MYC癌基因抑制多肽及其應用的製作方法

2023-07-01 12:55:56

本發明涉及藥物領域，具體涉及用於治療腫瘤的多肽。

背景技術：

腫瘤治療一直是臨床的熱點和難點問題。手術、化療、放療、靶向療法、和免疫療法是當今癌症治療的五大支柱。其中靶向療法是目前最有發展前途的治療手段。儘管如此，尋找腫瘤側治療靶點，一直是阻撓腫瘤靶向治療的瓶頸。

研究發現，MYC癌基因與腫瘤發生密切相關。MYC癌基因是強致癌基因，可以編碼MYC致癌蛋白。MYC癌基因調控著細胞的大約1萬個基因和微RNA的表達。MYC通過影響調控糖酵解、穀氨醯胺合成、葡萄糖轉運、線粒體蛋白合成、核苷酸合成等過程的基因，改變生物能量及代謝，激活原癌基因並抑制抑癌基因，調控細胞增殖。研究發現，多種腫瘤，如肺癌，胃癌，乳腺癌，結腸癌，宮頸癌，某些神經母細胞病，粒細胞性白血病，視網膜母細胞瘤，成骨肉瘤，軟骨肉瘤，脊索瘤，脂肪肉瘤，橫紋肌肉瘤，何杰金氏病及頭部腫瘤等都有myc基因的擴增或過度表達。C-myc基因主要通過擴增和染色體易位重排的方式激活，與某些組織腫瘤的發生、發展和演變轉歸有重要關係。

MYC調控的細胞生物學活動包括細胞周期、細胞分化、細胞生長、蛋白質合成與新陳代謝、血管生成等。(1)細胞周期和細胞分化：MYC可經Cyc lind1、Cyc lind2、Cycline1、Cyc lina2、CDK4、細胞分裂周期25A(CDC25A)、E2F1和E2F2的激活，啟動細胞周期演進。細胞周期的G0/G1向S期演進必需MYC，MYC激活後G1期常縮短。MYC消除細胞周期檢查點基因(如GADD45和GADD153)的轉錄。MYC是細胞分化與細胞命運的調控物異位MYC表達能阻斷多種不同類型細胞的分化。細胞退出細胞周期，發生分化，需要下調MYC；但MYC也能刺激細胞分化。MYC調控失常阻礙細胞分化和促進細胞遷移，這導致癌症分化降低、侵襲和轉移等變化。(2)細胞生長、基因組不穩定性和血管發生：體內和體外實驗研究結果證明，MYC能增強腫瘤細胞和正常細胞生長的能力，MYC充分供給細胞的幾類基本建構材料，增加細胞代謝與蛋白質合成。當MYC激活時，細胞生長不再限速。研究報導，MYC調控失常的細胞發生特異性基因高頻率擴增。MYC能促進染色體不穩定性，MYC調控失常伴隨血管生成，MYC表達增加和白介素1β(IL1β)釋放對於啟動血管生成具有決定性作用。(3)MYC對細胞凋亡的調控：研究報導，MYC裸細胞對不同凋亡刺激具抵抗性，這證明MYC在凋亡過程中的決定性作用。MYC失調使ARF上調，並通過ARF-MDM2-p53通路誘發凋亡。在MYC致瘤的小鼠模型，喪失這些腫瘤抑制物可促成腫瘤生成。ARF-MDM2-p53之外的瘤基因或致瘤性調控物如BM I1，TWIST1和CUL7可與MYC合作從而發揮致病作用。由此可見，MYC癌基因是腫瘤靶向治療的重要靶點。

針對這些特點，可以對腫瘤進行進一步的靶向治療研究。合成針對C-myc基因抑制劑治療腫瘤具有廣闊的發展前景。目前，沒有成熟開發的MYC致癌蛋白製劑問世，用於治療腫瘤。

本發明人設計出MYC癌基因抑制多肽，用於治療腫瘤患者，為腫瘤患者的治療找到新的突破口。

技術實現要素：
：

本發明目的是針對現有腫瘤患者治療的藥物特點，設計一種MYC癌基因抑制多肽，能有效治療腫瘤。

技術方案

一種MYC癌基因抑制多肽，其序列為SEQ ID NO1。所述多肽的治療腫瘤的應用。其用途可通過多種給藥方式治療腫瘤，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注等實現。所述MYC癌基因抑制多肽抑制MYC致癌蛋白表達，及蛋白活性。

有益結果：

本發明中的MYC癌基因抑制多肽序列SEQ ID NO1，為全新的序列。可以靶向抑制MYC癌基因抑制MYC致癌蛋白表達產生的效應，達到治療腫瘤的效果。試驗結果表明：本發明能夠抑制體外的多種腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞中MYC蛋白表達，抑制腫瘤細胞端粒酶活性，抑制腫瘤模型裸鼠體內腫瘤的生長，提高荷瘤小鼠生存率。達到治療腫瘤的效果。

具體實施方式

MYC癌基因抑制多肽由上海生工吉爾合成。

實施例1

MYC癌基因抑制多肽的體外細胞增殖活性測定

採用MTT比色法。將對數生長的胃癌細胞株SGC-7901，以1.0×105加入96孔培養板中，培養24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物MYC癌基因抑制多肽；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設五個復孔，培養48h，每孔加入MTT，作用4h後，加入DMSO，孵育30min，在酶標儀570nm處測定吸光度A值，按公式細胞生長增殖抑制率＝(實驗組吸光值/對照組吸光值-1)×100％。計算出實驗藥物的IC50為31.21nmol/L。

實施例2

用腫瘤模型檢測MYC癌基因抑制多肽的體內效應。

建立結腸癌腫瘤模型，將處於對數生長期的HT29細胞用胰蛋白酶於37℃消化後，收集培養液，生理鹽水清洗2～3次。用生理鹽水將細胞濃度調整為2×107個/mL，接種於C57BL/6裸鼠右前肢腋部皮下，每隻0.1mL。1w～2w後裸鼠腫瘤體積長到100～200mm3，剖取其瘤組織在無菌條件下碾磨，製備成1×107個/mL細胞懸液，接種於C57BL/6裸鼠右前肢腋部皮下，每隻0.1mL。1w～2w後裸鼠腫瘤體積長到70～100mm3後，裸鼠隨機分成4組，每組10隻。(1)空白組；(2)MYC癌基因抑制多肽低劑量組；(3)MYC癌基因抑制多肽中劑量組；(4)MYC癌基因抑制多肽高劑量組。建立結腸癌腫瘤模型，方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實驗組MYC癌基因抑制多肽(上海生工吉爾合成)設3個劑量：5、10、20mg/Kg，在腫瘤周圍多點注射。連續給藥21天後，觀察裸鼠存活數量，計算存活率。結果顯示，MYC癌基因抑制多肽可有效地保護裸鼠，提高結腸癌荷瘤裸鼠的生存率，20mg/Kg時，生存率達到69.3％。

實施例3

MYC癌基因抑制多肽對胃癌細胞株SGC-7901中MYC蛋白表達的影響：將SGC-7901細胞用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基，在37℃、5％CO2的培養箱中培養至90％以上的匯合度時，用0.25％胰蛋白酶消化細胞，計數，3000rpm離心5min收集細胞；加入10％小牛血清的RPMI 1640培養液(5ml)懸浮細胞，細胞計數，調整細胞濃度為5*106個/ml，於6孔培養板中培養。實驗設空白對照組、MYC癌基因抑制多肽各劑量(5、10、20mg/ml)組。各組分別加入SGC-7901細胞懸液600μl/孔後，空白對照組加入1640培養液600μl，MYC癌基因抑制多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽。按20μl/1×105個細胞加入蛋白質提取液，吹吸打散細胞，4℃放置30min使細胞裂解，用於檢測細胞裂解液中MYC蛋白表達量。

結果顯示，MYC癌基因抑制多肽處理的SGC-7901中MYC蛋白表達明顯升高。SGC-7901細胞裂解液中MYC蛋白表達(229.71±32.89pg/(mg總蛋白)(p<0.05)，570.19±120.43pg/(mg總蛋白)(p<0.05)，845.62±223.22pg/(mg總蛋白)(p<0.05))，與SGC-7901對照組(29.01±16.87pg/(mg總蛋白))相比有顯著性差異。由此可見，MYC癌基因抑制多肽能促進人胃癌細胞SGC-7901中MYC蛋白表達。

實施例4

採用端粒酶活性測定，評價MYC癌基因抑制多肽對胃癌細胞株SGC-7901細胞調亡的影響：將SGC-7901細胞用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基，在37℃、5％CO2的培養箱中培養至90％以上的匯合度時，用0.25％胰蛋白酶消化細胞，計數，3000rpm離心5min收集細胞；加入10％小牛血清的RPMI 1640培養液(5ml)懸浮細胞，細胞計數，調整細胞濃度為5*106個/ml，於6孔培養板中培養。實驗設空白對照組、MYC癌基因抑制多肽各劑量(5、10、20mg/ml)組。各組分別加入SGC-7901細胞懸液600μl/孔後，空白對照組加入1640培養液600μl，MYC癌基因抑制多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽。按20μl/1×105個細胞加入蛋白質提取液，吹吸打散細胞，4℃放置30min使細胞裂解，採用端粒酶活性檢測試劑盒(美國promega)檢測細胞裂解液中端粒酶活性。

結果顯示，MYC癌基因抑制多肽處理的SGC-7901中端粒酶活性明顯降低。SGC-7901細胞裂解液中端粒酶活性(54.71±17.07pg/ml(p<0.05)，35.29±18.46pg/ml(p<0.05)，15.62±0.32pg/ml)(p<0.05))，與SGC-7901對照組(121.6501±16.67pg/(mg總蛋白))相比有顯著性差異。由此可見，MYC癌基因抑制多肽能促進人胃癌細胞SGC-7901中端粒酶活性，促進細胞調亡。

SEQUENCE LISTING

羅瑞雪

MYC癌基因抑制多肽及其應用

1

PatentIn version 3.5

1

34

PRT

人工序列

1

Val Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys

1 5 10 15

Asn Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Leu Val Ser Glu Lys

20 25 30

Leu Ala