用於梅花鹿茸真偽鑑別的引物及探針、試劑盒和方法

2023-05-28 00:39:01

專利名稱：用於梅花鹿茸真偽鑑別的引物及探針、試劑盒和方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體而言，本發明涉及用於梅花鹿茸真偽鑑別的特異 性寡核苷酸引物及探針，包含本發明的特異性寡核苷酸引物及探針的試劑盒，用於鑑別梅 花鹿茸真偽的實時螢光PCR檢測方法，以及所述特異性寡核苷酸引物和探針或試劑盒在鑑 別梅花鹿茸真偽中的應用。
背景技術：
jfg ^ (Cornu Cervi Pantotrichum) i jfg 禾鬥雲力· _ jfg (Cervus nippon Temminck)或馬鹿(Cervus elaphus Linnaeus)雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，習稱花鹿茸、 馬鹿茸。鹿茸分鋸茸(不具頭骨的鹿茸)、砍茸( 帶頭骨的鹿茸)和鹿茸片(鹿茸切制加工 後而成的薄片)。鹿茸具有壯腎陽、益精血、強筋骨等功效，為名貴藥材。鹿的種類甚多，但有藥用價值的主要指梅花鹿和馬鹿，且認為梅花鹿茸較馬鹿茸 質優。目前我國僅有部分地區有少量野生梅花鹿，為保護資源，已將梅花鹿列為國家一級保 護動物，馬鹿列為國家二級保護動物，而藥用鹿茸現主要取自人工飼養之鹿。梅花鹿茸主產 於吉林、遼寧、河北等地，馬鹿茸主產於黑龍江、吉林、內蒙古等地。梅花鹿茸作為一種高級營養品，自古以來價格就比較昂貴。隨著生活水平的提高， 人們對鹿茸的消費量也在不斷攀升。由於鹿茸的價格受到鹿茸的品種、產地等諸多因素的 影響，一些不法廠商通過以假充真、以次充好的手段銷售鹿茸，嚴重欺騙了消費者的知情 權，影響了市場秩序。目前在市場上流通的梅花鹿摻假形式主要表現為三種情況一、真皮 假內這種造假行為是將原枝梅花鹿茸末段經水處理後剝取外皮，然後用鋸末、膠水、色素 混合加壓填入所剝取的皮內，再將皮粘緊，令人肉眼看不出來；二、注油加重將質量較好、 質地較疏鬆的原枝梅花鹿茸，排血烘乾後順排血孔道注入食用油，然後再將排血孔塞住，讓 油充分滲透到鹿茸枝體內；三、以馬鹿茸片充當梅花鹿茸片將本是黑褐色或褐色的馬鹿 茸片，根據需要採用不同濃度的雙氧水浸泡製成淡黃色或淡棕色，然後挑選出形態與梅花 鹿茸片相似的混到梅花鹿茸片中銷售，從中獲取更大的利潤。面對多種多樣的摻假形式，為了維護消費者的利益以及良好的市場秩序，國內外 許多學者採用了多種手段對梅花鹿茸的真偽進行鑑別。常用的方法有性狀鑑別、顯微鑑別、 薄層色譜法鑑別、光譜法鑑別、紫外光譜法鑑別等。由於梅花鹿茸中含有的化學成分易受品 種及產地等因素的影響，成分相對複雜；尤其是現在的食品摻偽水平和手段越來越高明，使 許多鑑別真偽的傳統方法不再有效。現代生物技術以其方便、準確、迅速、簡潔的特點，從基因水平分析食品原料和產 品的特性和來源，靈敏度更高、特異性更強，其結果為證明食品的真偽提供了真實、可靠的 依據，給食品種類鑑別、產品溯源等食品鑑偽研究注入了新鮮血液，已成為近年來世界各國 的許多機構和學者致力的研究方向。但是，分子生物學技術在梅花鹿茸鑑偽方面的應用還 處於初步探索階段。聚合酶鏈式反應(PCR)是通過擴增待測樣品的DNA，使其能夠從最初的微小數量增至足以達到檢測限量的巨大數量。PCR方法已用於多種多樣的基因檢測中。實時螢光PCR 在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號來實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲 線對未知模板濃度進行定量分析，使PCR技術從定性水平發展到定量水平。近幾年，在分子 生物學研究中，利用定量PCR對基因表達結果進行檢測，獲得了應用。由於其大大提高了檢 測的靈敏度、特異性和精確性、並能有效地減少實驗過程中產生汙染的危險，目前已廣泛應 用於各個領域。目前，國內外少見報導能快速、簡單、特異且靈敏地鑑別保健品梅花鹿茸的方法。因此，本領域需要一種快速、特異性好、靈敏度高的保健品梅花鹿茸的真偽鑑別方 法，進行保健品梅花鹿茸真偽的鑑別。

發明內容
本發明的一個目的在於，提供快速鑑別梅花鹿茸的特異性寡核苷酸引物及探針。本發明的另一個目的在於，提供快速鑑別梅花鹿茸的實時螢光PCR檢測方法。本發明的再一個目的在於，提供用於快速鑑別梅花鹿茸真偽的試劑盒。本發明的再一個目的在於，提供本發明的特異性寡核苷酸引物和探針在鑑別梅花 鹿茸真偽中的應用。針對上述發明目的，本發明提供以下技術方案根據本發明的一個實施方案，本發明提供用於梅花鹿茸真偽鑑別的特異性寡核 苷酸引物對和探針。本發明以梅花鹿的DNA為檢測基礎，根據線粒體DNA(HitDNA)D-環 (Displancement loop, D-Loop)區序列在不同鹿科物種中具有差異性的特點，克隆了梅花 鹿線粒體DNA D-環區序列。根據這些序列設計引物及探針，利用實時螢光PCR法檢測樣品 中的梅花鹿茸成分。本發明的寡核苷酸引物對和探針是根據不同鹿科物種的線粒體DNAD-環區具有 差異性的特點而設計的。在一個實施方案中，所述引物對由上遊引物和下遊引物組成， 所述上遊引物為 Mhual-Fl :AGCACGTGATATAACCTTATGTGT (SEQ ID No. 1)，所述下遊引物為 Mhual-Rl :CCTATACACCGATTTTATGTACCA (SEQ ID No. 2)；所述探針為 Mhual-P :ATGCATTAAGG CACACATGTACAATGGT (SEQ ID No. 3)，在探針的3』端連接有一個螢光淬滅基團BHQ1，5』端連 接有一個螢光報告基團FAM。使用本發明的引物對和探針的組合，在樣品量極少的情況下， 相對於其他引物對仍能特異、靈敏地擴增出目的片段。根據本發明的另一個實施方案，本發明提供鑑別梅花鹿茸真偽的實時螢光PCR檢 測方法，所述方法包括使用針對梅花鹿茸的特異性寡核苷酸引物對和探針，所述引物對是 根據不同鹿科物種的線粒體DNA D-環區序列具有差異性的特點而設計的。在一個實施方 案中，在本發明的梅花鹿茸真偽鑑別的實時螢光PCR檢測方法中，所使用的特異性寡核苷 酸引物對由上遊引物和下遊引物組成，所述上遊引物的鹼基序列為SEQ ID No. 1，所述下遊 引物的鹼基序列為SEQ ID No. 2 ；所述探針的鹼基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3』端連接 有一個螢光淬滅基團BHQ1，5』端連接有一個螢光報告基團FAM。本發明的發明人通過大量 的篩選工作確定了本發明的特異性寡核苷酸引物對和探針，並建立了穩定的PCR體系，從 而特異且靈敏地鑑別梅花鹿茸的真偽。在一個實施方案中，本發明的梅花鹿茸實時螢光PCR檢測方法還進一步包括提取鹿茸樣品總DNA的步驟。在一個實施方案中，在所述DNA提取步驟中，通過檢測鹿科動物線 粒體DNA D-環區序列，來測試樣品總DNA的提取質量。在一個優選的實施方案中，檢測線粒 體DNA D-環區序列的通用引物對由上遊引物和下遊引物組成，所述上遊引物的鹼基序列為 Luke-F :CATACGCAATYCTACGATCAATTCC(SEQ ID No. 4)，所述下遊引物的鹼基序列為 Luke-R GCTACTARGATTCAGAATAGGCATTG (SEQ ID No. 5)；所述探針的鹼基序列為 Luke-P :TGGTCGGAAT ATYATGCTGCGTTGTTTGG(SEQ ID No. 6)，在探針的3，端連接有一個螢光淬滅基團BHQ2，5，端 連接有一個螢光報告基團TAMRA。所述PCR擴增條件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C，Imin, 40個循環。
根據本發明的另一個實施方案，本發明提供用於快速鑑別梅花鹿茸真偽的試劑 盒，所述試劑盒包括本發明的用於實時螢光PCR方法鑑別梅花鹿茸真偽的特異性寡核苷酸 引物對以及探針和使用說明書。在本發明的試劑盒的優選實施方案中，本發明的特異性寡 核苷酸引物對是根據不同鹿科物種的線粒體DNA D-環區序列具有差異性的特點而設計的。 在一個優選的實施方案中，所述試劑盒中包含的特異性寡核苷酸引物對由上遊引物和下遊 引物組成，所述上遊引物的鹼基序列為SEQ ID No. 1，所述下遊引物的鹼基序列為SEQ ID No. 2 ；所述試劑盒中包含的探針的鹼基序列為SEQ IDNo. 3，在探針的3』端連接有一個螢光 淬滅基團BHQ1，5』端連接有一個螢光報告基團FAM。在優選的實施方案中，所述試劑盒還 包括用於樣品DNA提取的試劑和用於PCR反應的試劑。在一個優選的實施方案中，所述試 劑盒的使用說明書中包括對用於快速鑑別梅花鹿茸真偽的PCR擴增的條件的描述。在一個 優選的實施方案中，所述試劑盒的說明書中給出的PCR擴增條件是95°C，IOmin ；95°C 15s ； 60°C，lmin，40 個循環。根據本發明的再一個實施方案，本發明提供本發明的特異性寡核苷酸引物對和探 針在鑑別梅花鹿茸真偽中的應用。在根據本發明的應用的優選實施方案中，所述特異性寡 核苷酸引物對由上遊引物和下遊引物組成，所述上遊引物的鹼基序列為SEQ ID No. 1，所述 下遊引物的鹼基序列為SEQID No. 2 ；所述探針的鹼基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3』端 連接有一個螢光淬滅基團BHQ1，5』端連接有一個螢光報告基團FAM。在另一個實施方案中， 本發明還提供本發明的試劑盒在鑑別梅花鹿茸真偽中的應用。優選地，在本發明的上述應 用中，所述試劑盒包括本發明的特異性寡核苷酸引物對和探針。本發明以梅花鹿茸的DNA為檢測基礎，根據不同鹿科物種中線粒體DNA D-環區序 列具有差異性的特點，克隆了梅花鹿線粒體DNA D-環區序列，根據這些序列設計引物及探 針，利用實時螢光PCR法鑑別梅花鹿茸的真偽。實時螢光定量PCR即在常規PCR方法的基礎上，加入螢光標記的探針或者螢光染 料，隨著PCR產物的積累，探針或染料發出的螢光信號增強，而螢光監測系統可接收到螢光 信號，即每產生一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形 成完全同步。因此可以實時監控整個PCR反應過程，並最終檢測出待測樣品的初始拷貝數， 從而可檢測待測梅花鹿茸成分。本發明的實時螢光PCR檢測方法採用完全閉管檢測，無需PCR後處理，避免了交叉 汙染和假陽性。本發明的方法巧妙地運用了 PCR技術的DNA高效擴增、核酸雜交的特異性和 螢光檢測技術的快速和敏感性，具有操作簡單、省時省力、結果可靠和準確靈敏等優點。使 用本發明的實時螢光PCR檢測方法，其簡單、快速、特異且靈敏的特點適合用於國內外市場上梅花鹿茸成分真偽的鑑別。


圖1是顯示待測樣品DNA提取效果的實時螢光PCR結果，其中使用鹿科動物通用引物對SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5及探針SEQ ID No. 6檢測，所述螢光曲線的樣品依次 為1.梅花鹿(1) ；2.梅花鹿⑵；3.梅花鹿(3) ；4.梅花鹿(4) ；5.梅花鹿(5) ；6.梅花鹿 (6) ；7.梅花鹿(7) ；8.梅花鹿(8) ；9.梅花鹿(9) ；10.梅花鹿(10) ；11.梅花鹿(11) ；12.梅 花鹿(12) ；13.梅花鹿(13) ； 14.梅花鹿(14) ；15.梅花鹿(15) ；16.梅花鹿(16) ；17.梅花 鹿(17) ；18.梅花鹿(18) ；19.梅花鹿(19) ；20.梅花鹿(20) ；21.梅花鹿(21) ；22.梅花鹿 (22) ；23.梅花鹿(23) ；24.馬鹿(1) ；25.馬鹿(2) ；26.馬鹿(3) ；27.馬鹿(4) ；28.馬鹿 (5) ；29.馬鹿(6) ；30.馬鹿(7) ；31.黃佔鹿(1) ；32.黃佔鹿(2) ；33.空白對照(ddH20)。圖2是顯示實時螢光PCR特異性檢測鹿茸的結果，其中使用特異性寡核苷酸引物 對SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2及探針SEQ ID No. 3檢測，其中螢光曲線的樣品依次為 1.梅花鹿(1) ；2.梅花鹿(2) ；3.梅花鹿(3) ；4.梅花鹿(4) ；5.梅花鹿(5) ；6.梅花鹿(6)； 7.梅花鹿(7) ；8.梅花鹿(8) ；9.梅花鹿(9) ；10.梅花鹿(10) ；11.梅花鹿(11) ；12.梅花 鹿(12) ；13.梅花鹿(13) ； 14.梅花鹿(14) ；15.梅花鹿(15) ；16.梅花鹿(16) ；17.梅花 鹿(17) ；18.梅花鹿(18) ；19.梅花鹿(19) ；20.梅花鹿(20) ；21.梅花鹿(21) ；22.梅花鹿 (22) ；23.梅花鹿(23) ；24.馬鹿(1) ；25.馬鹿(2) ；26.馬鹿(3) ；27.馬鹿(4) ；28.馬鹿 (5) ；29.馬鹿(6) ；30.馬鹿(7) ；31.黃佔鹿(1) ；32.黃佔鹿(2) ；33.空白對照(ddH20)。圖3是以梅花鹿為例，鑑別梅花鹿真偽的特異性引物和探針組合的靈敏度的結 果，其中1-7為進行實時螢光PCR擴增的DNA溶液的濃度，依次為IOng/μ L、lng/μ L、 IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、0. lpg/ μ L 以及空白對照，重複 3 次。圖4是以梅花鹿、馬鹿為例，確定梅花鹿特異性引物和探針組合的相對檢測限，其 中1-6為用馬鹿DNA將梅花鹿DNA以10倍稀釋，使其PCR反應體系中梅花鹿DNA含量分別 為10ng、lng、0. lng、lOOpg、10pg、lpg，重複三次，然後進行檢測的結果。圖5是市售鹿茸樣品檢測結果，其中螢光曲線1為梅花鹿茸陽性對照品、螢光曲線 2-17依次為市售梅花鹿茸樣品(1)_(16)、螢光曲線18-38依次為市售馬鹿茸樣品(1)-(20) 及空白對照(無菌水)。
具體實施例方式通過實施例的方式對本發明作進一步的說明，但是本發明並不僅僅局限於以下實 施例。實施例1本發明的發明人首次通過PCR克隆並測序了梅花鹿的線粒體DNA D-環區序列。本實施例為通過PCR克隆測序獲得的梅花鹿線粒體DNA D-環區序列。根據線粒體DNA D-環區序列在不同鹿科動物中具有差異性的特點，設計上下遊 引物擴增梅花鹿線粒體DNA D-環區序列。按照Wizard GelExtraction Kit (Promega，美 國)的操作說明對梅花鹿PCR產物進行純化、回收。按TaKaRa pMD19_T Vector試劑盒 (TaKaRa，日本)的說明書將純化產物與pMD19_T Vector連接，連接體系10 μ L，其反應組分為:pMD19-TVector 1 μ L、PCR 產物 2 μ L、ddH20 2 μ L、Solution I 5 μ L,同時設置陽性 和陰性對照。將連接體系置於室溫(22-37°C)反應30min，反應結束後，立即置於冰上。加 連接產物於50 μ LTOP感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42°C準確熱激90s，立即置於冰 上211^11，然後加入80(^1^已滅過菌的腦心浸液，37°C、200r/min振蕩培養lh。5000r/min 低速離心lmin，棄600 μ L上清，將沉澱混勻，取100 μ L混合液塗於Amp+、X_Gal和IPTG處 理的營養瓊脂平板上，37°C過夜培養後置於4°C冰箱中4h。挑取單菌落白斑，在含有終濃度 200 μ g/mL的Amp的腦心浸液中在37°C、200r/min振蕩過夜培養。(1)陽性克隆鑑定挑取單個白色克隆，進行菌落PCR反應，體系為25yL，其組份 為反應IOXBuffer 2. 5μ L.dNTPs 1 μ L、上下遊引物各0. 5 μ L、Taq酶0. 2 μ L，挑取單菌 落作為模板，加水補至25 μ L。反應程序為 94°C 5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，40個 循環。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳鑑定。(2)測序確定陽性克隆後，挑取該菌落，在含有終濃度200 μ g/mL Amp的5 μ L腦 心浸液中在37°C、200r/min振蕩過夜培養。取ImL菌液送生物公司進行測序鑑定。PCR克隆測序得到的梅花鹿的線粒體DNA D-環區序列如下AGACTCAAGG AAGAAGCCAT AGCCCCACTA TCAACACCCAAAGCTGAAGT TCTATTTAAA CTATTCCCTG ACGCTTATTAATATAGTTCC ATAAAAATCA AGAACTTTAT CAGTATTAAATTTCCAAAAA ATTTTAATAT TTTAATACAG CTTTCTACTCAACATCCAAT TTACATTTTA TGTCCTACTA ATTACACAACAAAGCACGTG ATATAACCTT ATGTGTTTGT AGTACATAAAATTAATGCAT TAAGGCACAC ATGTACAATG GTACATAAAATCGGTGTATA GGACATATTA TGCATAATAG TAATAAATTAAAGTATTAG GACATACTAT GTATAATAGT ACATTATATTATATGCCCCA TGCATAAAGC CTGGTTGCAA(SEQ ID No. 7)。實施例2本實施例為通過使用通用引物對及探針測試樣品總DNA的提取質量。通過檢測線粒體DNA D-環區序列，可以測試樣品總DNA的提取質量。Taqman熒 光探針法=TaqMan技術是一種對單管PCR產物進行實時螢光定量檢測的技術，在普通PCR 擴增系統中，加入一個與靶基因序列特異互補的雙螢光標記探針，利用螢光信號積累實時 監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析。定量步驟①確定CT值 (C表示循環數(Cycle)，T表示螢光域值(Threshold)，即每個反應管內的螢光信號到達設 定的域值時所經歷的循環數；②利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。獲得未知樣品的 CT值後，從標準曲線計算出該樣品的起始拷貝數。每個模板的CT值與該模板的起始拷貝 數的對數存在線性關係，即起始拷貝數越多，CT值越小。反應體系為=Mastermix 12. 5c ；探 針(10 μ Μ)0· 5 μ L ；上、下遊引物(10 μ Μ)各0. 5 μ L ；模板DNA 5 μ L ；力口 ddH20至總體積為 25 μ L0 反應程序為 95°C IOmin ；95°C 15s ；60°C lmin，40 個循環。本實施例中所使用的用於測試梅花鹿茸總DNA提取質量的通用引物對由上遊引 物和下遊引物組成，所述上遊引物的鹼基序列為SEQ ID No. 4，所述下遊引物的鹼基序列為 SEQ ID No. 5 ；所使用的探針的鹼基序列為SEQ ID No. 6，在探針的3』端連接有一個螢光淬滅基團BHQ2，5』端連接有一個螢光報告基團TAMRA。在本實施例中，檢測了 23份梅花鹿樣本、7份馬鹿樣本、2份點鹿樣本。所使用的檢測主要儀器微量移液器(10μ L、100 μ L、1000 μ L Eppendorf)、螢光定量 PCR 儀(ABI 7700 Applied Biosystems, USA))、高速臺式離心機(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京六一儀器廠)等檢測主要試劑氯仿、異丙醇分別購於北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB, 1. 4mol/L NaCl，0. lmol/L Tris、0. 02mol/L Na2-EDTA)、CTAB 沉澱液(5g/LCTAB，0. 04mol/L NaCl)、 1. 2mol/L NaCl 均為本實驗自行配製；Fast Start Universal Probe MasterMix (Rox)購於 羅氏公司；引物及探針由上海奧科生物科技有限公司合成等。檢測主要步驟IDNA 提取待測鹿茸樣品為23份梅花鹿茸、7份馬鹿茸、2份點鹿茸。稱取0. Ig鹿茸粉末至一潔淨2. OmL離心管中，加入1. 5mLCTAB裂解液，65°C 2h，間 期不斷混勻幾次；8000rpm 15min，取ImL上清液至1隻潔淨2. OmL離心管中，加入700 μ L 氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin,分別取650 μ L上清液至潔淨2. OmL離心管中，加入 1300 μ L CTAB沉澱液，劇烈混勻30s，室溫靜置Ih ； 14500rpm 20min，棄上清液，加入350 μ L 1. 2Μ NaCl，劇烈振蕩30s,再加入350 μ L氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin ；分別取上 清液320 μ L，加入0. 8倍體積異丙醇，混勻後，-200C lh, 14500rpm 20min,棄上清液，加入 500 μ L 70%乙醇，混勻後，14500rpm 20min，棄上清液，晾至風乾，加入IOOyL ddH20溶解， 4°C儲存備用。2實時螢光PCR檢測所用引物和探針引物序列為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5，探針序列為SEQ ID No. 6，3，端連接有 一個螢光淬滅基團BHQ2，5』端連接有一個螢光報告基團TAMRA。3.實時螢光PCR反應體系Fast Start Universal PCR Master Mix 12. 5μ L探針(10μΜ)0·5μ L上遊引物(10μΜ)0·5μ L下遊引物(10μΜ)0·5μ L模板 DNA 5μ L加ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測均設立相應的空白對照(用配製反應體系的超純水代替DNA模 板，檢測試劑是否受到汙染)；4實時螢光PCR反應參
95 0C IOmin
95 0C 15s
60 °C Imin
40個循環。
注不同儀器應將PCR各試劑及反應參數做適當調整。如圖1所示，用鹿科動物通用引物擴增待測樣品的DNA時均能在基線以上出現熒 光擴增曲線，表明所有待測樣品DNA提取成功。實施例3本實施例通過如下試驗對梅花鹿的引物對和探針進行了特異性和靈敏度驗證。通過檢測線粒體DNA D-環區序列，可以確定梅花鹿引物和探針組合的特異性和 檢測靈敏度。反應體系為Fast Start Universal Probe MasterMix (Rox) 12. 5 μ L ；探 針(10 μ Μ) 0. 5 μ L ；上、下遊引物(10 μ Μ)各0. 5 μ L ；模板DNA 5 μ L ；力口 ddH20至總體積為 25 μ L0 反應程序為 95°C IOmin ；95°C 15s ；60°C lmin，40 個循環。所使用鑑別梅花鹿茸真偽的弓I物及探針序列為引物序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，探針序列為SEQ ID No. 3，3，端連接有 一個螢光淬滅基團BHQ1，5』端連接有一個螢光報告基團FAM。使用本發明的引物對和探針的組合，在樣品量極少的情況下，相對於其他引物對 仍能特異、靈敏地擴增出目的片段。所使用的檢測主要儀器微量移液器(10μ L、100 μ L、1000 μ L Eppendorf)、螢光定量 PCR 儀(ABI7700 Applied Biosystems, USA))、高速臺式離心機(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京六一儀器廠)等檢測主要試劑氯仿、異丙醇分別購於北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB, 1. 4mol/L NaCl，0. lmol/L Tris、0. 02mol/L Na2-EDTA)、CTAB 沉澱液(5g/LCTAB，0. 04mol/L NaCl)、 1. 2mol/L NaCl 均為本實驗自行配製；Fast Start Universal Probe MasterMix (Rox)購於 羅氏公司；引物及探針由上海奧科生物科技有限公司合成等。檢測主要步驟IDNA 提取檢測樣本(1) 23份梅花鹿茸、7份馬鹿茸、2份點鹿茸用於特異性分析；(2)以梅 花鹿為例，將提取的DNA溶液用無菌水分別稀釋為IOng/μ L、lng/μ L、100pg/μ L、10pg/ μ LUpg/μ L、0. lpg/μ L的濃度，用於分析引物和探針組合的絕對檢測限；(3)以梅花鹿、 馬鹿為例，用馬鹿DNA將梅花鹿DNA以10倍稀釋，使其PCR反應體系中梅花鹿DNA含量分 別為10ng、lng、0. lng、100pg、10pg、lpg，以確定梅花鹿特異性引物和探針組合的相對檢測 限。稱取0. Ig樣品粉末至一潔淨2. OmL離心管中，加入1. 5mLCTAB裂解液，65°C 2h，間 期不斷混勻幾次；8000rpm 15min，取ImL上清液至1隻潔淨2. OmL離心管中，加入700 μ L 氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin,分別取650 μ L上清液至潔淨2. OmL離心管中，加入 1300 μ L CTAB沉澱液，劇烈混勻30s，室溫靜置Ih ； 14500rpm 20min，棄上清液，加入350 μ L 1. 2Μ NaCl，劇烈振蕩30s,再加入350 μ L氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin ；分別取上 清液320 μ L，加入0. 8倍體積異丙醇，混勻後，-200C lh, 14500rpm 20min,棄上清液，加入 500 μ L 70%乙醇，混勻後，14500rpm 20min，棄上清液，晾至風乾，加入IOOyL ddH20溶解， 4°C儲存備用。
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2實時螢光PCR檢測所用引物和探針引物序列為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；探針序列為SEQ ID No. 3,3'端連接有一個螢光淬滅基團BHQ1，5』端連接有一個 螢光報告基團FAM。3實時螢光PCR反應體系Fast Start Universal Probe MasterMix(Rox)12. 5 μ L探針(10μΜ)0·5μ L上遊引物(10μΜ)0·5μ L下遊引物(10μΜ)0·5μ L模板 DNA 5μ L加ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測均設立相應的空白對照(用配製反應體系的超純水代替DNA模 板，檢測試劑是否受到汙染)；4實時螢光PCR反應參數95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin40個循環。注不同儀器應將PCR各試劑及反應參數做適當調整。如圖2所示，利用實時螢光PCR特異性檢測梅花鹿的線粒體DNA D-環區序列時， 23種梅花鹿樣品等均出現典型的擴增曲線，而其它樣品7份馬鹿、2份點鹿及空白對照 (ddH20)均未出現擴增曲線，充分說明本實驗設計的引物和探針對梅花鹿樣品表現較好的 特異性。為確定梅花鹿特異性引物和探針組合的絕對檢測限，以梅花鹿為例，將提取的DNA 溶液用無菌水分別稀釋為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、0. Ipg/ μ L 的濃度，分別按上述條件進行實時螢光PCR擴增，結果如圖3所示。梅花鹿DNA濃度為IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L時有特異性擴增曲線，而濃度降至lpg/ μ L以 下時，無特異性擴增曲線出現。實驗結果表明建立的實時螢光PCR檢測方法能夠檢出梅花 鹿成分的含量為lpg/yL。以梅花鹿、馬鹿為例，用馬鹿DNA將梅花鹿DNA以10倍稀釋，使其PCR反應體系中 梅花鹿DNA含量分別為10ng、lng、0. lng、100pg、10pg、lpg,分別按上述條件進行實時螢光 PCR擴增，以確定梅花鹿特異性引物和探針組合的相對檢測限(結果見圖4)。實驗結果說 明該方法檢測梅花鹿成分的相對檢測限為10pg。實施例4本發明的發明人通過如下試驗對市售鹿茸樣品進行了驗證。選取36種鹿茸樣品(樣品由本實驗室提供)，其中16種梅花鹿樣品、20種馬鹿樣 品，進行實時螢光PCR反應，以確定所建立的實時螢光PCR方法是否具有可行性。如圖5所示，利用實時螢光PCR檢測線粒體DNA D-環區序列時，梅花鹿陽性對照 品、16份市售梅花鹿茸樣品均在基線以上具有典型的螢光擴增曲線，而其他20份馬鹿茸樣品及空白對照擴增曲線均在基線位置，表明該方法能有效檢測出梅花鹿茸成分。
雖然已經對本發明的具體實施方案進行了描述，但是本領域技術人員應認識到， 在不偏離本發明的範圍或精神的前提下可以對本發明進行多種改變與修飾。因而，本發明 意欲涵蓋落在權利要求書及其同等物範圍內的所有這些改變與修飾。
權利要求
核酸，其鹼基序列如SEQ ID No.7所示。
2.用於實時螢光PCR方法鑑別梅花鹿茸真偽的特異性寡核苷酸引物對及探針，所述 引物對和探針基於權利要求1所述的核酸設計，其中所述引物對由上遊引物和下遊引物組 成，所述上遊引物的鹼基序列為SEQ ID No. 1，所述下遊引物的鹼基序列為SEQID No. 2，所 述探針的鹼基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3』端連接有一個螢光淬滅基團BHQ1，5』端連 接有一個螢光報告基團FAM。
3.用於實時螢光PCR方法鑑別梅花鹿茸真偽的試劑盒，所述試劑盒包括根據權利要求 2所述的特異性寡核苷酸引物對及探針。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，所述試劑盒進一步包含另外的通用引物對和探針， 所述另外的通用引物對由鹼基序列為SEQ ID No. 4的上遊引物和鹼基序列為SEQ ID No. 5 的下遊引物組成，所述探針的鹼基序列為SEQ ID No. 6，在探針的3』端連接有一個螢光淬滅 基團BHQ2，5』端連接有一個螢光報告基團TAMRA。
5.梅花鹿茸真偽鑑別的實時螢光PCR檢測方法，所述方法包括使用權利要求2所述的 特異性寡核苷酸引物對及探針或權利要求3所述的試劑盒。
6.根據權利要求5所述的實時螢光PCR檢測方法，還進一步包括提取鹿茸樣品總DNA 的步驟。
7.根據權利要求6所述的實時螢光PCR檢測方法，通過使用通用引物對及探針檢測樣 品DNA的提取質量，所述通用引物由鹼基序列為SEQ ID No. 4的上遊引物和鹼基序列為SEQ ID No. 5的下遊引物組成，所述探針的鹼基序列為SEQ ID No. 6，在探針的3』端連接有一個 螢光淬滅基團BHQ2，5』端連接有一個螢光報告基團TAMRA。
8.根據權利要求1所述的核酸在鑑別梅花鹿茸真偽中的應用。
9.權利要求2所述的特異性寡核苷酸引物對及探針在鑑別梅花鹿茸真偽中的應用。
10.權利要求3或4所述的試劑盒在鑑別梅花鹿茸真偽中的應用。
全文摘要
本發明涉及用於梅花鹿茸真偽鑑別的特異性寡核苷酸引物及探針。本發明還涉及用於梅花鹿茸真偽鑑別的實時螢光PCR檢測方法，所述方法包括使用本發明的特異性寡核苷酸引物及探針。本發明還涉及用於梅花鹿茸真偽鑑別的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括本發明的特異性寡核苷酸引物和探針。本發明還涉及本發明的特異性寡核苷酸引物及探針在鑑別梅花鹿茸真偽中的應用。本發明的PCR檢測方法，能夠簡單、快速、特異且靈敏地鑑別梅花鹿茸的真偽。
文檔編號C12N15/11GK101974524SQ20101055557
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者吳亞君, 林鳳俊, 鄧婷婷, 陳穎, 韓建勳, 黃文勝 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院