進料混合裝置及其用途的製作方法
2023-07-01 09:48:06
專利名稱：進料混合裝置及其用途的製作方法
進料混合裝置及其用途
在本文中報導了一種進料混合裝置，其允許將具有非生理性PH值的兩種或兩種以上進料溶液同時進料給培養基，藉此在加入培養基之前，在進料混合裝置內將總進料溶液的PH值調整至例如，生理性pH值。
發明背景
為了在哺乳動物細胞的培養中增加產物產量或者培養時間，將進料溶液加入到培養基，以使必需的培養基組分的濃度維持在臨界水平或者臨界水平之上。
具有與培養基不同物理性質的水溶液的進料將影響培養基的物理參數，如滲透性或PH值。由於不同組分差的溶解度或者所需的穩定性，所以有時不得不將進料溶液的pH值改變成非生理性值。
Luan, Y.T.，等人報·道了在培養中延長雜交瘤的壽命，並提高單克隆抗體的產量的策略(Biotechnol.Lett.9 (1987) 691-696)。Dempsey, J.，等人報導了用於表達人抗體和穀氨醯胺合成酶的NSO細胞系的改進的發酵工藝(Biotechnol.Prog.19 (2003)175-178)。Bibila, T.A.,等人報導了使用培養基濃縮物進行的單克隆抗體方法的研發(Biotechnol.Prog.10 (1994) 87-96)。
在W02008/013809中報導了細胞培養方法。在US2006/0003448中報導了乾粉細胞和細胞培養試劑以及其產生的方法。在US5，081，036中報導了用於細胞培養的方法和設備。在US5，681，748中報導了培養基濃縮技術。在US6，924，124中報導了用於細胞培養的進料策略。
在W02009/132616中報導了供應系統。在W02010/045168中報導了使用商業規模的生物反應器生產乙醇和糖的方法和設備。在US2003/0092652中報導了用於核酸分子的保護性單瓶製劑(protected one-vial formulation)、通過線內混合製備用於核酸分子的保護性單瓶製劑的方法，以及相關的產品和方法。
發明概述
使用如在本文中所報導的進料混合裝置，可以例如在具有使組分具有好溶解度和/或好穩定性的PH值的溶液中提供進料組分，從而pH值可以不同於培養基的pH值，即溶液具有小於PH6.5或者大於pH7.5的彼此相互獨立的pH值。與在例如進料溶液的pH值被限制在培養基的PH值附近很小範圍的培養相比較，這允許更靈活地進行培養。
如在本文中所報導的一方面是用於將各自具有非生理性pH值的至少兩種溶液加入細胞培養容器的裝置，所述裝置包含在將溶液加入到細胞培養容器之前，用於混合溶液的小室。
在一個實施方案中，用於混合溶液的小室的體積與培養容器中培養基的體積的比例為0.8ml/l至L2ml/1。在一個實施方案中，該比例為0.9ml/l至1.lml/1。在一個實施方案中，該比例為約lml/1。在一個實施方案中，該比例為0.95ml/l。在一個實施方案中，培養基的體積是在起始培養時，培養容器中液體的體積。
在一個實施方案中，各自具有非生理性pH值的至少兩種溶液，至少一種是酸性溶液並且至少一種是鹼性溶液。在一個實施方案中，各自具有非生理性pH值的至少兩種溶液具有相互獨立的小於pH6.5或者大於pH7.5的pH值。在一個實施方案中，各自具有非生理性pH的至少兩種溶液具有相互獨立的pHO至pH6.49或者pH7.51至pH14的pH值。在一個實施方案中，酸性和鹼性溶液的pH值與培養基的pH值相差至少0.5個pH單位。在一個實施方案中，酸性溶液具有PH6.5或更低的pH值。在一個實施方案中，酸性溶液具有PH4.0或更低的pH值。在一個實施方案中，鹼性溶液具有pH8.0或更高的pH值。在一個實施方案中，鹼性溶液具有10.0或更高的pH值。在一個實施方案中，將該裝置用於加入具有非生理性pH值的兩種至四種單獨的溶液，其中任選地至少一種是酸性溶液，並且至少一種是鹼性溶液。在一個實施方案中，每種溶液都是包含選自胺基酸、糖、維生素、微量元素、乳酸和生長因子的至少一種化合物的進料溶液。在一個實施方案中，用於混合溶液的小室與培養容器是分離的，並且所述小室包含進入到培養容器的內部的出口。在一個實施方案中，小室在培養容器的外部或者在培養容器的內部。在一個實施方案中，小室具有0.1ml至50，OOOml的體積。在一個實施方案中，小室具有0.25ml至30，OOOml 的體積。在一個實施方案中，小室具有0.5ml至1，OOOml的體積。在一個實施方案中，小室具有約1.15ml、或者約8ml、或者約80ml、或者約200ml、或者約400ml、或者約800ml、或者約1.61、或者約41、或者約81、或者約161、或者約401的體積。在一個實施方案中，在加入到培養容器之前立即混合。在一個實施方案中，用於混合溶液的小室包含用於每種溶液的各個連接器的入□。在一個實施方案中，該裝置是可滅菌的。如在本文中所報導的另一方面是如在本文中所報導的裝置在細胞的補料分批或者連續培養中的用途。如在本文中所報導的又一方面是包含如在本文中所報導的裝置的培養容器。如在本文中所報導的一個方面是用於產生多肽的方法，其包括以下步驟:-在包含如在本文中所報導的裝置的培養容器中以補料分批或連續培養的方式培養包含編碼多肽的核酸的細胞，由此在培養期間加入至少一種酸性進料溶液和至少一種鹼性進料溶液，和-從培養基或細胞中回收多肽，從而產生多肽。在一個實施方案中，當加入到培養容器中時，混合的進料溶液具有pH4.5至pH9.5的pH值。在一個實施方案中，當加入到培養容器中時，混合的進料溶液具有pH6.5至pH7.5的pH值。在一個實施方案中，培養容器具有約21、或者101、或者201、或者1001、或者2501、或者 5001、或者 I, 0001、或者 2，0001、或者 5，0001、或者 10，0001、或者 20，0001、或者50，0001的體積。在一個實施方案中，培養基的體積為約1.21、或者約81、或者約161、或者約801、或者約2001、或者約4001、或者約8001、或者約1，6001、或者約4，0001、或者約8，0001、或者約 16，0001、或者約 40，0001。
在一個實施方案中，如在本文中所報導的裝置在室溫運行。
如在本文中所報導的又一方面是用於獲得具有減少的G(O)糖形和/或增加的Gd)糖形的多肽的方法，其包括以下步驟:
-在包含如在本文中所報導的裝置的培養容器中以補料分批或連續培養的方式培養包含編碼多肽的核酸的細胞，由此在培養期間加入至少一種酸性進料溶液和至少一種鹼性進料溶液，和
-從培養基或細胞中回收多肽，從而獲得具有減少的G(O)糖形和/或增加的G(I)糖形的多肽。
其中當加入到培養容器中時，混合的進料溶液具有pH4.0至pH6.0的pH值。
在一個實施方案中，多肽是抗體或者Fe-融合的多肽。
發明詳述
廣泛地用於生產治療性多肽或生物質的方式是補料分批發酵。在補料分批發酵中，哺乳動物細胞培養物的細胞密度通常超過100*105個細胞/ml，由於某些物質或者物質種類的低溶解度和/或受損的穩定性，導致了在提供足夠量的所需培養物質中的挑戰。
因此，通常的方法是使用具有非生理性pH值的進料溶液，來溶解或者穩定所需量的這些物質。例如，由於酪氨酸的低溶解度，所以通過液體進料溶液很難在PH7左右的pH值足夠地供應胺基酸酪氨酸。然而，·在該情況下，高的非生理性pH值增加了溶解度，這使得進料策略匹配了在補料分批方法中總體的酪氨酸消耗與非生理性PH值的進料溶液。特別地，連續進料策略需要穩定的進料溶液。因此，進料組分的貯藏期限必須至少超過進料時間。
此外，具有非生理性pH值，即鹼性或酸性pH值的進料溶液的加入觸發了培養裝置的pH控制機制的響應。這導致了酸或鹼增加的和不期望的加入，以補償由具有非生理性pH值的進料溶液的加入誘導的PH改變。
為了避免具有非生理性pH的進料溶液，例如具有高或低pH值的那些進料溶液的使用產生的影響，可以使用如在本文中所報導的進料混合裝置，其能恰好在加入到培養容器中之前連續混合至少兩種進料溶液。通過使用如在本文中所報導的進料混合裝置，可以在進料組分具有好的溶解度和/或好的穩定性的pH值溶解進料組分，由此可以使該pH值明顯不同於培養基的PH值，即不同於生理性pH值。因為現在可以在加入到培養基和細胞懸浮液之前直接調整PH值，這允許進料溶液具有更靈活的pH值。
如在本文中所報導的裝置是用於細胞培養(例如補料分批培養或者連續培養)的進料混合裝置，在所述細胞培養期間必須加入化合物。使用如在本文中所報導的進料混合裝置，培養可以在至少一個額外的自由度下進行，因此更具靈活性。使用如在本文中所報導的進料混合裝置，有可能使用非生理性PH值和/或高化合物濃度的進料溶液。例如為穩定pH敏感的進料組分，需要非生理性pH值。在加入到培養容器，並因此加入到培養基中之前，可以調整任何PH值。這允許以非連續或者連續的進料方法加入確定量的化合物。例如，通過加入確定量的離子，可以調整預定的滲透性。
有可能通過使用如在本文中所報導的裝置獲得的進料溶液的pH值的變化性，可以使用具有任意PH值(即鹼性、中性或酸性溶液)和具有任意濃度的各個組分的進料溶液。與不使用如在本文中所報導的裝置的常規進料策略相比較，也有可能在加入的進料中運用pH梯度，藉此也可以加入基本上相同量的物質。因此，甚至可以使用具有這樣的組分的進料溶液，所述組分由於其低溶解度或受損的穩定性，必須以極端的鹼性或酸性，即非生理性PH值提供。離開進料混合裝置並被加入到培養基中的混合進料溶液的pH值取決於各個進料的體積混合比和在混合室內的停留時間，因此所述PH值取決於各個進料溶液的體積流量。在一個實施方案中，經進料混合裝置流入到培養容器的總體積為I至1.5g/h/l。在一個實施方案中，體積流量為1.15g/h/l至1.35g/h/l。在一個實施方案中，體積流量為約1.25g/h/l。單位g/h/1表不進料的質量/培養時間/培養體積。在一個實施方案中，培養體積為在起始培養時培養容器中流體的體積。通過將如在本文中所報導的裝置用於混合進料溶液，培養的細胞的生活力可以在預定水平以上維持更長的時期，因此允許更長的總培養時間。同時，可以降低乳酸濃度和葡萄糖消耗。
圖1中顯示了細胞培養的pH值的一般進程。接種後(圖1，「1」)，培養的pH值降低並接近預定PH範圍的下緣(圖1，「2」)。這歸因於培養基中乳酸的的形成和二氧化碳的積累。通過加入鹼，使用的PH控制機制確保pH值維持在預定pH範圍的下緣。繼續加入鹼，直到細胞代謝改變，並且重新代謝培養基中的乳酸和/或去除積累的二氧化碳(圖1，「3」)。然後，PH值增加，直到達到預 定pH範圍的上緣(圖1，「4」)。通過加入酸，pH控制機制維持pH值在該上緣值。在例如不使用pH控制機制的情況下，鹼進料溶液可以使培養基的pH值維持在預定PH範圍的下緣之上。因此，通過使用如在本文中所報導的進料混合裝置來改變加入到培養基中的兩種或多種進料溶液的各個體積流速比，可以抵消培養容器中PH值的改變。因此，使用如在本文中所報導的裝置，可以分別廢棄或者可以減少PH控制機制或者至少使用其的時間(以及同樣地，酸和鹼的加入量)。通過使用具有各個加料速度的鹼性進料溶液和酸性進料溶液，以及如在本文中所報導的進料混合裝置，可以將組合的進料溶液的PH值調整至任意靶值。通過在培養過程中改變各個加料速度和/或進料溶液，可以在培養期間改變組合的進料溶液的PH值。因此，有可能依據培養的細胞的代謝，來改變和/或控制PH值。可以將組合進料溶液的可變pH值用於支持或替換用於調整培養PH值的其他方法。通過使用如在本文中所報導的進料混合裝置，可以連續組合兩種或多種進料溶液。進料溶液可以包含任一化合物。例如，可以在(高)非生理性PH值穩定的化合物如維生素。使用如在本文中所述的進料混合裝置，在加入到培養基中之前，將PH值調整至生理性範圍的PH值。因此，減少了進料化合物維持在穩定性受損的pH值的時間。通過使用一種或多種鹼性溶液和一種或多種酸性溶液，有可能進行可變的pH值調整。使用如在本文中所報導的裝置，通過調整進料溶液的速度和各個流速，可以在線控制培養基的pH值(圖1，「5」)。通過使用具有不同性質的進料溶液，有可能進行例如離子濃度、pH值、滲透性、化合物比例、粘度、表面張力、電導率、可溼性、電阻率和/或密度的時間依賴性調整。通過使用在線傳感器，有可能使用如在本文中所報導的裝置組合具有不同物理和/或化學性質的不同進料溶液。因此，可以根據預定計劃改變不同的參數。
通過使用如在本文中所報導的裝置，有可能將固體、分散體和幾乎不可混溶的化合物/溶液用作進料溶液。進料溶液的化學和/或物理性質可以是不同的。
通過使用如在本文中所報導的進料混合裝置，在培養期間可以施行所加入的混合進料溶液的PH梯度。
相互獨立的各個進料可以是分散體、乳劑或溶液。可以通過使用常規泵或者任意其他已知的機械或流動機械方法，將溶液運輸至進料混合裝置。如果進料不是真正的溶液，那麼例如可以通過使用機械運輸方法加入所述進料。
進料混合裝置的規模是可變的，因此，可以與任意類型和大小的培養裝置，例如與培養容器(攪拌罐)、研碎式反應器(chip reactor)或流管式反應器一起使用該裝置。
當使用如在本文中所報導的裝置時，儘管在加入到培養基中之前顯著改變了進料溶液的PH值，但在混合各個進料溶液時，在混合室中幾乎沒有沉澱形成。
與使用單一的鹼進料並且不使用如在本文中所報導的裝置的培養相比，通過使用如在本文中所報導的裝置，並因此將分離的進料調整至組合的(酸性)進料可以減少產生的多肽，特別是產生的免疫球蛋白的G(O)糖形。同樣地，與使用單一的鹼性進料並且不使用如在本文中所報導的裝置的培養相比，通過使用如在本文中所報導的裝置並將分離的進料調整至混合的酸性進料可以增加G(I)糖形。
通過調整細胞培養條件，可以改變在下遊加工前培養基中宿主細胞蛋白質的含量。這通過使用特定的進料溶液應當是·可能的。因此，使用包含具有確定的質子濃度，即確定PH值的pH經調整的進料溶液的經調整的進料策略，可以加入相同的或者至少相似量的進料組分，並且同時可以降低為了校正培養基的PH值所需要的鹼或酸的量，並且同時還可以降低培養上清液中宿主細胞蛋白質含量。
因此，在一個實施方案中，可以將如在本文中所報導的進料混合裝置用於降低細胞培養上清液中宿主細胞蛋白質含量。
提供了以下實施例和附圖，以幫助理解本發明，在所附權利要求中給出了本發明的真正的範圍。理解的是，在不背離本發明精神的情況下，可以對給出的方法進行修改。
附圖描述
圖1細胞培養的pH值的一般進程圖。
圖2存活的細胞密度的進程:空心:單一進料(進料I);實心:分離的進料(進料2和進料3);環形:具有氯化鉀；正方形:具有氯化鈉。
圖3生活力的進程:空心:單一進料(進料I);實心:分離的進料(進料2和進料3);環形:具有氯化鉀；正方形:具有氯化鈉。可以看出，通過使用如在本文中所報導的混合裝置，生活力在大於90%的值處保持更長。
圖4pH值的進程:空心:單一進料(進料I);實心:分離的進料(進料2和進料3)；環形:具有氯化鉀；正方形:具有氯化鈉。在進料開始(72小時後)前，進程都是類似的。
圖5葡萄糖消耗的進程:空心:單一進料(進料I);實心:分離的進料(進料2和進料3);環形:具有氯化鉀；正方形:具有氯化鈉。當使用如在本文中所報導的混合裝置時，葡萄糖消耗是降低的。
圖6乳酸形成的進程:空心:單一進料(進料I);實心:分離的進料(進料2和進料3);環形:具有氯化鉀；正方形:具有氯化鈉。當使用如在本文中所報導的混合裝置時，改善了乳酸形成和重新代謝的起始。圖7穀氨醯胺消耗的進程:空心:單一進料(進料I);實心:分離的進料(進料2和進料3);環形:具有氯化鉀；正方形:具有氯化鈉。圖8氨積累的進程:空心:單一進料(進料I);實心:分離的進料(進料2和進料3);環形:具有氯化鉀；正方形:具有氯化鈉。圖9酸性峰級分:左邊:使用如在本文中所報導的裝置；黑色右邊:沒有使用如在本文中所報導的裝置。圖10加入的鹼的所需量(培養14天後)對進料溶液的pH值的依賴性；環形:沒有使用如在本文中所報導的裝置；正方形:使用如在本文中所報導的裝置。圖11乳酸形成(培養14天後)對進料溶液的pH值的依賴性；環形:沒有使用如在本文中所報導的裝置；正方形:使用如在本文中所報導的裝置。圖12培養基中穀氨醯胺濃度(培養14天後)對進料溶液的pH值的依賴性；環形:沒有使用如在本文中所報導的裝置；正方形:使用如在本文中所報導的裝置。圖13培養基中的滲透性(培養14天後)對進料溶液的pH值的依賴性；環形:沒有使用如在本文中所報導的裝置；正方形:使用如在本文中所報導的裝置。圖14溶解的二氧化碳( 培養14天後)對進料溶液的pH值的依賴性；環形:沒有使用如在本文中所報導的裝置；正方形:使用如在本文中所報導的裝置。圖15存活細胞的密度(培養14天後)對進料溶液的pH值的依賴性；環形:沒有使用如在本文中所報導的裝置；正方形:使用如在本文中所報導的裝置。圖16G (0)級分對進料溶液的pH值的依賴性。圖17G (I)級分對進料溶液的pH值的依賴性。圖18+19如在本文中所報導的裝置的示例性圖。圖20宿主細胞蛋白質含量對進料溶液的pH值的依賴性。
實施例材料抗體在如在本文中所報導的方法和實施例中使用的示例性抗體是如在W02010/034443中所報導的抗-1L17抗體(將其併入本文作為參考)。進料溶液進料1:該溶液包含pH值約9.5的全部進料組分(胺基酸和丙酮酸)。進料2:該溶液包含雙倍濃度的在約pHl.5的酸性pH值的可溶的組分。進料3:該溶液包含雙倍濃度的在約pHIO的鹼性pH值的可溶的組分。在該設置中，確保加入的進料I的濃度和組分的數目以及體積與進料2和進料3的組合後一樣。進料I的PH值為約pH9.5，並且組合的進料2和3的pH值為約pH7.2。進料混合裝置尺寸用於混合進料溶液的小室的體積:1.146ml使用21-培養容器開始培養時，培養基的體積:1.21經進料混合裝置的進料流量:36g/d實施例1
用在相同的搖瓶中預培養的接種溶液平行接種4個21-培養容器(SartoriusBiostat B-DQJ Quad, Sartorius, Goettingen,德國)。兩個培養容器包含如在本文中所報導的裝置，而另外兩個培養容器包含具有Luer fitting但沒有混合室的兩個單獨的常規進料裝置。
在整個培養期間，全部培養都以恆定的通氣速率、恆定的溫度和恆定的攪拌速度進行。基於起始工作體積計算全部加料速度，並以每天每次發酵起始體積的進料體積給出。
72小時培養時間後，用進料2和進料3以具有相同體積流量的連續進料開始在包含進料混合裝置的培養容器中的進料。在進料混合裝置中合併進料，並在混合後加入到培養基中。
72小時培養時間後，用進料I以兩倍於相應的用進料混合裝置培養的體積流量的體積流量開始在包含常規進料裝置的培養容器中的進料。
因此，在全部四個培養中全部進料組分的加入體積和加入量都是相同的(參見表I和2)。
表權利要求
1.用於將各自具有非生理性PH值的至少兩種進料溶液加入到細胞培養容器中的裝置，所述裝置包含用於進料溶液的單獨的入口、用於混合進料溶液的小室和用於將混合的進料溶液加入到細胞培養容器中的單個出口，由此用於混合進料溶液的小室的體積與培養容器中培養基的體積的比例為0.8ml/l至1.2ml/l。
2.根據權利要求1的裝置，其特徵在於所述比例為約lml/1。
3.根據前述權利要求任一項的裝置，其特徵在於所述裝置與所述培養容器分離，並且所述出口通往所述培養容器的內部。
4.根據前述權利要求任一項的裝置，其特徵在於所述進料混合裝置在所述培養容器的外部或者在所述培養容器的內部。
5.根據前述權利要求任一項的裝置，其特徵在於用於混合所述進料溶液的所述小室具有0.5ml至1，OOOml的體積。
6.根據前述權利要求任一項的裝置，其特徵在於所述裝置由可滅菌材料製成。
7.細胞培養設備，其包含 a)細胞培養容器， b)氣體供應， c)用於各自具有非生理性pH值的進料溶液的至少兩個液體儲存器， d)用於測定細胞培養容器中的pH值的至少一個傳感器，和 e)根據權利要求1至6任一項的裝置。
8.根據權利要求1至6任一項的裝置或者根據權利要求7的設備在細胞的補料分批或連續培養中的用途。
9.用於產生多肽的方法，其包括以下步驟 -使用包含根據權利要求1至6任一項的裝置的培養容器或權利要求7的設備以補料分批或連續培養的方式培養包含編碼所述多肽的核酸的細胞，其中將各自具有非生理性pH值的至少兩種進料溶液加入到所述培養基中，和 -從所述培養基或所述細胞中回收所述多肽。
10.根據權利要求9的方法，其特徵在於 -任一酸性進料溶液具有PH6.5或更低的pH值，和/或任一鹼性進料溶液具有pH8.0或更高的pH值，並且 -所述混合的進料溶液具有PH7至pH7.5的pH值。
11.根據權利要求9至10任一項的方法，其特徵在於在加入到所述培養容器之前立即進行所述混合。
12.根據權利要求9至11任一項的方法，其特徵在於任一酸性進料溶液具有pH4.5或更低的PH值，和/或任一鹼性進料溶液具有ρΗΙΟ.0或更高pH值。
13.根據權利要求9至12任一項的方法，其特徵在於在加入到所述培養基中的兩種至四種單獨的進料溶液中的至少一種是酸性進料溶液且至少一種是鹼性進料溶液。
14.根據權利要求9至13任一項的方法，其特徵在於每種所述鹼性或酸性進料溶液包含選自胺基酸、糖、維生素、微量元素、乳酸和生長因子的至少一種化合物。
15.用於獲得具 有減少的G(O)糖形和/或增加的G(I)糖形的多肽的方法，其包括以下步驟:-用包含根據權利要求1至6任一項的裝置的培養容器或者根據權利要求7的設備以補料分批或連續培養的方式培養包含編碼所述多肽的核酸的細胞，其中將至少一種酸性進料溶液和至少一種鹼性進料溶液加入到所述培養基中，和-從所述培養基或所述細胞中回收所述多肽， 其中當加入到所述培養容器 中時，所述混合的進料溶液具有PH4.0至pH6.0的pH值。
全文摘要
在本文中報導了用於將具有非生理性pH值的進料溶液加入到細胞培養容器的進料混合裝置及其用途，所述裝置包含在將進料溶液加入到所述細胞培養容器之前用於混合進料溶液的小室。使用如在本文中所報導的進料混合裝置，可以在進料組分具有好的溶解度和/或好的穩定性的pH的溶液中提供進料組分，由此可以使該pH值明顯不同於培養基的pH值，即不同於生理性pH值。與進料溶液的pH值被限制在培養的pH值附近很小範圍的培養相比，這允許更靈活地進行培養。
文檔編號C12N5/00GK103221534SQ201180055657
公開日2013年7月24日 申請日期2011年12月5日 優先權日2010年12月7日
發明者S·鮑曼, J·霍夫曼, A·約克爾, C·克靈格爾, T·特洛布斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司