氣孔保衛細胞特異性啟動子的製作方法

2023-06-21 08:09:56 1

專利名稱：氣孔保衛細胞特異性啟動子的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組核酸在植物中的表達。更具體而言，本發明提供了用於在氣孔保衛細胞中選擇性表達核酸的啟動子、含有該啟動子的基因構件、帶有它們的表達載體和與用其轉染的植物。核酸在植物保衛細胞中的選擇性表達使得可以調節氣孔的打開/關閉狀態，由此調節例如增加植物對不利環境條件或氣候條件的抵抗力。
背景技術：
用於產生轉基因植物的組織特異性啟動子植物轉化技術的最新進展為提高產量提供了新的機會。按照轉基因方法，可以在植物中引入有利於增加植物產量、產品質量和提高植物對不利氣候條件和病原體抵抗力的新性狀。此外，轉基因植物可用於生產重組蛋白、生物聚合物、藥物、疫苗或抗體(L.Lanfranco，Riv Biol.，2003，9631-54；Dunwell JM，J.Exp.Bot.，2000，51487-496)。
在植物中生產重組蛋白需要使用能夠指導轉基因在植物組織中正確表達的啟動子。迄今為止，建議用於產生轉基因植物的啟動子數量有限。它們中的大部分是組成型啟動子，例如來自花椰菜花葉病毒(CaMV35S)的35S啟動子(Odell等人，Nature，1985，313810-812)或泛素啟動子(Holtorf等人，Plant Mol.Biol.，1995，29637-646)。
與指導重組蛋白在所選擇組織或器官中產生的組織特異性啟動子不同，這類啟動子的缺點在於它們在幾乎所有植物組織中有活性，因而妨礙了在轉基因株系的特殊器官或特定生長階段進行轉基因的選擇性表達。例如，涉及多餘物質在種子中積累的啟動子，如菜豆鹼(Bustos等人，PlantCell，1989，1839-853)或2S清蛋白(Joseffson等人，J.Biol.Chem.，1987，26212196-12201)，指導轉基因進行種子特異性表達。核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基的啟動子或馬鈴薯ST-LSI啟動子指導轉基因進行葉特異性表達(Stockhouse等人，EMBO J.，1989，82445)。儘管在文獻中已經報導了許多其它的組織特異性啟動子或器官特異性啟動子，但僅少數對所確定植物細胞類型表現出選擇性。這些啟動子應當指導轉基因表達局限於植物器官的特殊細胞中。
氣孔解剖學和功能氣孔是陸生植物氣生器官表面存在的小孔。這些結構在調節植物器官和大氣之間的氣體流動中起著重要的作用，其允許光合作用所需的CO2流入或者通過蒸騰作用丟失水分。氣孔由兩個被稱為保衛細胞的高度特化的表皮細胞組成，其運動決定了氣孔縫裂的打開/關閉(


圖1)。
氣孔的打開程度反映了對用於光合作用的CO2的需要與可提供水分之間的平衡。因此，並不奇怪，陸生植物發展出了複雜的調節機制，作為對環境刺激或內源信號的響應來調節氣孔打開/關閉過程(Wilmer和Fricker，1996，Stomata，Ed Chapman和Hall，London，1-375)。
保衛細胞的形狀是由膨壓改變誘發的體積變化決定的。反過來，膨壓是由細胞腔中諸如K+和Cl-的無機溶質或者諸如蔗糖或蘋果酸鹽的有機溶質的交換而誘導的(Schroeder等人，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，2001，52627-6658)。有利於光合活性的條件，例如存在光和升高的CO2濃度，會促進保衛細胞中溶質的積累，由此增加的膨壓誘導氣孔打開(
圖1A)。
相反，在缺水條件下，植物激素脫落酸(ABA)誘導保衛細胞的膨壓迅速下降，該過程源自K+、Cl-和蔗糖的流失以及由蘋果酸向無滲透壓作用的澱粉的轉化，由此導致氣孔關閉(
圖1B)。
由ABA積累介導的氣孔縫隙減小代表著植物對抗乾旱的主要適應性反應，其能夠使因蒸騰作用引起的水份流失降到最低(Wilkinson和Davies，Plant Cell Env.，2002，25195-210)。近來，隨著藥理學和遺傳學方法的發展，已在保衛細胞中鑑定出許多ABA信號傳導級聯反應中的成分。
ABA誘導的氣孔關閉涉及胞質Ca++濃度增加、陰離子通道激活、胞質pH值和鉀通道活性改變、氧活性分子的產生、磷酸酶和激酶以及諸如異源三聚體G蛋白、法尼基轉移酶和mRNA帽子結合蛋白的其它蛋白質的調節(Schroeder等人，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，2001，52627-6658)。
對激素信號傳導機制的調節對氣孔的打開/關閉具有直接影響，這為產生抗不利環境或氣候條件、尤其是乾旱的、且CO2交換得到優化(並且因此光合作用過程得到優化)的作物提供了的有價值的手段。
背景技術：
由ABA誘導的氣孔內信號傳導的調節使保衛細胞能夠針對環境刺激改變生理響應。涉及氣孔閉合機制的許多成分是已知的。然而，對氣孔活性的調節受限於保衛細胞特異性的啟動子的低可用性。
儘管在文獻中已經描述了在保衛細胞中具有功能的大量的啟動子序列，其中沒有一個具有充分的選擇性。涉及對氣孔縫隙調節的擬南芥屬(Arabidopsis)基因啟動子，例如Osm1(Zhu等人，Plant Cell，2002，143009-3028)、Abh1(Hugouvieux等人，Cell，2001，106477-487)、Rac1(Lemichez等人，Genes Dev.，2001，151808-1816)、Kat1(Anderson等人，Proc.Natl.Acd Sci.U.S.A.，1992，893736-3740)、Ost1(Mustilli等人，Plant Cell，2002，143089-3099)、Chl1(Guo等人，Plant Cell，2001，131761-1777)，不僅在保衛細胞具有活性而且在不同的細胞類型和植物器官中也具有活性。缺乏選擇性妨礙了這類啟動子在產生具有改變的氣孔活性的轉基因植物中的應用。
除了調節氣孔關閉，ABA還調節植物生理和生長的許多方面，包括種子潛伏期、貯藏蛋白和脂質的合成、相變和對創傷或病原體的反應(Finkelstein等人，Plant Cell，2002，S15-S45)。
使用非特異性的啟動子使激素信號傳導調節因子異位表達時可以在包括氣孔保衛細胞在內的不同植物組織和器官中引起改變的反應。結果產生缺損和異常，從而負面影響植物的生理機能、生長和生產力。
發明簡述本發明提供了一種通過使用AtMYB60基因啟動子序列(Atlg08810；cDNA序列置於GenBank登錄號AF062895中)使核酸在植物氣孔保衛細胞中選擇性表達的方法。具體而言，本發明基於以下發現，即AtMYB60啟動子的不同區域能夠使核酸在氣孔保衛細胞進行ABA響應性或ABA非依賴性的選擇表達。
根據第一個實施方案，本發明提供了用於在植物氣孔保衛細胞中選擇性表達核酸序列的基因構件或表達盒，所述構件或表達盒含有與AtMYB60基因的啟動子序列(SEQ ID No.1)或其片段或變異體功能性連接的核酸序列，所述變異體與SEQ ID No.1具有至少80％、優選至少90％、更優選至少95％的序列同一性，其前提條件是所述片段或變異體保留了對核酸轉錄的啟動子活性。
根據優選的實施方案，本發明的構件或表達盒包含全長AtMYB60啟動子序列(SEQ ID No.1)的片段，該片段選自SEQ ID No.2(從SEQ ID No.1的核苷酸(nt)1045到1291)、SEQ ID No.3(從SEQ ID No.1的核苷酸(nt)689到1291)和SEQ ID No.4(從SEQ ID No.1的核苷酸(nt)293到1292)。
儘管從SEQ ID No.1的nt 1045延伸到1291的片段呈現出ABA非依賴的啟動子活性，更大片段、特別是包含了SEQ ID No.3和4的片段以及全長啟動子(SEQ ID No.1)的活性可被脫落酸下調。因此，根據本發明，可應用不同的基因構件或表達盒以ABA依賴或ABA非依賴方式調節核酸的氣孔特異性表達。
本發明的表達盒或構件除了包含具有轉錄啟動子活性的AtMYB60基因區以外，還可包含涉及轉錄調節的基因元件，例如內含子、基因3』末端的多聚腺苷酸化位點、轉錄激活因子或增強子、終止序列、選擇標記和前導序列。
任何核酸可以與AtMYB60啟動子有效連接並插入本發明的表達盒或構件中。具體而言，在表達盒構建中可使用編碼序列和非編碼序列。所編碼的產物，無論是肽、蛋白質還是RNA轉錄物，優選涉及由脫落酸(ABA)調節的細胞內信號傳導途徑以及調節氣孔打開/關閉狀態的細胞機制。
根據本發明的優選實施例，AtMYB60啟動子、其片段或變異體功能性連接於i)涉及控制氣孔縫隙的基因，具體是Osm1、Rac1、Kat1、Ost1和Chl1基因(見上面的各自參考文獻)，ii)涉及控制光誘導氣孔打開的基因，具體是保衛細胞的藍光受體PHOT1和PHOT2基因(Kinoshita T等人，Nature.2001，414656-60)、編碼14-3-3蛋白的基因(BaunsgaardL等人，Plant J.1998，13661-71)、和雙親和性硝酸鹽轉運蛋白的基因AtNRT1.1(CHL1)(Guo FQ等人，Plant Cell.2003，15107-17)，iii)涉及控制ABA誘導的氣孔關閉的基因，具體是編碼下列蛋白的基因2C型蛋白磷酸酶ABI、ABI2和AtP2C-HA(Leung J等人，Plant Cell.1997，9759-71；Leonhardt N等人，Plant Cell.2004，16596-615)、PP2A蛋白磷酸酶RCN1(Kwak JM等人，Plant Cell.2002，142849-61)、AAPKCa++非依賴的蛋白激酶OST1(Mustilli AC等人，J.Plant Cell.2002，143089-99)、類SOS3鈣結合蛋白SCaBP5和它的相互作用蛋白激酶PKS3(Guo Y等人，Dev Cell.2002，3233-44)、AtrbohD和AtrbohF NADPH氧化酶(Kwak，J.M.等人，EMBO J.，2003，222623-33)、GTP酶AtRac1(Lemichez E等人，Genes Dev.2001，151808-16)、GTP結合蛋白α亞基GPA1(Wang XQ等人，Science.2001，292922070-2)、突觸融合蛋白OSM1/SYP61(Zhu，J.等人，Plant Cell，2002，143009-28)、法尼基轉移酶β亞基ERA1(Pei ZM等人，Science.1998，282287-90)、硝酸鹽還原酶NIA1和NIA2(Desikan R等人，Proc Natl Acad Sci USA.2002，9916314-8)、K+in通道KAT1、KAT2、AKT2(Kwak JM等人，Plant Physiol.2001，127473-85)、K+out通道GORK(Hosy E等人，ProcNatl Acad Sci USA.2003，1005549-54)、核RNA帽子結合複合體ABH1亞基(Hugouvieux V等人，Cell.2001，106477-87)、類Sm的snRNP蛋白質SAD1(Xiong L等人，Dev Cell.2001，1771-81)和同源異型框亮氨酸拉鏈轉錄因子ATHB6(Himmelbach A等人，Grill E.，EMBO J.2002，213029-38)。
備選地，控制在宿主細胞中行使特殊功能的RNA轉錄物產生的核酸序列、尤其是反義RNA和siRNA可以插入到本發明的表達盒或構件中。
如本文所使用，「功能性連接的」和「有效連接的」指構成本發明表達盒或構件的啟動子和核酸是以使得啟動子能夠指導核酸表達的方式相互定位，通常是5』-3』方向。
在另一方面，本發明還涉及帶有本文提供的基因構件或表達盒的表達載體。該載體可以是細菌質粒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、病毒載體、用於DNA直接轉移的載體、或優選的用於農桿菌(Agrobacterium)介導的DNA轉移的載體。後者可以是整合載體或雙元載體，並且可包含選擇標記例如抗生素抗性基因或除草劑抗性基因、有利於鑑定和篩選轉化細胞的報告基因或者調節植物中基因表達的序列。
DNA直接轉移可包括原生質體顯微注射、電穿孔和基於用DNA包被的微粒轟擊植物的生物射彈技術。
在另一方面，本發明還提供了含有本發明基因構件的轉基因植物(單子葉植物或雙子葉植物)及其營養部分或繁殖部分或者種子。在優選的實施方案中，本發明的構件或表達盒用於在密切相關的作物物種，例如油菜及包括大豆、番茄、菸草、馬鈴薯、棉花的其它雙子葉植物或者諸如玉米、小麥、大麥、水稻的單子葉植物種的保衛細胞中表達蛋白質。
用轉基因載體或裸DNA轉化植物的方法是本領域技術人員所熟悉的。例如，處於萌芽期的種子、幼苗或成體植物可用帶有異源基因構件的農桿菌感染並在適宜條件下生長。
精細調節氣孔功能的可能性為產生能夠有效響應氣候改變的植物提供了重要手段。具體而言，該可能性，即抑制ABA刺激的反應由此增加氣孔打開程度和因此導致的光合作用過程所需CO2的流入，對於在水源並非環境限制因素地區種植的植物而言尤其重要。相反，減少氣孔縫隙以避免蒸騰作用引起的水分丟失對於在乾旱地區種植的植物尤其有益。
發明詳述AtMYB60啟動子序列的特徵AtMYB60是擬南芥R2-R3MYB轉錄因子大家族的成員。為了檢測生長於標準條件下的野生型擬南芥植物中的表達情況，將位於轉錄起始密碼子上遊或終止密碼子下遊的基因間區域的不同部分分別克隆到GFP(綠色螢光蛋白)和GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)報告基因的上遊和下遊(圖2B)。
將如此獲得的構件導入擬南芥，所產生的轉基因株系用於組織學分析以檢測報告基因的表達範圍。在所有經過檢測的樣品中，僅在具有氣孔的全部植物氣生器官的保衛細胞中發現報告基因的表達(圖3-6)。
經p1.3-2.2:GUS構件轉化的株系將對應於1號染色體的nt 2821639(Atlg08820基因的3』UTR序列)和nt 2820349(AtMYB60基因-Atlg08810的3』UTR序列)之間基因組區域的互補和倒轉序列克隆入GUS報告基因的上遊(圖2A、B和圖7)，這裡所提到的名稱是依照http//www.arabidopsis.org上的「擬南芥信息資源」所用的命名法。
AtMYB60下遊的且由終止密碼子與Atlg08800的5』UTR之間區域組成的基因間區域被插入同一GUS報告基因的下遊(圖2A、B)。在該構件中所用的基因組區域包含完整的AtMYB60啟動子和位於3』區的假定調節元件。
隨後，通過用p1.3-2.2:GUS構件轉化得到T2植物，分析T2植物以確定報告基因的表達情況。僅在提供該解剖結構和任何生長階段的所有植物器官的氣孔保衛細胞中發現GUS染色(圖3)。下文將詳細描述與植物不同部分和不同生長階段相關的結果。
幼苗在4天和7天時，即分別在子葉伸展階段和在葉出現時期分析幼苗。在子葉、初生葉和下胚軸的氣孔保衛細胞中觀察到強的GUS染色(圖3)。在初生根和它的側枝上沒有發現染色。
成體植物分析7周齡植物的營養器官和生殖器官。GUS染色存在於來自基生蓮座葉、莖生葉和莖的氣孔保衛細胞中(圖4A、B、C)。
對於花器官，發現在萼片、雌蕊、花葯的氣孔保衛細胞和在未成熟的長角果中檢測到GUS染色(圖4D、E、F、G)。在缺乏氣孔的花瓣上未發現任何染色。
經p1.3:GUS、p0.9:GFP、p0.6:GUS、p0.2:GUS和p189:GUS構件轉化的株係為了證實從p1.3-2.2:GUS構件轉化的植物所獲得的結果並且為了確定對於指導報告基因進行氣孔特異性表達必需且足夠的基因組區域，製備如下構件(圖2B)。
-p1.3:GUS，含有與在p1.3-2.2GUS中使用相同的AtMYB60上遊基因間區域，該區域被克隆在GUS報告基因前面。
-p0.9:GFP，含有AtMYB60上遊999bp的基因組片段，該片段被克隆在GFP報告基因前面(GFP活性可通過共聚焦顯微鏡方法檢測)。
-p0.6:GUS，含有AtMYB60上遊603bp的基因組片段，該片段被克隆在GUS報告基因前面。
-p0.2:GUS，含有AtMYB60上遊246bp的基因組片段，該片段被克隆在GUS報告基因前面。
-p189:GUS，含有AtMYB60上遊189bp的基因組片段，該片段被克隆在GUS報告基因前面。
如圖5所示，除了p189:GUS之外，所有被分析的構件表現出的表達情況與用p1.3-2.2:GUS構件轉化的植物中的表達情況相同。僅在來自全部幼苗或具有氣孔縫隙的植物結構的氣孔保衛細胞中存在兩種報告基因活性。
具體而言，用共聚焦顯微鏡分析來自p0.9:GFP轉化株系，明確顯示出報告基因的表達局限於氣孔保衛細胞，在任何其它細胞類型中沒有信號(圖6)。
ABA誘導的對報告基因表達的調節近來研究表明，由脫落酸(ABA)介導的轉錄調節代表對氣孔生理反應的重要控制。因此，在上述轉基因株系中檢測施用外源ABA對GUS和GFP報告基因表達的影響。用半定量RT-PCR開展表達分析，結果表明，施用ABA可顯著降低p1.3-2.2:GUS、p1.3:GUS和p0.6:GUS株系中GUS報告基因轉錄物的水平(圖7)。使用p0.9:GFP株系的GFP報告基因得到了同樣的結果。相反，用ABA處理的p0.2:GUS株系中GUS表達未見改變(圖7)。這些結果表明，與AtMYB60啟動子(SEQ ID No.1)融合的基因的表達被ABA下調。此外，這些結果還表明，負責負向轉錄調節的順式元件位於AtMYB60翻譯起始密碼子上遊核苷酸-603到-246之間。
因此，完整的啟動子序列SEQ ID No.1或包含ATG密碼子上遊246bp部分的片段能夠使轉基因在氣孔保衛細胞中以ABA非依賴方式表達。
附圖簡述
圖1-氣孔解剖學及功能存在於擬南芥植物葉表面的氣孔的光學顯微鏡照片(標尺＝5μm)。存在於土壤植物大多數氣生器官表皮上的氣孔由兩個高度特化的保衛細胞(g)形成。保衛細胞中的膨壓改變引起氣孔縫裂打開(A欄)或關閉(B欄)。
圖2(A)含有AtMYB60基因的基因組區域示意圖。顯示了Atlg08820基因最後一個外顯子的末端部分、AtMYB60(Atlg08810)編碼區的三個外顯子和Atlg08800基因第一個外顯子的起始部分。
(B)含有GUS和GFP報告基因的構件示意圖，報告基因受從Atlg08820到AtMYB60之間不同部分的基因間區域的控制。p1.3-2.2:GUS構件還包含從AtMYB60和Atlg08800之間的全部基因間區域，此段序列被插入到GUS報告基因下遊。每一基因組區域的長度用bp數值表示。
圖3-在來自用p1.3-2.2:GUS構件轉化株系的幼苗中，GUS報告基因的氣孔特異性表達A)報告基因GUS在第4天幼苗中的表達。僅在子葉(c)和下胚軸(i)的氣孔保衛細胞中存在染色。在根(r)中沒有染色信號。
B)子葉(細節)。
C)7天幼苗的葉表皮(細節)。
圖4-在來自用p1.3-2.2:GUS構件轉化株系的成體植物中GUS報告基因的氣孔特異性表達A)報告基因GUS在7周成體植物葉中的表達B)葉(細節)C)莖(細節)D)成熟花序GUS染色僅存在於萼片的氣孔E)成熟花GUS染色僅存在於萼片、花葯和雌蕊的氣孔F)雌蕊(細節)G)花葯(細節)。
圖5-在來自用p1.3:GUS、p0.6:GUS、p0.2:GUS和p189:GUS構件轉化株系的成體植物中GUS報告基因的表達不同構件轉化株系的染色實例A)和B)4天幼苗C)蓮座葉D)莖F)成熟花G)和H)經p189:GUS構件轉化植物的蓮座葉氣孔。
圖6-在來自用p0.9:GFP構件轉化株系的成體植物中GUS報告基因的氣孔特異性表達A)GFP報告基因在7周成體植物葉中的表達(標尺＝1μm)B)用共聚焦顯微鏡檢測的GFP報告基因在莖中的表達(標尺＝20μm)
C)用共聚焦顯微鏡檢測的葉氣孔的細節(標尺＝2μm)圖7-用ABA處理的植物中GUS和GFP報告基因的表達轉基因株系用100μM ABA處理6小時，RT-PCR分析GFP和GUS報告基因的表達。TSB1基因用作對照。
材料和方法植物生長用於盤內生長的種子滅菌步驟如下無水乙醇5分鐘，含0.6％(v/v)次氯酸鈉、0.05％吐溫20的溶液5分鐘，無菌水衝洗兩次。將種子重懸於0.1％的瓊脂糖無菌溶液，置於陪替氏培養皿中萌發，培養皿內含有0.7％瓊脂化的MS培養基(Sigma M-5519)並添加了1％的蔗糖，pH 5.7。培養皿於4℃黑暗中放置4天使其統一萌發，而後放置於22℃、16小時光照(48μE/m2)和8小時黑暗周期中培養。
用於土培生長，將種子在4℃黑暗中放置4天，而後在置於Araflat盤(Arasystem，Betatech，Belgium)或培養瓶的Einheitserde土壤(VM-型，Manna-義大利)中萌發，以16小時光照(48μE/m2)-8小時黑暗周期培養。
基因組DNA提取生長於培養盤中的幼苗以及取自土培植物的花或葉放入Eppendorf管並在液氮中冷凍。組織在500μl提取緩衝液(7M尿素、350mM Na2SO4、50mM Tris pH 8.0、8mM EDTA、34mM的N-十二烷基肌氨酸鈉)用固定在臺鑽上的塑膠頭切碎。然後加入等體積的苯酚和氯仿(1∶1v∶v)，經渦旋混合後以13000轉/分離心樣品5分鐘。將上清液置於乾淨的管中，加入400μl蒸餾水和0.7倍體積的異丙醇。在13000轉/分離心樣品10分鐘沉澱DNA。吸去異丙醇，用300μl的80％乙醇洗滌沉澱。移去乙醇，將DNA重懸於40μl的50mM Tris-HCl pH 8.0，20μg/ml的5mM EDTA中。加入2μl的20mg/ml的Rnase A(Boehringer)，並將樣品於37℃孵育30分鐘。將提取的DNA保存於-20℃。
AtMYB605』和3』基因組區域的擴增P60R5NEW引物(5』TCGGATCCTCTAGATCTCTCTG 3』)與下表所報導的引物組合用於擴增AtMYB60基因上遊的不同部分區域。在P60R5NEW引物中引入了一個BamHI限制性酶切位點(GGATCC)。
序列AAGCTT對應著HindIII限制性酶切位點，引入該位點以利於基因組片段的克隆。
使用引物60-3』UTRF2(5』CACTTGATGGAGCTCTCTAATATG 3』)和60-3』UTRR1(5』CTGCAGACGTTTGTCTAGTAG 3』)擴增了長度為2219bp的3』基因組區域。
使用0.5μg基因組DNA開展PCR反應，反應混合物含有Red TaqPCR反應緩衝液1×(Sigma)，dATP、dCTP、dGTP和dTTP(每種5mM)，引物(每種25μM)，1單位Red TaqTM聚合酶(Sigma)，並用無菌蒸餾水補足終體積為25μl。擴增反應進行如下94℃下1分鐘；94℃下15秒，在對所用引物對特異性的退火溫度下15秒，72℃下1分鐘，共40個循環；72℃下10分鐘。反應產物用緩衝液為TBE 1×(89mM Tris-鹼、89mM H2BO3、2mM EDTA pH 8)的1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離，UV透射儀分析。將獲得的條帶從瓊脂糖凝膠上切下，用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Quiagen)並按照產品說明書純化。
含有與報告基因融合的不同基因組區域的構件的製備-p0.9:GFP構件按照產品說明書，將999bp的基因組片段克隆入pCRII-TOPO載體(Invitrogen)。隨後，用EcoRI將片段切割下來，使用Klenow(Roche)並按照產品說明書將片段末端平端化。將如此獲得的片段插入到事先用HindIII消化並用Klenow處理的含GFP報告基因的雙元載體pBINmGFP-ER中。
-p1.3-2.2:GUS構件按照產品說明書，將1291bp的基因組片段克隆入pCR4-TOPO載體(Invitrogen)。隨後用HindIII、BamHI切割下該片段，並將其克隆入含GUS報告基因的雙元載體pBI101.3(Stratagene)的HindIII、BamHI位點，產生p1.3:GUS載體。將對應於AtMYB60的3』區域的2219bp的基因組片段插入pCRII-TOPO載體，隨後用EcoRI酶切。將由此產生的EcoRI片段插入p1.3:GUS載體的轉錄終點下遊的EcoRI位點，以產生p1.3-2.2:GUS載體。
-p0.6:GUS構件按照產品說明書，將603bp的基因組片段克隆入pCR4-TOPO載體(Invitrogen)。隨後用HindIII、BamHI切割下該片段，並將其克隆入載體pBI101.3(Stratagene)的HindIII、BamHI位點。
-p0.2:GUS構件按照產品說明書，將246bp的基因組片段克隆入pCR4-TOPO載體(Invitrogen)。隨後用HindIII、BamHI切割下該片段，並將其克隆入雙元載體pBI101.3(Stratagene)的HindIII、BamHI位點。
-p189:GUS構件按照產品說明書，將189bp的基因組片段克隆入pCR4-TOPO載體(Invitrogen)。隨後用HindIII、BamHI切割下該片段，並將其克隆入雙元載體pBI101.3(Stratagene)的HindIII、BamHI位點。
植物轉化屬於哥倫比亞生態型的野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)生長於22℃、光周期為16小時光照/8小時黑暗的條件下。為了增加種子產量，將植物的一級花序去除，植物繼續生長5-6天直到長出二級花序。在轉化前，將所有的長角果除去。按照Clough-Bent的方法(Clough和Bent，Plant J.，1998，16735-743)，通過「浸花法」用農桿菌屬GV3101株轉化植物。
來自轉基因植物的無菌的T1種子於4℃黑暗放置4天，隨後在已添加0.8％細菌培養用瓊脂(Difco 0141-01)pH 5.7和100μg/ml卡那黴素的MS土壤(Sigma M-5519)中萌發。植物在22℃、光周期為16小時光照/8小時黑暗的條件下生長。
GUS分析將幼苗、蓮座葉和莖生葉、莖、花序和長角果放於含有2.0ml GUS-染色溶液(100mM磷酸鈉pH 7.0、0.1％Triton X-100、1mg/ml X-gluc、0.5mM亞鐵氰化物)的微量滴定板孔內。微量滴定板真空乾燥10分鐘，於37℃黑暗孵育過夜。去除GUS染色溶液，用無水乙醇洗滌組織數次，時間達1小時，直到染色被完全除去。將組織保存於-20℃的70％乙醇中。
用OLYMPUS SZX12體視鏡(7×-90×放大倍數)檢測報告基因表達情況。
共聚焦顯微鏡分析將用於共聚焦顯微鏡分析的樣品置於帶有蓋玻片的載玻片上(COVERWELL PERFUSION CHAMBER OBLONG-Sigma)，樣品浸於含有0.3％脫乙醯吉蘭糖膠、1％蔗糖和1/2MS pH 5.8(GELRITEGELLANGUM Sigma)的溶液中。然後，將組織玻片倒置。
用TCS NT共聚焦顯微鏡(LEICA)進行分析，該顯微鏡配備有一個帶有用於GFP(激發光為488nm，發射光為519nm)的濾光片的氬氪雷射器。在不同放大倍數下的重複掃描數次。
ABA處理和RT-PCR分析用上述方法將來自不同轉基因植物株系的種子滅菌，並置於含有1％蔗糖和0.5g/L MES的液體MS土壤中萌發。在連續振蕩(120轉/分)條件下生長三周後，加入終濃度為100μM的ABA。用於mRNA提取的組織在0時間和處理後6小時取出。通過在500μl提取緩衝液(1M Tris HClpH 9、20％十二烷基硫酸鈉、4M LiCl和10mM EDTA)中將冷凍組織切碎來提取總RNA。
經過苯酚、氯仿抽提後，在4M LiCl中於4℃沉澱RNA，用70％乙醇洗滌RNA並重溶於焦磷酸二乙酯(1‰DEPC)處理水中。用Dnase I(15單位-Boheringer Mannheim)並按照製造商的方法將5μg總RNA處理30分鐘。使用反轉錄酶SuperscriptTMII(Life Technologies)並按照產品說明書開展反轉錄反應，反轉錄所用引物為由17個dT殘基和接頭5』-GGGAATTCGTCGACAAGC-3』形成的Oligo(dT)引物。將cDNA樣品進行擴增，PCR反應混合物包含Red Taq PCR反應緩衝液1×(Sigma)和5mM dATP、dCTP、dGTP及dTTP、25μM特異性引物(見下表)、1單位RED TaqTM聚合酶(Sigma)，並用無菌蒸餾水補足終體積為25μl。擴增反應條件如下94℃下1分鐘；94℃下15秒，60℃下15秒，72℃下1分鐘，20個循環；72℃下10分鐘。PCR產物用1％瓊脂糖凝膠分離，在0.4N NaOH條件下轉移至Hybond N+濾膜(Amersham)。濾膜用TSB1特異性探針、GUS特異性探針或GFP特異性探針雜交，探針由下表列出的引物擴增獲得，並使用DIG-High Prime試劑盒(Roche)並按照產品說明書進行地高辛標記。
序列表110米蘭大學(UNIVERSITA』DEGLI STUDI DI MILANO)120氣孔保衛細胞特異性啟動子1307170meur16018170PatentIn版本3.121012111291212DNA213擬南芥(Arabidopsis thaliana)4001cacaaggaca caaggacata tggtatgatg atatgctttg tttctctgct tctcttacta 60atttgaagct gttggattga tttgtctctt cttacgttcc cttctttttt ttttcgtttt120cttttgtcgt atagaccagg caggggctag ggcctagtga tgggtattgg cccaatacta180ttgggttatt tgcctggttt attatttcga ttttaggtta attcaatttt aagaatacgt240agatttgttt ggtttagttt ggtttggttg cactaagttc ggttttacat aaatagaatc300taacactact aattgttata cgtaaaatac aacaacaata acagattttt cgtttcaatt360ttcgtttaag agggtagaca ttttggtttg gtttggttca tttttttttt ccctttcaaa420ttcacatcct tcacgtagat gacaaaataa agaaaaacat gaatgaaagt tgtaacttgt480aagcatcaac atggaaatca tatcacaaag aacacaaatc taactaatgg gtcttttcac540atattggtat aattataagt tgtaagaata ttagttaaac agaggcaacg agagatgcgt600gatatatgaa aagttgaaaa caaaagacat ggatctaaag agtcaagcaa aatgtaatat660
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223人工合成的引物
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223人工合成的引物40018ctgtggaatt gatcagcgtt g 2權利要求
1.用於核酸序列在植物氣孔保衛細胞中選擇性表達的基因構件，所述構件包含與啟動子SEQ ID No.1或具有啟動子活性的其片段或變異體功能性連接的核酸序列。
2.根據權利要求1所述的構件，其中所述啟動子片段包含SEQ ID No.2。
3.根據權利要求1所述的構件，其中所述啟動子片段包含SEQ ID No.3。
4.根據權利要求1所述的構件，其中所述啟動子片段包含SEQ ID No.4。
5.根據權利要求1所述的構件，其中核酸序列或所編碼產物涉及受脫落酸(ABA)調節的細胞內信號傳導途徑。
6.根據權利要求5所述的構件，其中所述核酸序列包含Osm1、Rac1、Kat1、Ost1或Chl1基因的編碼序列。
7.根據權利要求5所述的構件，其中所述核酸序列編碼反義RNA。
8.包含根據權利要求1-7的基因構件的植物表達載體。
9.根據權利要求8所述的載體，該載體是細菌質粒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、病毒載體或用於農桿菌(Agrobacterium)介導DNA轉移的載體。
10.根據權利要求9所述的載體，該載體是用於農桿菌介導DNA轉移的雙元載體。
11.包含根據權利要求8-10的載體或根據權利要求1-7的基因構件的單子葉植物或雙子葉植物。
12.根據權利要求1-7的基因構件或者根據權利要求8-10的載體的用途，其用於核酸序列在氣孔保衛細胞中選擇性表達。
13.根據權利要求12所述的用途，其中所述異源序列涉及對氣孔打開/關閉的調節。
14.調節核酸序列在植物中表達的方法，其包括向所述植物、其營養部分或繁殖部分導入根據權利要求1-7的基因構件或根據權利要求8-10的載體。
全文摘要
本發明提供了包含用於核酸序列在植物氣孔保衛細胞中選擇性表達的AtMYB60基因啟動子的基因構件、包含它們的載體和宿主植物。
文檔編號A01H5/00GK1922327SQ200580005975
公開日2007年2月28日 申請日期2005年2月23日 優先權日2004年2月27日
發明者C·託奈裡, M·加爾比亞蒂 申請人:米蘭大學