一種快速定量檢測胺基酸脫羧酶的比色方法
2023-07-01 09:21:21
一種快速定量檢測胺基酸脫羧酶的比色方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速定量檢測胺基酸脫羧酶的比色方法，通過配置反應液及顯色液，製備標準曲線，最後可獲得待測樣品的胺基酸脫羧酶的酶活力。該方法成本低廉；重複性好，在酶濃度在0.001U~0.006U/μL之間線性關係良好；操作簡單，儀器要求不高；方法可靠，適用面廣，可檢測多種胺基酸脫羧酶。本發明方法的公開，對於研究動物組織、微生物培養液、細胞培養以及血液樣本中的胺基酸脫羧酶活力變化至關重要。
【專利說明】一種快速定量檢測胺基酸脫竣酶的比色方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶活性檢測領域，具體涉及一種快速定量檢測胺基酸脫羧酶的比色方 法。
【背景技術】
[0002] 胺基酸脫羧酶（amino acid decarboxylase)是催化脫去某種胺基酸的羧基，生 成對應胺（如下列括弧中所示）的裂解酶之總稱：NH2CHRC00H -NH2CH2R+C02。主要是在酸 性培養基上生長的細菌中發現的，在動物、植物中雖然很少，但也可以找到。在細菌中已知 具有賴氨酸（屍胺）、酪氨酸（酪胺）、精氨酸（鯡精胺）、鳥氨酸（腐胺）、穀氨酸（Y -氨 基丁酸）等相應的專一性的脫羧酶，這些酶均以磷酸吡哆醛為輔酶。在動物組織中具有谷 氨酸（Y -氨基丁酸）、酪氨酸（酪胺）、組氨酸（組胺）、半胱氨酸（牛磺酸）、5_羥色氨酸 (5-羥色胺）相應的專一性的脫羧酶，多以磷酸吡哆醛為輔酶。胺基酸脫羧生成的胺類在 動物體內有許多是在生理上、藥理上起重要作用的，在細菌中具有中和酸性培養基的作用。 然而目前還沒有快速定量檢測胺基酸脫羧酶活力的詳細的方法和商品化的試劑測試盒。為 了替代傳統成本高昂，放射性物質汙染等檢測方法（需要液閃儀），目前已有專利報導採用 羧化酶酶偶聯固定CO 2的技術檢測胺基酸脫羧酶活力，但操作方法不夠詳細，操作起來很困 難。基於此原理，本發明旨在發明一種快速定量檢測胺基酸脫羧酶的比色方法，開發商品化 的檢測試劑盒，形成詳細可行的操作步聚，這對於研究動物組織、微生物培養液、細胞培養 以及血液樣本中的胺基酸脫羧酶活力變化至關重要。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是在於提供了一種快速定量檢測胺基酸脫羧酶的比色方法，方法易 行，成本低廉，能夠在70分鐘內完成檢測工作，且僅需恆溫水浴鍋以及分光光度計等常規 儀器。廣譜性強，能同時對應檢測多種胺基酸。效果穩定，操作簡便。
[0004] 為了達到上述目的，本發明採用以下技術措施：
[0005] -種快速定量檢測胺基酸脫羧酶的比色方法，其具體步驟如下：
[0006] (1)反應液與顯色液試劑組成及配製
[0007] 反應液：即配即用，將試劑2溶於試劑1中即可。
[0008] 試劑 I :50mmol/L Tris (pH7. 5), 10mmol/L MgCl2, 2mmol/LPEP 單環已胺鹽，5mmol/ L胺基酸，採用無CO2蒸饋水配製；
[0009] 所述的胺基酸為待檢測的胺基酸脫羧酶對應的胺基酸；
[0010] 試劑 2 :5U/mg PEP 羧化酶；
[0011] 顯色液：試劑3 :50mg/ml固紫B，1%吐溫-80溶液，採用無CO2蒸饋水配製；
[0012] 試劑4:脫羧酶標準品。
[0013] 以上溶液均採用無CO2雙蒸水配製，無CO2雙蒸水的製作方法：臨用前將雙蒸水加 熱至沸騰後，繼續加熱5min，冷卻後密封待用。
[0014] (2)標準曲線試劑配製
[0015] 將脫羧酶標準品配製成 0,0? 001，0. 002,0. 003,0. 004,0. 005,0. 006,0. 007， 0. 008U/i! L濃度梯度的酶溶液，溶劑為勻漿介質。
[0016] pH 7.4,0.01mol/L Tris-Hcl，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/L 蔗糖，0.8% 的 氯化鈉溶液。
[0017] (3)標準曲線的製備
[0018] ①移取450 ii L反應液到離心管；
[0019] ②加入50 L步驟（2)中配製的標準品，上下顛倒數次，混勻；
[0020] ③37°C下孵育lh，每隔IOmin上下顛倒混勻數次；
[0021] ④加入25 L顯色液與反應體系中，上下顛倒數次，混勻；
[0022] ⑤靜置5min，Icm光徑，蒸餾水調零，520nm，測各管吸光度（OD)值；
[0023] ⑥重複實驗步驟①至⑤9次；
[0024] ⑦構建標準曲線：縱坐標（Y軸）為吸光單位的實際讀數；橫坐標（X軸）為標準脫 羧酶酶活力單位（U)，為標準品酶濃度X 50 ii L ;
[0025] (4)待測樣品測定方法
[0026] ①移取450 ii L反應液到離心管；
[0027] ②向離心管中加入50 ii L待測樣品或50 ii L勻漿介質；上下顛倒數次，混勻；
[0028] ③37°C下孵育Ih,每隔IOmin上下顛倒混勻數次；加入25 ii L顯色液於反應體系 中，上下顛倒數次，混勻；
[0029] ④靜置5min，Icm光徑，蒸餾水調零，520nm，測各管吸光值OD ;
[0030] ⑤根據OD ^和標準曲線計算樣品對應的酶濃度E ^ (U/ ii L)，E ^與曲線X的值 的對應關係為：E_#= x/50。
[0031] ⑥計算樣品比活力：E#s= E實_ X樣品稀釋倍數+樣品總蛋白濃度。
[0032] 待測樣品中，若需檢測待測溶液中多種胺基酸脫羧酶的比活力，可僅以某一種氨 基酸脫羧酶標準曲線為準。
[0033] 所述的勻漿介質的配方為：pH 7. 4,0. 01mol/L Tris-Hcl，0. OOOlmol/L ￡0丁4-2恥，0.01111〇1/1蔗糖，0.8%的氯化鈉溶液。
[0034] 以上所述方案中，針對待測溶液的製備，採用本領域的常規方法，優選採取以下方 法：
[0035] 對於微生物溶液樣品，IOOOOrpm,離心5min，傾去上清，用生理鹽水或PBS反覆清 洗沉澱2?3次，再IOOOOrpm,離心5min，傾盡上清，用生理鹽水稀釋至0. 80D，取IOmL, IOOOOrpm,離心5min，傾盡上清，加入500 ii L勻楽介質或生理鹽水，將離心管插入冰中，用 振幅30微米超聲處理20s，置於冰上冷卻，反覆超聲處理3次，使細胞破碎，放進4°C臺式離 心機15min，速度為16000g，小心移去500 ii L上清液到新的預冷的I. 5mL離心管置於冰槽 裡，檢測總蛋白含量待用。
[0036] 對於動物組織樣品，稱取組織樣品Ig於4°C穩定後的冰生理鹽水或PBS緩衝液反 復漂洗2?3次，每次不得低於5mL，除盡血液等雜質，濾紙吸乾，再次稱重，置於IOmL離 心管中插入冰中待用。將組織樣本放入IOmL離心管中，用移液槍取預冷的勻漿介質（PH 7.4,0.01111〇1711'1^8-此1，0.0001111〇171￡0了六-2恥，0.01111〇171蔗糖0.8%的氯化鈉溶液）， 勻漿介質的體積總量應該是組織塊重量的9mL，用移液槍取總量2/3的勻漿介質或者生 理鹽水於離心管中，用乾淨預冷的剪刀將組織塊剪碎入離心管中，用組織勻漿機10000? 15000rpm上下研磨成10%的組織勻漿（勻漿IOs/次，間歇30s，連續3?5次，整個過程需 要在冰水中進行直至研磨均勻），最後將剩餘的1/3勻漿介質衝洗勻漿機刀口，液體收集於 勻漿用的離心管中。製備好的10%勻漿用低溫低速離心機2000rpm左右離心10?15min， 小心的移取上清液分裝於預冷的I. 5mL離心管中，檢測總蛋白含量待用。
[0037] 本發明提供的快速檢測脫羧酶酶活力的方法，同現有方法相比具備以下特點：
[0038] 1、成本低廉；
[0039] 2、提供了仔細完整的實驗操作步驟；
[0040] 3、重複性好，在酶濃度在0. OOlU?0. 006U/ii L之間線性關係良好；
[0041] 4、操作簡單，儀器要求不高；
[0042] 5、方法可靠，適用面廣，可檢測多種胺基酸脫羧酶。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0043] 圖1為實施例1中酪氨酸脫羧酶標準曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0044] 實施例1 :
[0045] 一種快速定量檢測胺基酸脫羧酶的比色方法，其具體步驟如下：
[0046] 以豬結腸微生物菌體樣品為例，測定結腸微生物菌體賴氨酸脫羧酶、穀氨酸脫羧 酶、酪氨酸脫羧酶、甘氨酸脫羧酶、色氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶、甲硫氨酸脫羧酶和精氨酸 脫羧酶。
[0047] 1 ?試劑
[0048] (1)反應液與顯色液試劑組成及配製
[0049] 快速定量檢測脫羧酶比色方法的試劑配方見表1。
[0050] 反應液：即配即用，將試劑2溶於試劑1中即可。
[0051] 試劑 I (100ml) :50mmol/L Tris (pH7. 5)，10mmol/L MgCl2, 2mmol/LPEP 單環已胺 鹽，5mmol/L胺基酸，採用無CO2蒸饋水配製；
[0052] 所述的胺基酸為待檢測的胺基酸脫羧酶對應的胺基酸；
[0053] 試劑 2 (20mg) :5U/mg PEP 羧化酶；
[0054] 顯色液：試劑3 :50mg/ml固紫B 1 %吐溫-80溶液，採用無CO2蒸饋水配製；
[0055] 試劑4(250mg):酪氨酸脫羧酶標準品（USP級，0? lU/mg)。
[0056] 以上溶液均採用無CO2雙蒸水配製，無CO2雙蒸水的製作方法：臨用前將雙蒸水加 熱至沸騰後，繼續加熱5min，冷卻後密封待用。
[0057] 表1快速定量檢測胺基酸脫羧酶的比色方法的試劑配方
[0058]
【權利要求】
1. 一種快速定量檢測胺基酸脫羧酶的比色方法，其具體步驟如下： (1) 反應液與顯色液試劑組成及配製 反應液：即配即用，將試劑2溶於試劑1中即可； 試劑 1 :50 mmol/L Tris, pH7. 5,10 mmol /T, MgCl2, 2mmol/LPEP 單環已胺鹽，5 mmol /T, 胺基酸； 所述的胺基酸為待檢測的胺基酸脫羧酶對應的胺基酸； 試劑2 :5 U/mg PEP羧化酶； 顯色液：試劑3 :50 mg/ml固紫B，1%吐溫-80溶液，採用無C02蒸餾水配製； 試劑4 :脫羧酶標準品 以上溶液均採用無C02雙蒸水配製； (2) 標準曲線試劑配製 將脫羧酶標準品配製成 〇,〇? 〇〇l，〇. 002,0. 003,0. 004,0. 005,0. 006,0. 007,0. 008 U/ U L濃度梯度的酶溶液，溶劑為勻漿介質； pH 7.4,0.01mol/L Tris-Hcl，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/L蔗糖，0.8%的氯化鈉 溶液； (3) 標準曲線的製備 ① 移取450 ii L反應液到離心管； ② 加入50 y L步驟（2)中配製的標準品，上下顛倒數次，混勻； ③ 37°C下孵育1 h，每隔10 min上下顛倒混勻數次； ④ 加入25 yL顯色液與反應體系中，上下顛倒數次，混勻； ⑤ 靜置5 min，l cm光徑，蒸餾水調零，520 nm，測各管吸光度（0D)值； ⑥ 重複實驗步驟①至⑤9次； ⑦ 構建標準曲線：縱坐標（Y軸）為吸光單位的實際讀數；橫坐標（X軸）為標準脫羧酶 酶活力單位（U)，為標準品酶濃度X 50 y L ; (4) 待測樣品測定方法 ① 移取450 ii L反應液到離心管； ② 向離心管中加入50 ii L待測樣品或50 ii L勻漿介質；上下顛倒數次，混勻； ③ 37°C下孵育1 h，每隔10 min上下顛倒混勻數次；加入25 yL顯色液於反應體系 中，上下顛倒數次，混勻； ④ 靜置5 min，l cm光徑，蒸餾水調零，520 nm，測各管吸光值0D; ⑤ 根據〇D@和標準曲線計算樣品對應的酶濃度U/y L，與曲線x的值的對 應關係為：E實際=x / 50 ; ⑥ 計算樣品比活力：E#S=E@X樣品稀釋倍數+樣品總蛋白濃度。
2. 根據權利要求1所述的方法，所述的勻漿介質的配方為：pH 7.4,0.01mol/L Tris-Hcl，0. 0001mol/L EDTA-2Na，0. 01mol/L 蔗糖，0? 8% 的氯化鈉溶液。
3. 根據權利要求1所述的方法，所述的待測溶液，其製備方法如下： 對於微生物溶液樣品，10000 rpm，離心5 min,傾去上清，用生理鹽水或PBS反覆清洗沉 澱2?3次，再10000 rpm，離心5 min,傾盡上清，用生理鹽水稀釋至0.8 0D，取10 mL，10000 rpm，離心5 min，傾盡上清，加入500 iiL勻漿介質或生理鹽水，將離心管插入冰中，用振幅 30微米超聲處理20 s，置於冰上冷卻，反覆超聲處理3次，使細胞破碎，放進4°C臺式離心 機15 min，速度為16000 g，小心移去500 yL上清液到新的預冷的1.5 mL離心管置於冰 槽裡，檢測總蛋白含量待用； 對於動物組織樣品，稱取組織樣品1 g於4°C穩定後的冰生理鹽水或PBS緩衝液反覆漂 洗2~3次，每次不得低於5 mL，除盡血液等雜質，濾紙吸乾，再次稱重，置於10 mL離心管中 插入冰中待用；將組織樣本放入10 mL離心管中，用移液槍取預冷的勻漿介質，勻漿介質的 體積總量應該是組織塊重量的9倍，用移液槍取總量2/3的勻漿介質或者生理鹽水於離心 管中，用乾淨預冷的剪刀將組織塊剪碎入離心管中，用組織勻漿機10000~15000 rpm上下研 磨成10%的組織勻漿，勻漿10 s/次，間歇30 s，連續:T5次，整個過程需要在冰水中進行直 至研磨均勻，最後將剩餘的1/3勻漿介質衝洗勻漿機刀口，液體收集於勻漿用的離心管中； 製備好的10%勻楽用低溫低速離心機2000 rpm左右離心10~15 min,小心的移取上清液分 裝於預冷的1.5 mL離心管中，檢測總蛋白含量待用。
【文檔編號】G01N21/31GK104374768SQ201410444552
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】唐志如, 鄧歡, 孫志洪, 石寶石 申請人:西南大學