一種幽門螺桿菌空泡毒素抗原的製備方法
2023-06-21 13:04:11 1
專利名稱：一種幽門螺桿菌空泡毒素抗原的製備方法
技術領域：
本發明屬於免疫學領域，尤其涉及幽門螺桿菌，具體來說是一種幽門螺桿菌空泡毒素抗原的製備方法。
背景技術：
幽門螺桿菌是定居於人胃內的一種革蘭氏陰性螺旋狀桿菌，外膜是革蘭氏陰性細菌表面的一種連續性結構，它作為潛在的靶標在保護性免疫中有著十分重要的意義。作為革蘭氏陰性細菌，Hp能釋放外膜小泡(OMV)，其中含有VacA、外膜蛋白等抗原成分。純化的OMV能保護小鼠免受細菌攻擊。VacA屬於革蘭氏陰性自主分泌蛋白家族，基因全長約4550bp，含一個長開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼約含1300個胺基酸、分子量約140kDa的毒素前體蛋白。整個ORF的序列主要分為三部分，分別編碼不同的功能區域。氨基端為33個胺基酸的信號肽，羧基端35-45kDa的片段(P40)負責運輸毒素出胞，中間部分為95kDa的毒素活性功能區域(P95)。信號肽介導前毒素蛋白分泌至菌體外周質後被切除，P40插入菌體外膜形成載體運送P95出膜，然後經蛋白酶水解切除，成熟的VacA蛋白(P95)被分泌至菌體外。P95包含兩個亞單位蛋白，分別為37kDa(P37)和58kDa(P58)，二者間有一短的暴露在外的、對蛋白酶敏感的環形肽鏈連接，在P95分泌出胞的過程中，此環被蛋白酶水解，P37和P58保持非共價連接。成熟的P95蛋白以無或低活性的多聚體形式分泌至菌體外，在弱酸或弱鹼條件下，多聚體解體形成P95蛋白單體，作用於靶細胞，致細胞空泡形成，引起細胞結構、功能的改變。
發明內容
本發明的目的在於提供一種幽門螺桿菌空泡毒素抗原的製備方法包括如下步驟
a)提取H.pylori基因組DNA；b)通過PCR法擴增VacA P95目的基因；c)通過T4 DNA連接酶將目的基因與表達載體連接，表達載體為PQE-TriSystem質粒；然後轉化入感受態細胞中；d)將含目的基因的重組質粒轉化入表達宿主菌SG13009中，經IPTG誘導表達；e)表達產物分離與純化。
進一步的，步驟2中，通過PCR法擴增VacA P95目的基因的引物如下sense 5』-CAAAGTCCCATGGCCTTTTTCACAAC-3』，antisense5』-TTCAAACTGCAGCTCAATAGTGCC-3』；克隆位點為Nco I和Pst I。PCR反應條件為94℃熱變性4min，94℃30sec、55℃1min、72℃2.5min共30個循環，72℃延伸10min。
本發明還提供了一種載體，所述的載體含有VacA P95目的基因。
本發明的還提供了一種宿主，所述的宿主中含有上述的載體。
本發明和已有技術相對照由於本發明針對vacA基因中編碼成熟VacA蛋白的區段設計引物，重組表達具有毒素活性的P95功能片段作為目的抗原。選用的表達載體為QIAGEN公司最新提供的pQE-TriSystem，此載體所含的T5啟動子使之保留了原pQE載體系列在E.coli中高效、穩定表達的性能，此外還含有另兩種啟動子p10啟動子使之能在棒狀桿菌表達系統中表達；CAG啟動子可適用於瞬時轉染哺乳動物細胞系進行真核表達。將目的基因構建於這一載體中，可根據所需目的蛋白的不同用途靈活選用表達系統，而避免了更換載體的煩瑣步驟。此載體在緊接多克隆位點的下遊帶有編碼8個組胺酸的序列，所表達的目的蛋白為帶有8個連續組胺酸片段的融合蛋白。這8個組胺酸片段免疫源性極低，對用作抗原的P95蛋白免疫功能並無影響，卻大大方便了進一步的蛋白純化工作。
具體實施例方式
實施例1H.pylori基因組DNA的抽提H.pylori菌株NCTC11637(由澳大利亞雪梨新南威爾斯大學微生物與免疫學學院Andren Lee教授惠贈)生長於瓊脂平板上，37℃微需氧條件下培養48小時，收集細菌於PH8.0的TE緩衝液中，分別用溶菌酶、10％SDS及20mg/ml的蛋白酶K作用後，採用酚氯仿抽提法提取Hp全基因組DNA，-20℃下備用。
實施例2空泡毒素VacA基因P95的製備從Genebank獲得H.pylori NCTC11637vacA的全基因序列，基因登錄號為AF049653。vacA基因全長4544bp，編碼約140kDa的VacA前毒素蛋白，本實驗克隆其中編碼成熟VacA毒素的DNA片段(389bp-2942bp)，表達約95kDa毒素蛋白。利用DNAStar和GeneRunner基因分析軟體對目的基因進行閱讀框、酶切位點、mRNA二級結構分析，針對此序列設計引物如下sense 5』-CAAAGTCCCATGGCCTTTTTCACAAC-3』，antisense 5』-TTCAAACTGCAGCTCAATAGTGCC-3』；克隆位點為Nco I和PstI。PCR反應條件為94℃熱變性4min，94℃30sec、55℃1min、72℃2.5min共30個循環，72℃延伸10min。PCR產物用1％Agarose電泳鑑定後，進行割膠回收。
實施例3VacA P95基因與載體的酶切與連接用限制性內切酶Nco I和Pst I分別對目的基因片段VacA P95和載體質粒pQE-TriSystem進行雙酶切。為防止載體質粒自身環化，用Shrimp鹼性磷酸酶處理酶切後的質粒DNA。
酶切反應的反應體系為50μl，其中目的基因或載體質粒的DNA 25μl，10 X Buffer 5μl，兩種限制性內切酶各1μl，37℃下消化3小時。酶切產物用1％Agarose凝膠電泳分離鑑定。切膠回收目的基因，與載體質粒分別用T4 DNA連接酶連接，連接反應體系為10μl，含10 X Bufer 1μl，T4連接酶1μl，目的基因和載體DNA按4∶1混勻，16℃連接16小時。
實施例4感受態細胞的製備及重組質粒的鑑定用標準CaCl2法製備E.coli XL1-Blue和SG13009的感受態細胞(購自QIAGEN公司)於-80℃備用。
用熱休克法將連接產物分別轉化入相應的宿主菌中VacAP95+pQE-TriSystem→XL1-Blue。取凍存的E.coli感受態細胞置於1.5mlEppendorf管中，分別加入相應的連接反應產物，輕輕混勻，冰浴20分鐘後42℃熱擊45sec，立即置冰上2min，再加入1ml LB，於37℃、200rpm轉速下培育50min，5000rpm離心3min，棄部分上清，留約100μl重懸沉澱後塗於含100μg/ml氨苄青黴素的LB平板上，37℃培養過夜。
以PCR法篩選出含重組質粒的陽性克隆，挑選一單個克隆擴增培養後，提取重組質粒DNA，根據各自的雙酶切位點進一步酶切鑑定後，用DNA測序儀進行序列測定，使用QIAGEN公司提供的pQE載體測序引物。
實施例5重組質粒轉化表達宿主菌經測序的重組DNA轉化表達菌VacA P95+pQE-TriSystem→SG13009。取上述純化的重組質粒各1μl對宿主菌感受態細胞進行轉化，方法同上。最後取30μl轉化培養物塗於含100μg/ml氨苄青黴素及25μg/ml卡那黴素的LB平板上，37℃培養過夜。
PCR篩選陽性克隆，並以酶切法進一步鑑定，篩選陽性重組工程菌。
實施例6誘導表達以IPTG誘導表達目的蛋白於含100μg/ml氨苄青黴素及25μg/ml卡那黴素的LB培養液中按20∶1比例加入陽性重組工程菌過夜培養液，37℃，200rpm培養至菌液OD600＝0.8時，取出1ml作為誘導表達前的對照，加入IPTG至終濃度1mM，同樣條件下誘導培養3小時，菌液於5000rpm離心20分鐘，棄上清，-20℃保存菌體沉澱。
實施例7表達產物的鑑定(1)SDS-PAGE凝膠電泳後進行考馬斯亮藍染色，觀察表達的蛋白條帶，並用光密度薄層掃描儀定量檢測蛋白質含量。
(2)Western blot按上述方法對宿主菌進行誘導表達及SDS-PAGE後，將含表達產物的電泳凝膠於冷室中電轉印至硝酸纖維濾膜上(PoreSize0.45μm)，230mA，100分鐘。Ponceaus染色，觀察轉移蛋白條帶。封閉液為含5％脫脂奶粉的TBST溶液；一抗為Tentra-His抗體，二抗為辣根過氧化物酶聯驢抗鼠抗體，均為1∶5000稀釋；將經一抗、二抗標記的硝酸纖維濾膜在SuperSignal West PicoChemiluminescent Substrate中反應5分鐘，曝光於底片並顯影。胺基酸測序將轉印好的膜經考馬斯亮藍染色，甲醇-冰乙酸脫色後切下含目的條帶的凝膠，進行胺基酸序列測定。
實施例8表達產物的分離純化(1)包涵體的分離以裂解液裂解細胞，經超聲破碎後(冰浴下進行)，高速離心，再溶於含8M尿素的初始緩衝液中備用。
(2)金屬螯合親和層析(MCAC)純化重組蛋白所用儀器為AKTAexplorer100(Amersham pharmaciabiotech)FPLC層析儀，將溶解的包涵體直接上樣，8M尿素作為變性劑，在變性條件下純化。採用介質為亞氨二乙酸的HiTrap Chelating 5ml預裝柱(Amersham pharmaciabiotech)，以5倍體積的0.05M NiSO4過柱吸附Ni2+，0-0.5M咪唑線性洗脫，洗脫速度為2ml/min，按每管1ml自動收集洗脫液。
(3)純化產物的復性將純化的目的蛋白，4℃下分別於1000ml含4M、2M尿素的磷酸鹽緩衝液(PBS)中各透析2h，然後將透析袋移至1000ml不含尿素的PBS中，4℃透析過夜，經聚乙二醇濃縮，分裝，-20℃凍存備用。
(4)純化產物的鑑定SDS-PAGE和Western blot。具體方法見上。
權利要求
1，一種幽門螺桿菌空泡毒素抗原的製備方法其特徵在於包括如下步驟，a)提取H.pylori基因組DNA；b)通過PCR法擴增VacA P95目的基因；c)通過T4 DNA連接酶將b)所述的目的基因與一種表達載體連接，然後轉化入一種宿主；d)抽提重組質粒測序鑑定後，再將含目的基因的重組質粒轉化入表達宿主菌中，經IPTG誘導表達；e)表達產物的分離與純化。
2，如權利要求1所述的-幽門螺桿菌空泡毒素抗原的製備方法，其特徵在於所述的表達載體為PQE-TriSystem質粒。
3，如權利要求1所述的-幽門螺桿菌空泡毒素抗原的製備方法，其特徵在於所述的宿主菌為SG13009。
4，如權利要求1所述的一種幽門螺桿菌空泡毒素抗原的製備方法，其特徵在於步驟2中，通過PCR法擴增VacA P95目的基因的引物如下sense5』-CAAAGTCCCATGGCCTTTTTCACAAC-3』，antisense 5』-TTCAAACTGCAGCTCAATAGTGCC-3』；克隆位點為Nco I和Pst I。
5，如權利要求1所述的一種幽門螺桿菌空泡毒素抗原的製備方法，其特徵在於PCR反應條件為94℃熱變性4min，94℃30sec、55℃1min、72℃2.5min共30個循環，72℃延伸10min。
6，一種載體，其特徵在於所述的載體含有VacA P95目的基因。
7，一種宿主，其特徵在於所述的宿主中含有權利要求7所述的載體。
全文摘要
本發明公開了一種幽門螺桿菌空泡毒素抗原的製備方法，將空泡毒素抗原基因構建於pQE－TriSystem質粒，可根據所需目的蛋白的不同用途靈活選用表達系統，而避免了更換載體的繁瑣步驟。
文檔編號C12N15/63GK1552865SQ03128860
公開日2004年12月8日 申請日期2003年5月27日 優先權日2003年5月27日
發明者蕭樹東, 鄭青, 朱紅音 申請人:上海第二醫科大學附屬仁濟醫院