一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP及應用的製作方法

2023-07-01 04:47:21 1

專利名稱：一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，確切地說一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP及應用。
背景技術：
由於自然因素及人為因素的長期影響，全球範圍內的土壤鹽鹼化日趨嚴重。目前， 全球約有10億公頃鹽鹼地，而我國鹽鹼地面積為9913萬公頃(約佔世界總面積的10% )。 這些鹽鹼地主要包括以NaCl、Na2SO4等中性鹽為主的鹽土，以及以NaHC03、Na2CO3等鹼性鹽 為主的蘇打鹽鹼土。在我國日益擴大的內陸鹽鹼地中，很大部分是蘇打鹽鹼土。這類土壤 中，由於大量碳酸鹽(NaHCO3、Na2C03)的水解作用，土壤pH高達8. 0以上。因此，蘇打鹽鹼 土中NaHCO3、Na2CO3對植物的脅迫因素除了和NaCl、Na2SO4共有的離子毒害、滲透脅迫之外， 還有高PH值及其造成的礦質元素可利用性明顯降低等因素。在我國東北西部較嚴重的鹽 鹼地區僅限幾個種類的植物零星地分布於這種土壤，其他植物幾乎不能生存，給當地的農 業生產、經濟以及生態環境的發展帶來了巨大的影響。因此，提高作物的耐鹽鹼能力，尤其 是耐高PH鹽鹼脅迫的能力，培育耐高鹽鹼作物新品種具有重要意義。因此，對植物耐鹽鹼 分子機制的研究，以及通過基因工程技術培育耐鹽鹼作物新品種已成為近年來國際植物分 子生物學研究領域的一個前沿內容。在高鹽鹼下，植物通過產生脅迫蛋白和可溶性滲透調節物質來減輕鹽鹼脅迫造成 的毒害。但是，目前國內外有關植物耐鹽鹼分子機制與基因工程的研究，主要以NaCl為 研究對象(Sahuet al,2009 ；Qudeimat et al,2008 ；Rapala-Kozik et al. ,2008 ；Wu et al.，2004)，而對蘇打鹽鹼土中NaHCO3、Na2CO3等脅迫作用的機理研究較少(Zhang et al.， 2006)。最近，定位在液泡膜上的質子泵基因從許多植物中分離出來。研究結果表明液泡 膜質子泵將細胞質中的H+泵入液泡中，一方面，建立跨液泡膜電化學梯度，為無機離子及 其他溶質進出液泡提供驅動力，既能維持細胞離子平衡和滲透平衡，又能減輕一些無機離 子(比如Na+和CD對細胞質的毒害及pH值的作用(Queiros et al.，2009 ；Shi et al.， 2003 ；Blumwald et al.，2000)，有利於細胞質中生理生化反應的順利進行。這大大促進了 耐鹽鹼基因工程方面的研究工作並取得突破性進展。2001年，Gaxiola等將帶有35S啟動 子的AVPl基因轉入擬南芥，與同基因型的野生型相比，AVPl超表達的轉基因植株耐鹽性和 耐旱性顯著提高。Park等將AVPl基因轉入番茄(Lycopersicon esculentum)的一個商業 栽培品種(money maker)中，轉基因植株表現出下列特點根系生長較為強壯，生物量顯著 增加；根系液泡中積累大量依賴於H+-PPase驅動而運輸的陽離子，因而轉基因植株耐旱性 明顯增強(Park et al, 2005,Proc Natl Acad Sci USA, 102(52) :18830_18835)。但是，國 內外學者對於耐高pH鹽鹼的研究還未見報導。鹼蓬(Suaeda corniculate)是一年生藜科植物，營養豐富，是一種優質蔬菜和油 料作物。鹼蓬又是一種鹽生植物，俗稱「鹽蒿」、「海鮮菜」，喜高溼、耐鹽鹼、耐貧瘠、少病蟲 害，是種天然的無公害綠色食品，適於沿海地區沙土或沙壤土種植。鹼蓬是一種高耐鹽鹼的 野生植物，它在生長的過程中能夠從鹽鹼地裡吸取鹽鹼，改良土壤，進而引來其它草生長，
3使鹽鹼地轉化成新草原。

發明內容
本發明的目的是提供一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP。一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP，其鹼基序列如SEQ ID No, 1所示；所述的SucHP，由此推得蛋白的胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示；它是從鹼蓬中分離出編碼液泡膜質子泵的全長cDNA ；一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP，是由下述的方法獲得1)將鹼蓬種子用升汞消毒後，插種於MS培養基中，3周後將幼苗轉移至水培系統， 在水培系統中培養4周後用IOOmM NaHCO3 200mM NaCl進行處理，處理24h後，採取整株植 株，分離鹼蓬總RNA;2)採用磁珠法分離純化mRNA、利用Library Construction Kit試劑盒反轉錄，建 立鹼蓬cDNA文庫；利用PCR-Select cDNA Subt raction Kit試劑盒抑制消減雜交構建 SSH文庫；然後用在SSH文庫中已鑑定的鹼蓬耐鹽鹼關鍵基因，即質膜型H+-Ppase基因片段 為探針，篩選鹼蓬cDNA文庫，從而獲得上述基因的全長cDNA片段。本發明又一個目的是提供一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP的製備方法1)提取鹼蓬總RNA，採用磁珠法分離純化mRNA，反轉錄為cDNA，人工合成下述引 物引物 1:5' -AAAAAGCAGGCTATGAGTGGCATTCTTCTTC-3'引物 2 5 『 -AGAAAGCTGGGTTTAGAAGATCTTCAAGAGCA-3 『引物 3 5 『 -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3 『引物 4 5 『 -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3 『2)利用引物1和引物2，以鹼蓬的總RNA反轉錄的cDNA為模板，進行第一輪PCR 擴增，得到2295bp SucHP基因片段；3)以第一輪的PCR產物稀釋100倍為模板，使用引物3、引物4，進行第二輪PCR擴 增，得到純化的2295bp SucHP基因片段。本發明的另一個目的是，提供一種植物表達載體，其特徵在於，它含有上述純化的 SucHP基因片段。本發明的又一個目的是，一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP，在轉基因植物中的應用。本發明一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP，是利用抑制差減雜交和高密度點陣膜技 術研究鹼蓬苗期高PH鹽鹼脅迫誘導基因的表達，從鹼蓬中首次分離出編碼液泡膜質子泵 的基因，將該基因構建正義表達載體，轉化擬南芥，轉基因植株具從有較高的耐高PH鹽鹼 性，在100mMNaHC03+200mM NaCl, pH8. 5條件下，能正常生長，該基因可用於植物的遺傳轉 化，提高植物的耐鹽鹼能力。


圖1是鹽鹼脅迫處理鹼蓬的RT-PCR檢測結果。圖2是酶切載體pCB35S-SucHP-GFP後1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的基因2295bp片段產物。圖3是不同濃度的鹽和鹽鹼處理轉基因擬南芥植株圖片。圖4是不同濃度的鹽和鹽鹼處理轉基因擬南芥種子圖片。具體發明實施方式實施例1 鹼蓬液泡膜質子泵基因SucHP的克隆1)總RNA的提取鹼蓬種子採自吉林省白城地區。將鹼蓬種子用升汞消毒 後，播種於MS培養基中，3周後將幼苗轉移至水培系統，在水培系統中培養4周後用 100mMNaHC03+200mM NaCl進行處理；處理24h後，採取整株植株(包括根系和葉片)，液氮 固定後，貯於-80°C冰櫃備用；採用RNAeasy mini kit (promoga公司產品)提取鹼蓬總RNA ； 2)分離上述鹽鹼處理的鹼蓬總RNA，採用磁珠法(Promega公司)分離純化mRNA、 利用Library Construction Kit(Clontech)試劑盒反轉錄，建立鹼蓬cDNA文庫；利用 PCR-SeIec 1 cDNA Subt raction Kit(Clontech)試劑盒抑制消減雜交構建 SSH 文庫3)通過篩選克隆的SSH文庫，獲得多個陽性克隆。用ABI377測序儀對陽性克隆測 序，共獲得質量較好的EST (Expressed Sequence Tag)序列，對位比較後獲得不重複EST ； 將不重複EST序列在NCBI上與Genbank中的dbEST庫進行同源性比較，發現其中一些EST 可以找到序列同源性較高的cDNA ；這些基因都是在生物體中直接或間接對細胞遭受逆境 脅迫起保護作用的基因；4)利用液泡膜質子泵基因H+-Ppase基因片段為探針，篩選鹼蓬cDNA文庫，從而獲 得鹼蓬液泡膜質子泵基因SucHP的全長cDNA片段；5)基因克隆取2 μ 1 PCR與pMD18_T載體進行連接，操作步驟按Promcga公司產 品PMD18-T Vector system說明書進行。然後連接產物轉化大腸桿菌DH5 α南株(本實 驗室保存)，在表面塗有5-溴-4-氯-3-吲哚-(-D-半乳糖苷)和X-gal的含氨苄青黴素 (100微克/毫升)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜；6)質粒DNA的提取鹼法提取質粒DNA ；7)序列測定本工作在上海生工生物工程技術服務有限公司進行，測定結果，其 DNA序列測定，得到全長為2295bp的cDNA片段，包括起始密碼子和終止密碼子；由此推得 其764個胺基酸的一段序列，其鹼基序列如SEQ ID No 1所示，胺基酸序列如SEQ ID No. 2 所示。實施例2RT-PCR檢測鹽鹼脅迫的鹼蓬RT-PCR 檢測引物引物5 (上遊序列)5，-CTgCTggAAACACTACCgCT-3，引物 6 (下遊序列)5，-CATTgTCCCAAgCACCTCCT-3，
引物 7 (上遊序列)5，-TACCACATCCAAggAAggCA-3，引物 8 (下遊序列)5，-ACCCAAAgTCCAACTACgAg-3，引物5和引物6是載體中SucHP基因的引物，擴增片段為569bp ；引物7和引 物8為內參基因Actin的引物，擴增片段為438bp ；鹼蓬分別經250mM NaCl和200mM NaCl+100mMNaHC03處理0h、6h、12h、24h、48h。以鹼蓬根，莖和葉的cDNA為模板，檢測基因 的表達；PCR反應結束後，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果見圖1，結果
5顯示SucHP基因的表達具有一定的鹽鹼誘導性。實施例3植物表達載體pCB35S_SucHP的構建根據SEQ ID No 1序列，設計構建表達載體的加ATTBl和ATTB2接頭引物引物 1 5 『 -AAAAAgCAggCTATgAgTggCATTCTTCTTC-3 『引物 2 5 『 -AgAAAgCTgggTTTAgAAgATCTTCAAgAgCA-3 『引物 3 5, -ggggACAAgTTTgTACAAAAAAgCAggCT-3 『引物 4 5 『 -ggggACCACTTTgTACAAgAAAgCTgggT-3 『1)以鹼蓬總cDNA為模板，利用加ATTBl和ATTB2接頭的引物1、引物2進行第-輪PCR擴增，擴增體系如下擴增體系和程序為
2 X Taq Mix12 5μ 1
引物11.0μ 1
引物21.0μ 1
模板DNA1.0μ 1
ddH209.5 μ 1
權利要求
1.一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP，其鹼基序列如SEQ ID No. 1所示。
2.一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP表達的蛋白，其胺基酸序列如序列表SEQ ID No. 2 所示。
3.根據權利要求1所述的一種植物耐高PH鹽鹼基因SucHP，其特徵在於，它是從鹼蓬 中分離出來的cDNA。
4.根據權利要求3所述的一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP，其特徵在於，它是由下述 的方法獲得1)將鹼蓬種子用升汞消毒後，播種於MS培養基中，3周後將幼苗轉移至水培系統，在水 培系統中培養4周後用IOOmM NaHC03+200mM NaCl進行處理，處理24h後，採取整株植株， 分離鹼蓬總RNA ；2)採用磁珠法分離純化mRNA、利用LibraryConstruction Kit試劑盒反轉錄，建立鹼 蓬cDNA文庫；利用PCR-Select cDNA Subt raction Kit試劑盒抑制消減雜交構建SSH文 庫；然後用在SSH文庫中已鑑定的鹼蓬耐鹽鹼關鍵基因，即質膜型H_-PpaSe基因片段為探 針，篩選鹼蓬cDNA文庫，從而獲得上述基因的全長cDNA片段。
5.一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP的製備方法1)提取鹼蓬總RNA，採用磁珠法分離純化mRNA，反轉錄為cDNA，人工合成下述引物引物 1 5 『 -AAAAAGCAGGCTATGAGTGGCATTCTTCTTC-3 『引物 2 5 『 -AGAAAGCTGGGTTTAGAAGATCTTCAAGAGCA-3 『引物 3 5 『 -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3 『引物 4 5 『 -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3 『2)利用引物1和引物2，以鹼蓬的總RNA反轉錄的cDNA為模板，進行第一輪PCR擴增、 得到2295bp SucHP基因片段；3)以第一輪的PCR產物稀釋100倍為模板，使用引物3、引物4，進行第二輪PCR擴增， 得到純化的2295bp SucHP基因片段。
6.一種植物表達載體，其特徵在於，它含有權利要求5所述的純化的SucHP基因片段。
7.一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP，在轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種植物耐高pH鹽鹼基因SucHP，它是利用抑制差減雜交和高密度點陣膜技術研究鹼蓬苗期高pH鹽鹼脅迫誘導基因的表達，從鹼蓬中首次分離出編碼液泡膜質子泵的基因，將該基因構建正義表達載體，轉化擬南芥，轉基因植株具從有較高的耐高pH鹽鹼性，在100mM NaHCO3+200mM NaCl，pH8.5條件下，能正常生長，該基因可用於植物的遺傳轉化，提高植物的耐鹽鹼能力。
文檔編號C12N15/82GK102002505SQ201010508079
公開日2011年4月6日 申請日期2010年10月15日 優先權日2010年10月15日
發明者劉亮, 李海燕, 王南, 王瑩 申請人:吉林農業大學