基於液滴微流控的鉑黑修飾電極生物傳感器的製備方法及其應用的製作方法

2023-05-28 08:28:36 2

基於液滴微流控的鉑黑修飾電極生物傳感器的製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種基於液滴微流控的鉑黑修飾電極電化學傳感器製備方法，及其在葡萄糖氧化酶反應動力學研究和酶抑制分析中的應用，屬於分析化學領域。本發明通過電沉積的方法製備鉑黑微電極，並將液滴濃度梯度生成和電化學檢測結合在微流控晶片中。連續測定液滴中酶反應產物的濃度，進行酶反應動力學研究和酶抑制分析。本發明利用了液滴微流控系統試樣消耗量低，檢測通量高的特點，又結合了修飾電極靈敏度高的優勢，與裸電極相比，檢測信號提高了10.2倍，對葡萄糖檢測的線性範圍在0.2~43.5μM，可用於構建新型的葡萄糖傳感器。本發明中的電化學傳感器還可用於重金屬離子抑制效率的分析，通過繪製抑制效率-濃度曲線，實現重金屬離子的檢測。
【專利說明】基於液滴微流控的鉑黑修飾電極生物傳感器的製備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基於液滴微流控的鉬黑修飾電極生物傳感器製備方法，及其在葡萄糖氧化酶活性檢測和酶抑制分析中的應用，屬於分析化學領域。
【背景技術】
[0002]液滴微流控是近年來在微流控晶片中發展起來的一種操縱微小體積液體的技術。液滴作為微反應器，將反應物和產物限制在一個狹小的空間內，能夠有效控制擴散；在流動的液滴內部存在著複雜的三維運動，能夠加速混合，提高反應速度；產物在液滴內部不斷的累積，在液滴轄制的小體積內可以達到很高的濃度，能夠提高檢測的靈敏度。因此，液滴系統正被廣泛應用於各種生化反應的研究中，包括反應動力學研究、高通量篩選、單細胞分析、材料合成等。
[0003]液滴分析技術對於液滴微流控的發展起到至關重要的作用。目前液滴微流控系統中常用的檢測方法主要有螢光，毛細管電泳，質譜和拉曼光譜等。這些分析技術操作相對較為複雜，並且需要較大體積或昂貴的儀器設備。電化學檢測具有靈敏度高，外部設備小等優點，非常符合微流控系統微型化集成化的要求。電化學檢測方法將電極作為傳感器，直接將液滴中的化學信號轉換為電信號。但是，由於兩相的複雜性，電化學檢測技術在液滴微流控系統中的應用還比較少。迄今為止，液滴微流控系統中，電化學檢測主要被用來監測反應動力學和研究液滴的流動行為。這些系統都一般都選用常規無修飾電極，由於液滴微小體積的限制，電極與待測物接觸面積較小，相應的檢測靈敏度受到限制。最近有科研工作者將高靈敏的修飾電極用於單細胞活性分析，用於有酶葡萄糖檢測，以及無酶葡萄糖檢測。但是，這些系統採用的都是較大體積的靜止液滴。因此，需要發展一種適合於小體積液滴連續在線分析的電化學傳感系統。
[0004]納米材料由於具有較好的生物兼容性和電化學催化活性，被廣泛的應用於微電極的修飾和傳感器的構建中。通過對電極表面進行物理或化學修飾可以有效提高其檢測性能和應用領域。在眾多的納米材料中，金屬納米顆粒是在生物傳感器的構建中應用最為廣泛的一種納米材料。鉬黑，是通過電沉積方法形成的納米鉬金屬層，具有良好的電催化能力和優越的生物兼容性，可以用於提高生物傳感器的靈敏度。

【發明內容】

[0005]針對現有液滴分析技術存在的不足，本發明提供一種高靈敏的基於鉬黑修飾電極的液滴電化學分析方法，目的是通過在微鉬電極上電鍍一層鉬黑，提高液滴微流控系統中電化學檢測的靈敏度，並基於此在液滴微流控系統中建立一種可用於酶反應動力學研究和酶抑制分析的生物電化學傳感器。
[0006]液滴微流控系統中鉬黑修飾電極的生物傳感器的製備及其在酶活性檢測中的應用，實現本發明的技術方案是:1.基於液滴微流控系統鉬黑修飾電極的生物傳感器的製備
a.裸鉬電極的配置及預處理:取長2cm,直徑100 μπι的鉬絲,纏繞在長5 cm,直徑100 μπι的銅絲上，並用導電膠固定，作為裸鉬電極；將該電極放入0.1 M的硫酸中以Ag/AgCl電極作為參比電極,鉬電極為對電極,在-0.2~1.45 V範圍內掃循環伏安進行活化，掃速為500 mv/s,掃描40圈，用去離子水洗淨；
b.鉬黑修飾微電極的製備:利用恆電位技術將鉬黑電沉積在上述處理好的裸鉬電極上，電沉積溶液為0.1 M KCl, 2 mM H2PtClf^Pl mMPb (Ac)2溶液，Pb (Ac)2作為晶體生長促進劑，沉積電位為-0.1 V,沉積時間為10 min ;將修飾後的電極在-0.2~1.45 V範圍內掃循環伏安進行活化，掃速為500 mv/s，掃描40圈，用去離子水洗淨，並儲存在去離子水中備用。
[0007]c.鉬黑修飾電極生物傳感器的製備:將由上述方法製備所得的鉬黑修飾電極與微流控晶片結合組裝。微流控晶片是一種結合了液滴濃度梯度生成和電化學檢測的晶片裝置，其是由具有上下兩層結構的微流控晶片組成，所用材質為聚二甲基矽氧烷(PDMS)。微流控晶片下層是平板基片，厚度約3 mm;上層是含有通道的蓋片，包括150Mm深，300Mffl寬的液流通道和IOOMm深，IOOMm寬的電極通道厚度約4 mm ;上下兩層基片相對封接，形成底層封閉的微通道網絡；最後將鉬黑修飾電極以及Ag/AgCl準參比電極插入電極微通道中，並用環氧膠固定。 [0008]2、本發明所述的生物傳感器的用途和應用方法包括有:
a.在葡萄糖氧化酶活性檢測上的應用:鉬黑修飾的微米級鉬絲電極作做為工作電極，Ag/AgCl電極作為準參比電極，在通道中引入葡萄糖氧化酶、葡萄糖和緩衝液，葡萄糖溶液的進樣時間為30 S，進樣量為750 nL,形成81個具有濃度梯度的液滴，液滴中葡萄糖的濃度範圍為0.2~57 μΜ ;液滴順序流過電極，記錄下電流-時間曲線，改變酶的濃度，得到不同濃度下葡萄糖氧化酶的反應動力學曲線；在葡萄糖濃度為0.2~43.5 μ M範圍內，得到電流與葡萄糖濃度的線性關係曲線，其線性相關係數R= 0.996，利用標準曲線法可以對葡萄糖進行分析檢測。
[0009]b..重金屬對酶抑制分析中的應用:在通道中引入濃度範圍在0.2~57 uM的重金屬離子Cu2+，Pb2+，Co2+與1.0 mg/L的葡萄糖氧化酶和I mM葡萄糖溶液反應，採用計時電流法檢測經重金屬離子抑制後酶反應產生的雙氧水的電化學信號。比較相同濃度下三種重金屬離子的抑制效率，利用標準曲線法可以對重金屬離子進行分析檢測。
[0010]與現有技術相比，本發明的優點和有益效果是:
本發明利用了電沉積方法製備的鉬黑修飾微電極作為液滴微流控系統中液滴檢測的傳感器，無需固定化酶，在溶液狀態下實現了對葡萄糖氧化酶反應動力學的監測以及酶活性的抑制分析，檢測通量高，試樣消耗量低，而且與裸鉬微電極相比，鉬黑修飾電極大大提高了分析檢測的靈敏度。
[0011]本發明中的生物傳感器是一種新型的基於液滴微流控系統的電化學傳感器，具有高通量、低消耗、靈敏度高、製備簡單等特點。本發明的測試方法具有良好的重現性和穩定性。本發明中的新型生物電化學傳感器表明了在液滴微流控系統中構建高靈敏電化學傳感器的可行性並且有利於拓展液滴微流控系統的應用範圍。【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1 A為本發明中含有lmg/L葡萄糖氧化酶，不含葡萄糖的NaAc-HAc緩衝溶液在裸鉬微電極(I)以及在鉬黑修飾微電極(3)上的循環伏安圖；以及含有lmg/L葡萄糖氧化酶和10μm葡萄糖的NaAc-HAc緩衝液在裸鉬微電極(2)以及在鉬黑修飾微電極(4)上的循環伏安圖。圖1 B為含有1.0 mg/L葡萄糖氧化酶和5 mM葡萄糖的液滴在裸鉬微電極和鉬黑修飾微電極上的電流響應信號。
[0013]圖2為本發明中的生物電化學傳感器在葡萄糖氧化酶濃度分別為0.1，0.5，1.0mg/L時，對濃度範圍在0.2~57 μ M的葡萄糖的反應動力學曲線。
[0014]圖3為本發明中的生物電化學傳感器在濃度範圍在0.2~57 μ M的重金屬離子對1.0 mg/L的葡萄糖氧化酶和I mM葡萄糖溶液的抑制曲線。
【具體實施方式】
[0015]現將本發明的具體實施例與實驗研究敘述於後。
[0016]實施:基於液滴微流控系統的鉬黑修飾電極的生物傳感器的製備
a.裸鉬電極的配置及預處理:取長2 cm,直徑100 μπι的鉬絲,纏繞在長5 cm,直徑100 μπι的銅絲上，並用導電膠固定，作為裸鉬電極；將該電極放入0.1 M的硫酸中以Ag/AgCl電極作為參比電極,鉬電極為對電極,在-0.2~1.45 V範圍內掃循環伏安進行活化，掃速為500 mv/s,掃描40圈，用去離子水洗淨。
[0017]b.鉬黑修飾微電極的製備:利用恆電位技術將鉬黑電沉積在上述處理好的裸鉬電極上，電沉積溶液為0.1 M KCl, 2 mM H2PtClf^Pl mMPb (Ac)2溶液，Pb (Ac)2作為晶體生長促進劑，沉積電位為-0.1 V,沉積時間為10 min ;將修飾後的電極在-0.2~1.45 V範圍內掃循環伏安進行活化，掃速為500 mv/s，掃描40圈，用去離子水洗淨，並儲存在去尚子水中備用。
[0018]c.鉬黑修飾電極生物傳感器的製備:將由上述方法製備所得的鉬黑修飾點點與微流控晶片結合組裝。微流控晶片結構為具有上下兩層結構的微流控晶片，微流控晶片下層是平板基片，上層是含有微通道和電極通道的蓋片；上下兩層基片相對封接，形成底層封閉的微通道網絡；將鉬黑修飾電極以及Ag/AgCl準參比電極插入電極微通道中，並用環氧膠固定。
[0019]鉬黑修飾微電極與裸鉬電極的對比如圖1所示。圖1 A為本發明中含有lmg/L葡萄糖氧化酶，不含葡萄糖的NaAc-HAc緩衝溶液在裸鉬微電極(a)以及在鉬黑修飾微電極(C)上的循環伏安圖；以及含有lmg/L葡萄糖氧化酶和ΙΟμΜ葡萄糖的NaAc-HAc緩衝液在裸鉬微電極(b)以及在鉬黑修飾微電極(d)上的循環伏安圖。圖1 B為含有1.0 mg/L葡萄糖氧化酶和5 mM葡萄糖的液滴在裸鉬微電極和鉬黑修飾微電極上的電流響應信號。
[0020]有關的各種實驗研究:
實驗研究例採用Pump 11-Elite (Harvard apparatus公司，美國)微量注射泵驅動液體流動；採用CHI 852C (辰華，中國)電化學工作站進行電化學檢測。
[0021]實驗一:酶活性檢測的流程
在微量注射器中注入1.0 g/mL葡萄糖氧化酶和0.1 M醋酸-醋酸鈉緩衝液(pH 4.4)，在缺口管中注入I M葡萄糖和0.1 M醋酸-醋酸鈉緩衝液(pH 4.4)，將加工了鉬黑修飾電極的微流控晶片與一個拉尖的內徑為250 Mffl的毛細管相連，驅動微量注射泵，用毛細管取樣探針順序將葡萄糖和緩衝液引入微流控晶片的樣品稀釋通道中，葡萄糖沿著通道軸向形成一定的濃度梯度，與分支通道的酶溶液和緩衝液混合，混合後的溶液被油相分割成一連串不同濃度的液滴，液滴體積約為9 nL。
[0022]實驗二:酶抑制分析的流程
在微量注射器中注入1.0 g/mL葡萄糖氧化酶和I M葡萄糖，在缺口管中注入I mM重金屬離子抑制劑和0.1 M醋酸-醋酸鈉緩衝液(pH 4.4)，將加工了鉬黑修飾電極的微流控晶片與一個拉尖的內徑為250Mm的毛細管相連，驅動微量注射泵，用毛細管取樣探針順序將重金屬離子抑制劑和緩衝液引入微流控晶片的樣品稀釋通道中，抑制劑沿著通道軸向形成一定的濃度梯度，與分支通道的酶和葡萄糖溶液混合，混合後的溶液被油相分割成一個個不同濃度的液滴，液滴體積約為9 nL。
[0023]實驗三:不同濃度酶反應動力學研究
分別引入0.1，0.5，1.0 mg/L的葡萄糖氧化酶，分別與濃度範圍在0.2~57 mM的葡萄糖反應，採用計時電流法檢測酶反應產生的雙氧水的電化學信號。
[0024]結果如圖2所示，對於相同濃度的酶，隨著葡萄糖濃度的增加，電流強度先是成線性增加，隨後逐漸趨於平緩。這種趨勢符合典型的酶反應動力學曲線。比較不同濃度的酶反應曲線，可以看出酶濃度會影響該傳感器對葡萄糖的線性響應範圍。在酶濃度為1.0 mg/L時，線性範圍最寬，為0.2^43.5禮。正常人血中的葡萄糖濃度在4.0-6.0禮，糖尿病人的一般在8.0 mM或更高，因此，本發明中傳感器對葡萄糖的寬線性範圍證明其可作為新型葡萄糖傳感器，有臨床應用的潛能。
[0025]實驗四:不同重金屬離子的抑制研究
引入1.0 mg/L的葡萄糖氧化酶和I mM葡萄糖溶液，分別與濃度範圍在0.2~57μΜ的重金屬離子Cu2+，Pb2+，Co2+反應，採用計時電流法檢測經重金屬離子抑制後酶反應產生的雙氧水的電化學信號。
[0026]結果如圖3所示，隨著重金屬離子濃度的增加，抑制效率逐漸增加。這種趨勢符合典型的酶抑制反應曲線。比較不同抑制劑的抑制曲線，可以看出在相同濃度下Cu2+抑制效率最高，Pb2+次之，Co2+最低。
[0027]實驗五:電化學生物傳感器的重現性和穩定性
連續檢測10個含有0.4 mg/L葡萄糖氧化酶和0.4 mM葡萄糖的液滴，得到的電流信號的RSD為2.65%。選擇三個鉬黑修飾電極，檢測含有0.4 mg/L葡萄糖氧化酶和0.4 mM葡萄糖的液滴，得到的電流信號的RSD為8.27%。將鉬黑修飾電極放在去離子水中4° C冰箱內保存一周，電化學信號還保留原來的90.65%。
[0028]以上結果表明，本生物傳感器試樣消耗量少，檢測通量高，有很高的靈敏度和寬的線性範圍，較好的重現性和穩定性。同樣的原理可以推廣到其他酶反應動力學，酶反應底物或抑制劑的檢測中，應用前景廣泛。
【權利要求】
1.一種基於液滴微流控的鉬黑修飾電極生物傳感器的製備方法，其特徵在於具有以下的步驟: a.裸鉬電極的配置及預處理:取長2cm,直徑100 μ m的鉬絲,纏繞在長5 cm,直徑100 μπι的銅絲上，並用導電膠固定，作為裸鉬電極；將該電極放入0.1 M的硫酸中以Ag/AgCl電極作為參比電極,鉬電極為對電極,在-0.2?1.45V範圍內掃循環伏安進行活化，掃速為500 mv/s,掃描40圈，用去離子水洗淨； b.鉬黑修飾微電極的製備:利用恆電位技術將鉬黑電沉積在上述處理好的裸鉬電極上，電沉積溶液為0.1 M KCl, 2 mM H2PtCl6和I mM Pb (Ac)2溶液，Pb (Ac)2作為晶體生長促進劑，沉積電位為-0.1 V,沉積時間為10 min ;將修飾後的電極在-0.2?1.45V範圍內掃循環伏安進行活化，掃速為500 mv/s，掃描40圈，用去離子水洗淨，並儲存在去離子水中備用； c.鉬黑修飾電極生物傳感器的製備:將由上述方法製備所得的鉬黑修飾電極與微流控晶片結合組裝。
2.微流控晶片是一種結合了液滴濃度梯度生成和電化學檢測的晶片裝置，其是由具有上下兩層結構的微流控晶片組成，所用材質為聚二甲基矽氧烷(PDMS)。
3.微流控晶片下層是平板基片，厚度約3mm;上層是含有通道的蓋片，包括150Mm深，300Mm寬的液流通道和IOOMm深，100 Mm寬的電極通道厚度約4 mm ;上下兩層基片相對封接，形成底層封閉的微通道網絡；最後將鉬黑修飾電極以及Ag/AgCl準參比電極插入電極微通道中，並用環氧膠固定。
4.權利要求1所述的生物傳感器的用途或應用方法包括有: a.在葡萄糖氧化酶活性檢測上的應用:鉬黑修飾的微米級鉬絲電極作做為工作電極，Ag/AgCl電極作為準參比電極，在通道中引入葡萄糖氧化酶、葡萄糖和緩衝液，葡萄糖溶液的進樣時間為30 S，進樣量為750 nL,形成81個具有濃度梯度的液滴，液滴中葡萄糖的濃度範圍為0.2?57 μ M ;液滴順序流過電極，記錄下電流-時間曲線，改變酶的濃度，得到不同濃度下葡萄糖氧化酶的反應動力學曲線；在葡萄糖濃度為0.2?43.5 μΜ範圍內，得到電流與葡萄糖濃度的線性關係曲線，其線性相關係數r = 0.996，利用標準曲線法可以對葡萄糖進行分析檢測。
5.b.重金屬對酶抑制分析中的應用:在通道中引入濃度範圍在0.2?57 uM的重金屬離子Cu2+，Pb2+，Co2+與1.0 mg/L的葡萄糖氧化酶和I mM葡萄糖溶液反應，採用計時電流法檢測經重金屬離子抑制後酶反應產生的雙氧水的電化學信號；比較相同濃度下三種重金屬離子的抑制效率；利用標準曲線法可以對重金屬離子進行分析檢測。
【文檔編號】G01N27/26GK103743801SQ201410001051
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】丁亞平, 古淑青, 陸優蘭, 李麗 申請人:上海大學