞生長抑制劑用於治療或改善由基於異常細胞增殖的 疾病，特別是癌症引起的狀況。本發明的細胞生長抑制劑的靶癌細胞的優選例子包括，但不特異 性限於，肝癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌 細胞、白血病細胞、淋巴瘤細胞和胰腺癌細胞。肝癌細胞是特別優選 的。有效劑量選自每次給藥每kg體重為0.001mg至1000mg的範圍內。 或者，可選擇的劑量範圍為每個患者0.01-100000mg。然而，含有本發 明的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的治療劑不限於這些劑量。另外，作為本發明的治療劑的服藥時間，藥劑可在疾病臨床症狀 發作之前或之後施用。根據標準方法(Remington，s Pharmaceutical Science,最新版，Mark Publishing Company, Easton， U.S.A.),含有本發明的抗磷脂醯肌醇蛋白 聚糖3抗體作為活性成分的治療劑可加以配製，並且可一起含有可藥 用的載體和添加劑。這種載體和藥物添加劑的例子包括水、可藥用有機溶劑、膠原蛋 白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、 聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖 維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、 雙甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白 蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖以及可接受的表面活性劑作為藥 物添加劑。上述添加劑的一種或適當組合在實踐中根據本發明治療劑的劑型 加以選擇，但不限於此。例如，可用作注射用藥物製劑的藥劑的製備 方法是將純化的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體溶解在諸如生理鹽水、緩衝液或葡萄糖溶液的溶劑中，然後向溶液中加入諸如Tween80、 Tween20、明膠或人血清白蛋白的吸附抑制劑。或者，凍幹劑可用來制 備劑型，其在用前復溶而溶解。作為凍幹的賦形劑，例如，可採用諸 如甘露醇或葡萄糖的糖醇或糖類。附圖簡述

圖1示出抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)對HuH-7細胞的 ADCC活性。圖2示出抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6511)對HuH-7細胞的 CDC活性。圖3示出磷脂醯肌醇蛋白聚糖在HuH-7細胞上的表達。圖4A示出FACS分析由人肺癌細胞系表達GPC3的結果。它們是 用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結果。圖4B示出FACS分析由人白血病細胞系表達GPC3的結果。它們 是用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結果。圖4C示出FACS分析由人淋巴瘤細胞系表達GPC3的結果。它們 是用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結果。圖4D示出FACS分析由人結腸癌細胞系表達GPC3的結果。它們 是用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結果。圖4E示出FACS分析由人乳腺癌細胞系表達GPC3的結果。它們 是用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結果。圖4F示出FACS分析由人前列腺癌細胞系表達GPC3的結果。它 們是用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結果。圖4G示出FACS分析由人胰腺癌細胞系和人肝癌細胞系表達 GPC3的結果。它們是用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的 結果。實施發明的最佳方式本發明將參考下列實施例進一步描述。然而，本發明的技術範圍 不受這些實施例等的限制。實施例1針對磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3合成肽的單克隆抗體的製備合成具有人磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3蛋白的胺基酸序列(第355位到 第371位的胺基酸)(RQYRSAYYPEDLFIDKK)的肽。利用馬來醯亞胺 苯甲醯氧基琥珀醯亞胺(MBS)型交聯劑將合成肽結合到匙孔血藍蛋白 (KLH)上，由此製備免疫原。將小鼠(BALB/c，雌性，6周齡)用免疫原 以每隻小鼠100ug的劑量免疫接種3次。分析血清中的抗體效價。抗 體效價測定方法包括使稀釋血清與固定在平板上的肽(0.5yg)反應，與 HRP標記的抗小鼠抗體進行反應，加入底物，然後在顯色的450nm處 測定吸光度(肽固相ELISA方法)。在確認抗體效價後，收集脾細胞， 再與骨髓瘤細胞(P3/X63-AgS)融合(K6hler, G， Milstein， C: Nature， 256: 495 (1975)),由此製備雜交瘤。接著對5種雜交瘤生產的單克隆抗體進 行純化。利用肽固相ELISA方法，測定對肽的結合活性，然後選擇具 有高結合活性的IgGl抗體(下文稱K6534)和IgG3抗體(下文稱K6511)。實施例2利用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體抑制細胞增殖 根據Current Protocols in Immunology,第7章,Immunologic studies in humans, John E, Cologan等編,John Wiley & Sons, Inc., 1993 中所述的方法，對ADCC(抗體依賴的細胞介導的細胞毒性)活性和 CDC(補體依賴的細胞毒性)活性進行測定。1.製備效應細胞從CBA/N小鼠(8周齡，雄性)摘出脾臟，然後將脾細胞分離在 RPMI1640培養基(GIBCO)中。把細胞洗滌在含有10。/。肽牛血清(FBS, HyClone)的同樣培養基中，使製得的細胞濃度為5X 106/mL，由此製備 效應細胞。2. 製備補體溶液將幼兔補體(CEDARLANE)在10%含FBS的DMEM培養基 (GIBCO)中稀釋10倍，由此製備補體溶液。3. 製備耙細胞將HuH-7人肝癌細胞系(Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) No. JCRB0403, Human Science Research Support Bank (Human Science Kenkyu Shien Bank))用0.2mCi的"Cr-鉻酸鈉 (Amersham Pharmacia Biotech)在10%含FBS的DMEM培養基中37°C 下培養1小時，由此進行放射性標記。在放射性標記後，將細胞在10% 含FBS的RPMI1640培養基中洗滌3次，製得的細胞濃度為2X 105/mL， 由此製備靶細胞。4. 測定ADCC活性各50y 1的耙細胞和抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)加入到 96孔的U型底平板(BecktonDickinson)中，在冰上反應15分鐘。然後 加入100yl的效應細胞，並在二氧化碳氣體培養箱中培養4小時。抗 體的終濃度製成0或10y g/mL。培養後，收集100nL的上清液，並 利用Y計數器(COBRA II AUTO-GAMMA， MODEL D5005， Packard Instrument Company)測定放射性。細胞毒性活性(。/。)利用公式 (A-C)/(B-C)X100求出。其中，"A"代表各樣品中的放射性(cpm)， "B" 代表補充有1。/。NP-40(nacalaitesque)的樣品中的放射性(cpm)，以及"C" 代表僅含有耙細胞的樣品中的放射性(cpm)。試驗重複兩次，並計算出 平均值。5. 測定CDC活性各50y 1的靶細胞和抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6511)加入到 96孔的平底平板(Beckton Dickinson)中，在冰上反應15分鐘。然後加 入100yl的補體溶液，接著在二氧化碳氣體培養箱中培養4小時。抗體的終濃度為0或3"g/mL。培養後，收集100uL的上清液，並利用 y計數器測定放射性。以在"4.測定ADCC活性"中所用的同樣方式求出細胞毒性活性(％)。試驗重複兩次，並計算出平均值。圖1示出ADCC活性，而圖2示出CDC活性。這些結果揭示出 抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體對HuH-7人肝癌細胞系施加了 ADCC活 性和CDC活性，從而抑制了細胞增殖。實施例3測定磷脂醯肌醇蛋白聚糖在HuH-7細胞上的表達水平 將大約5X 105個HuH-7細胞懸浮在100 u 1的FACS/PBS(通過將 lg牛血清白蛋白(SIGMA)溶解在1L的CellWASH(Beckton Dickinson) 中來製備)。然後，把抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6511)或小鼠 IgG2a(Biogenesis)作為對照抗體以25 U g/mL的濃度加入，並讓溶液在 冰上放置30分鐘。在用FACS/PBS洗滌後，產物懸浮在100ixl的 FACS/PBS中。加入4 y 1的山羊抗小鼠Ig FITC(Becton Dickinson),並 讓溶液在冰上放置30分鐘。在用FACS/PBS洗滌兩次之後，將產物懸浮於1 ml的FACS/PBS 中。利用流式細胞儀(EPICS XL， BECKMAN COULTER)測定細胞的螢光強度。圖3示出流式細胞儀測定的結果。磷脂醯肌醇蛋白聚糖3在HuH-7 細胞上表達，這提示抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體結合於在細胞上表 達的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3，從而抑制細胞增殖(圖3)。實施例4利用FCM分析GPC3在癌細胞組上的表達利用FCM對人癌症細胞系(肺、結腸、直腸、乳腺、前列腺、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、胰腺和肝臟)表達的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(GPC3)進行分析。將細胞培養2天，然後進行分析。利用已經細胞解離緩衝液(目錄號13150-016,批號1098554, GIBCO)稀釋10倍的胰蛋白酶-EDTA(目錄 號25300-054，批號14210, GIBCO)收集附著的細胞。讓收集的細胞在 冰上與抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534， 600 n g/ml)或mlgG2a抗 體作為陰性對照(Biogenesis, M-IgG2a-i，批號EA990719A， 1 mg/ml)(抗 體終濃度為10ug/ml)反應。洗滌後，讓細胞與FITC標記的抗小鼠Ig 抗體(目錄號349031， BD PharMingen)在冰上反應(2u 1/測試)。細胞洗滌 後，利用流式細胞儀(EPICS XL, BECKMAN COULTER)測定螢光強度。 結果，GPC3的表達在下列細胞系中得到證實肺癌細胞系(A549， NCI-H460, NCI-H23, NCI-H226, DMS114, EKVX， HOP-62和NCI-H322 M;白血病細胞系P30/OHK, BALL-l, THP-1和P39/TSU)、淋巴瘤細胞 系(MLMA, Ramos和U937)-,、結腸癌細胞系(SW480, COLO205, Lo Vo 和SW837)、乳腺癌細胞系(MDA-MB-231, SK-BR-3和MDA-MB-468)、 前列腺癌細胞系(LNCaP和22Rvl)、胰腺癌細胞系(MIAPaCa-2)和肝癌 細胞系(HepG2)。根據這些結果，可得出結論本發明的細胞生長抑制 劑在治療肺癌、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺 癌等中是有用的。工業實用性根據本發明，提供了含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性 成分的細胞生長抑制劑。而且，根據本發明，提供了含有抗磷脂醯肌 醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分的癌細胞生長抑制劑。抗磷脂醯肌醇 蛋白聚糖3抗體與在人肝癌細胞系的HuH-7細胞上表達的磷脂醯肌醇 蛋白聚糖3結合，從而抑制細胞增殖。由此，含有抗磷脂醯肌醇蛋白 聚糖3抗體的藥劑作為細胞生長抑制劑是有用的，特別是作為癌細胞 抑制劑。所有在此引用的出版物、專利和專利申請以其全文在此引作參考。 所以，本領域專業技術人員容易理解，在不背離如所附權利要求中所 述的本發明的技術概念和範圍的情況下，有可能對本發明作出眾多修 改和變化。本發明旨在包括這樣的修改和變化。
權利要求
1. 具有胞毒活性的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體。
2. 權利要求l所述的抗體，胞毒活性為抗癌細胞的胞毒活性。
3. 權利要求1或2所述的抗體，其中癌細胞為肝癌細胞。
4. 權利要求3所述的抗體，其中肝癌細胞為HuH-7肝癌細胞系細胞。
5. 權利要求l-4任一項所述的抗體，其中胞毒活性為抗體依賴的 細胞介導的胞毒活性。
6. 權利要求l-4任一項所述的抗體，其中胞毒活性為補體依賴的 胞毒活性。
7. 權利要求l-6任一項所述的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
8. 權利要求l-7任一項所述的抗體，其中所述抗體為嵌合抗體。
9. 權利要求l-8任一項所述的抗體，其中所述抗體為人源化抗體。
10. 藥物組合物，包含權利要求l-9任一項所述的抗體。
全文摘要
本發明提供了一種細胞生長抑制劑，其可用於治療基於異常細胞增殖的疾病，尤其是癌症。細胞生長抑制劑含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分。
文檔編號C12N15/06GK101240022SQ20071009603
公開日2008年8月13日 申請日期2002年6月21日 優先權日2001年6月22日
發明者中村徹雄, 土屋政幸, 油谷浩幸 申請人:中外製藥株式會社