一種人工納米紅細胞的製備方法
2023-06-21 07:50:21 1
專利名稱：一種人工納米紅細胞的製備方法
技術領域：
本發明屬於人紅細胞代用品技術領域，涉及一種人工納米紅細胞的製備方法。
背景技術：
近年來，全世界範圍內臨床用血量迅速增加，頻繁出現的血荒使得血液短缺已達 到危機的程度。此外，在突發突大自然災難、戰爭和恐怖事件等一些系特殊環境下，大批傷 員需同時輸血治療時將導致這一供求矛盾急劇增加。據估計，即使和平時期，全世界每年約 需要1500萬升新鮮血液，而且還呈明顯增長趨勢。我國每年醫療用血量近130萬升，每年 還以7 9%的速度遞增。頂尖級科學家們均認為，人工血液是解決這一臨床危機的唯一出 路。與新鮮異體血液比較，人工血液具有無表面抗原，不需要交叉配血，避免了輸血反 應，避免了病原微生物的汙染和交叉感染，還具有不在依賴人體供血，取材方便，來源廣泛， 容易儲存，保質期長、運輸方便，價格低廉，可充足供應等優點。為此，安全、有效、可大批量 生產的人工血液具有廣闊的市場應用前景。也是二十一世紀國際關注的研究熱點，醫藥產 品開發的重大領域。人造紅血球，也稱人紅細胞代用品(human red cell substitutes)，是具有氧傳 遞功能、維持血液滲透壓和酸鹼平衡及擴充容量的人工製劑。理想的血液代用品要求具有 天然紅細胞的傳遞氧功能、生物相容性、安全性和穩定性。具體為(1)具有較高的攜氧能 力，氧分壓在正常生理範圍內，能有效向組織供氧；(2)與人血液所有組分具有良好的生物 相容性；(3)能維持血液滲透壓、酸鹼平衡、粘稠度和血容量；(4)無免疫原性(無致敏原 性)、無血液病原微生物汙染、無熱源；(5)體內循環半壽期在24h以上，在正常灌注條件下 不產生腎毒性等副作用；(6)在低溫條件下，產品保質期大於6個月；(7)具有預期的可清 除性。同時，作為一種產品，它的市場生命力還取決於同現行輸血用血液相比的更合適的價 效比，安全度以及保質期。至目前為止，國內外血液代用品研製與發展經歷三代產品。第一代主要以氟碳化 合物類為代表；第二代是以改性血紅蛋白(Hb)為代表，主要包括修飾Hb(又分成內交聯 Hb、多聚Hb和高分子化合物共軛Hb)和利用分子遺傳工程產生的重組Hb ；第三代產品為微 囊化的人工紅細胞。可降解高分子血紅蛋白微囊血液代用品不僅能夠克服第一、二代修飾 血紅蛋白血液代用品無細胞膜屏障的缺點，同時解決了脂質體微囊血液代用品力學性能和 小分子物質通透性差的缺點，是一種具有發展前景的血液代用品。現有兩類微囊化的血液代用品正在研究開發之中一類是氟碳化合物氧載體 (PFBOCs)，別一類是血紅蛋白氧載體(HBOCs)。前期臨床研究表明，這兩類產品可用於具部 分恢復血液攜O2功能，防止或恢復低血容量及其引起的器官衰竭等作用，但突出的缺點是 氧的釋放，代謝產物毒性等問題將嚴重限制其進一步發展。國內在可降解高分子血紅蛋白 微囊血液代用品方面的研究起步較晚，而國際上比較有代表性的Chang TMS等報導，採用聚 合物包埋血紅蛋白的路線，但重要的攜氧性指標P5tl為32mmHg，說明氧的親和力略有下降，並且包封率也較低，只有29 47%，血紅蛋白利用率不高。納米技術的發展為設計合成更適應人體需要的紅血球模擬物提供了有力的工具。 低環境負荷、低能耗、低成本製造高度功能納米粒是目前研究的熱點，其中自組織方法能很 好滿足這種需求該方法由兩親性高分子材料在水介質中發生微相分離，形成具有疏水性 內核與親水性外殼的納米膠束，可作為各種藥物的載體。目前，通過雙親性聚合物通過自 組裝可獲得尺寸均一，形態完美的納米膠束。以往包裹材料主要是人工合成的高分子生物 可降解脂溶性材料，這類材料因存在毒性和易被吞噬細胞所吞噬等問題影響了其進一步發 展。
發明內容
本發明解決的技術問題在於提供一種人工納米紅細胞的製備方法，以改性澱粉作 為包裹材料，通過納米自組裝包裹血紅蛋白，形成微囊化的人工納米紅細胞。本發明是通過以下技術方案來實現一種人工納米紅細胞的製備方法，包括以下步驟 1)將澱粉溶解後，與其質量2 8倍的油酸在催化劑催化下進行酯化反應，待充分 反應後，分離反應生成的澱粉-油酸接枝聚合物；2)將澱粉_油酸接枝聚合物溶於二甲基亞碸，得到澱粉_油酸接枝聚合物溶液；將澱粉-油酸接枝聚合物質量1/8 1倍的血紅蛋白分散於生理鹽水中，並加入 生理鹽水體積1 10%的吐溫-20，震蕩混勻並排除氧氣後，在冰浴條件下，滴入澱粉-油 酸接枝聚合物溶液，然後將超聲探頭伸入混合溶液的液面下，在超聲條件下使得澱粉_油 酸接枝聚合物以納米自組裝的形式對血紅蛋白進行包埋；3)超聲完成後，除去反應混合物中的二甲基亞碸，然後將反應混合物用微孔濾膜 過濾，將濾液離心分離，收集沉澱，得到微囊化人工納米紅細胞。所述的澱粉溶解於二甲基亞碸，其中澱粉的質量濃度為5 10%，然後加入澱粉 質量2 8倍的油酸和0. 5 1倍的過硫酸鉀，在95 105°C下進行酯化反應；待充分反 應後，加入過量的乙醇，使澱粉_油酸接枝聚合物以沉澱的方式析出，並將沉澱用乙醇充分 洗滌，然後在95 105°C真空乾燥，得到澱粉-油酸接枝聚合物。所述的澱粉-油酸接枝聚合物溶液的質量濃度為0. 6 4. 8%。所述的血紅蛋白分散於生理鹽水後，血紅蛋白的質量濃度為0. 1 0. 8%。所述的滴入澱粉-油酸接枝聚合物溶液為勻速滴入，滴入速度為1 2ml/min。所述的超聲探頭的功率設定為100 200W，超聲時間為5 20min。更進一步所 述的超聲探頭的功率設定為200W，超聲時間為lOmin。通過將反應混合物中的二甲基亞碸透析至重蒸水中，透析過夜以去除反應混合物 中的二甲基亞碸；最初3小時內，每小時更換一次重蒸水，以後每5小時更換一次。所述的生理鹽水的質量濃度為0. 9%。所述的微囊化人工納米紅細胞的粒徑為200 300nm。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明以血紅蛋白作為載氧、釋氧的功能分子，在其外面通過納米自組裝的方式 包埋雙親性的改性澱粉微囊，以製備的人工納米紅細胞。這樣的構成既使得血紅蛋白的結構不發生變化，保持了其載氧、釋氧的能力，而澱粉類天然多糖高分子物質，生物相容性好、 毒性低，價格低廉、並具有納米粒載體表面的修飾功能，在體內不會產生像蛋白類材料那樣 的抗原性；尤其是改性後具有雙親性的澱粉在超聲下能夠自組裝形成了完整的微囊化的球 體，大大的提高了血紅蛋白的包封率，降低了滲漏率，使得人工納米紅細胞易於保存。本發明所製備的人工納米紅細胞的P50為28. 5mmHg，而包埋前天然牛血紅蛋白的 P50為26. 5mmHg，說明人工納米紅細胞保留了良好的攜氧、釋氧能力。測得包埋前天然牛血 紅蛋白Hill係數為2. 4，人工納米紅細胞Hill係數為2. 1，這說明了牛血紅蛋白在微囊化 後仍具有較好的協同性。本發明所製備的人工納米紅細胞體外對小鼠補體系統無明顯激活，血漿中凝血酶 無增多，凝固因子測定結果合格，溶血率在要求的5 %以內，測試合格；而將人工納米紅細 胞注射到小鼠體內後，對小鼠的血小板無不良影響，未造成明顯的血小板聚集。這說明人工 納米紅細胞由於包埋了改性的澱粉微囊，其表面沒有蛋白類分子的抗原性，具有很好的生 物相容性和安全性。
圖1是天然澱粉和澱粉_油酸接枝聚合物紅外吸收譜圖的對比圖，橫坐標為紅外 吸收光譜波段，縱坐標為吸收度；圖2是人工紅細胞透射電鏡照片示意圖。圖3是改性澱粉包埋前後牛血紅蛋白紅外吸收譜圖，橫坐標為紅外吸收光譜波 段，縱坐標為吸收度；圖4是改性澱粉包埋前後牛血紅蛋白的氧離曲線示意圖，橫坐標為氧分壓，縱坐 標為氧飽和度。
具體實施例方式本發明提供一種人工納米紅細胞的製備方法，通過在血紅蛋白外面通過納米自組 裝包裹具有雙親性的改性澱粉，形成粒徑為200 300nm的微囊化的人工納米紅細胞。所 製備的人工納米紅細胞具有良好的攜氧、釋氧能力和高的包封率，對血小板無不良影響，未 造成明顯的血小板聚集。下面結合附圖和具體的實施例對本發明做進一步詳細描述，所述 是對本發明的解釋而不是限定。實施例11)澱粉-油酸接枝聚合物(ST-Ol)的製備將Ig澱粉溶解於IOml DMSO (二甲基亞碸)，並轉移到圓底燒瓶中，然後加入5. 2g 的油酸，以及0. 5g過硫酸鉀作為催化劑；在95°C甘油油浴中，磁力攪拌反應8h ；反應完成後，加入50ml的乙醇，形成澱粉-油酸接枝聚合物沉澱，濾膜過濾，將沉 澱用乙醇洗滌3次，然後在95°C真空乾燥箱中乾燥，得到澱粉-油酸接枝聚合物。對澱粉-油酸接枝聚合物的鑑定如圖1所示的天然澱粉和澱粉_油酸接枝聚合物紅外吸收譜圖的對比圖，天然澱 粉的紅外特徵吸收峰為1157，1080，1016，927cm—1，而澱粉-油酸接枝聚合物在H^cnT1處 額外出現了 C = O的特徵吸收峰，這表明酯化反應完成，雙親性澱粉接枝改性成功；光譜中2926-1和2855CHT1吸收峰的強度取決於甲基和亞甲基C-H和脂肪酸取代基的拉伸。2)納米自組裝形成微囊化人工細胞澱粉-油酸接枝聚合物IOOmg溶於3ml DMS0,得到質量濃度為3. 0%的澱粉-油 酸接枝聚合物溶液；將20mg牛血紅蛋白溶於IOml質量濃度為0. 9 %的生理鹽水中，得到質量濃度為 0. 2%牛血紅蛋白溶液，然後加入吐溫-20 0. 3ml，震蕩混勻後通入氮氣以將氧氣排出，在冰 浴條件下，用2ml注射器以1 2ml/min的速度勻速滴入澱粉-油酸接枝聚合物溶液，再將 超聲探頭伸入混合溶液的液面下，200W超聲lOmin，在超聲的過程中，澱粉-油酸接枝聚合 物以納米自組裝的形式對血紅蛋白進行包埋；3)超聲完成後，透析除去DMSO 將反應混合物以麗12，OOOg · moF1作為透析膜， 透析至重蒸水中，磁力攪拌下透析過夜；在最初3小時，每小時更換一次介質(重蒸水)，在 接下來的24小時每5小時更換一次。透析過夜後，將反應混合物用0. 45 μ m微孔濾膜過濾， 濾液在15°C下20000r/min高速離心30min，棄掉上清(未包埋組裝的Hb及混合溶液中殘 留的DMS0)，沉澱再經0. 9 %生理鹽水洗滌3遍後，收集沉澱，得到自組裝形成微囊化人工納 米紅細胞，凍幹貯存備用。實施例21)澱粉-油酸接枝聚合物(ST-Ol)的製備將Ig澱粉溶解於IOml DMSO (二甲基亞碸)，並轉移到圓底燒瓶中，然後加入8g的 油酸，Ig過硫酸鉀作為催化劑；在105°C甘油油浴中，磁力攪拌反應8h ；反應完成後，加入IOOml的乙醇，形成澱粉-油酸接枝聚合物沉澱，濾膜過濾，將沉 澱用乙醇洗滌3次，然後在105°C真空乾燥箱中乾燥，得到澱粉-油酸接枝聚合物。2)納米自組裝形成微囊化人工細胞澱粉-油酸接枝聚合物160mg溶於3ml DMS0,得到濃度為4. 8 %的澱粉-油酸接 枝聚合物溶液；將40mg牛血紅蛋白溶於IOml 0. 9%生理鹽水中，得到濃度為0. 4%牛血紅蛋白溶 液、吐溫-200. 3ml，震蕩混勻後通入氮氣以將氧氣排出，在冰浴條件下，用2ml注射器以滴 入速度為1 2ml/min勻速滴入澱粉-油酸接枝聚合物溶液，再將超聲探頭伸入混合溶液 的液面下，IOOff超聲20min，在超聲的過程中，澱粉-油酸接枝聚合物以納米自組裝的形式 對血紅蛋白進行包埋；3)超聲完成後，透析除去DMSO 將反應混合物以麗12，OOOg · moF1作為透析膜， 透析至重蒸水中，磁力攪拌下透析過夜；在最初3小時，每小時更換一次介質(重蒸水)，在 接下來的24小時每5小時更換一次。透析過夜後，將反應混合物用0. 45 μ m微孔濾膜過濾， 濾液在15°C下20000r/min高速離心30min，棄掉上清(未包埋組裝的Hb及混合溶液中殘 留的DMS0)，沉澱再經0. 9 %生理鹽水洗滌3遍後，收集沉澱，得到自組裝形成微囊化人工納 米紅細胞，凍幹貯存備用。實施例31)澱粉-油酸接枝聚合物(ST-Ol)的製備將Ig澱粉溶解於IOml DMSO ( 二甲基亞碸)，並轉移到圓底燒瓶中，然後加入2g的 油酸，0. 5g過硫酸鉀作為催化劑；在100°C甘油油浴中，磁力攪拌反應8h ；
反應完成後，加入80ml的乙醇，形成澱粉-油酸接枝聚合物沉澱，濾膜過濾，將沉 澱用乙醇洗滌3次，然後在100°C真空乾燥箱中乾燥，得到澱粉-油酸接枝聚合物。2)納米自組裝形成微囊化人工細胞澱粉-油酸接枝聚合物80mg溶於3ml DMS0,得到濃度為2. 4%的澱粉-油酸接枝 聚合物溶液；將80mg牛血紅蛋白溶於IOml 0. 9%生理鹽水中，得到濃度為0. 8%牛血紅蛋白溶 液、吐溫-201ml，震蕩混勻後通入氮氣以將氧氣排出，在冰浴條件下，用2ml注射器以滴入 速度為1 2ml/min勻速滴入澱粉-油酸接枝聚合物溶液，再將超聲探頭伸入混合溶液的 液面下，150W超聲15min，在超聲的過程中，澱粉-油酸接枝聚合物以納米自組裝的形式對 血紅蛋白進行包埋；3)超聲完成後，透析除去DMS0，透析過夜後，將反應混合物用0. 45 μ m微孔濾膜過 濾，濾液在15°C下20000r/min高速離心30min，棄掉上清(未包埋組裝的Hb及混合溶液中 殘留的DMS0)，沉澱再經0. 9 %生理鹽水洗滌3遍後，收集沉澱，得到自組裝形成微囊化人工 納米紅細胞，凍幹貯存備用。實施例41)澱粉-油酸接枝聚合物(ST-Ol)的製備將Ig澱粉溶解於IOml DMSO (二甲基亞碸)，並轉移到圓底燒瓶中，然後加入4g的 油酸，0. 6g過硫酸鉀作為催化劑；在98°C甘油油浴中，磁力攪拌反應8h ；反應完成後，加入80ml的乙醇，形成澱粉-油酸接枝聚合物沉澱，濾膜過濾，將沉 澱用乙醇洗滌3次，然後在98°C真空乾燥箱中乾燥，得到澱粉-油酸接枝聚合物。2)納米自組裝形成微囊化人工細胞澱粉-油酸接枝聚合物20mg溶於3ml DMS0,得到濃度為0. 6 %的澱粉-油酸接枝 聚合物溶液；將IOmg牛血紅蛋白溶於IOml 0. 9%生理鹽水中，得到濃度為0. 牛血紅蛋白溶 液、吐溫-200. 1ml，震蕩混勻後通入氮氣以將氧氣排出，在冰浴條件下，用2ml注射器以滴 入速度為1 2ml/min勻速滴入澱粉-油酸接枝聚合物溶液，再將超聲探頭伸入混合溶液 的液面下，160W超聲12min，在超聲的過程中，澱粉-油酸接枝聚合物以納米自組裝的形式 對血紅蛋白進行包埋；3)超聲完成後，透析除去DMS0，透析過夜後，將反應混合物用0. 45 μ m微孔濾膜過 濾，濾液在15°C下20000r/min高速離心30min，棄掉上清(未包埋組裝的Hb及混合溶液中 殘留的DMS0)，沉澱再經0. 9 %生理鹽水洗滌3遍後，收集沉澱，得到自組裝形成微囊化人工 納米紅細胞，凍幹貯存備用。實施例51)澱粉-油酸接枝聚合物(ST-Ol)的製備將Ig澱粉溶解於IOml DMSO (二甲基亞碸)，並轉移到圓底燒瓶中，然後加入4. 5g 的油酸，0. 6g過硫酸鉀作為催化劑；在100°C甘油油浴中，磁力攪拌反應8h;反應完成後，加入80ml的乙醇，形成澱粉-油酸接枝聚合物沉澱，濾膜過濾，將沉 澱用乙醇洗滌3次，然後在100°C真空乾燥箱中乾燥，得到澱粉-油酸接枝聚合物。2)納米自組裝形成微囊化人工細胞
澱粉-油酸接枝聚合物60mg溶於3ml DMS0,得到濃度為1. 8%的澱粉-油酸接枝 聚合物溶液；將20mg牛血紅蛋白溶於IOml 0. 9%生理鹽水中，得到濃度為0. 2%牛血紅蛋白溶 液、吐溫-20 0. 5ml，震蕩混勻後通入氮氣以將氧氣排出，在冰浴條件下，用2ml注射器以滴 入速度為1 2ml/min勻速滴入澱粉-油酸接枝聚合物溶液，再將超聲探頭伸入混合溶液 的液面下，120W超聲20min，在超聲的過程中，澱粉-油酸接枝聚合物以納米自組裝的形式 對血紅蛋白進行包埋；3)超聲完成後，透析除去DMS0，透析過夜後，將反應混合物用0. 45 μ m微孔濾膜過 濾，濾液在15°C下20000r/min高速離心30min，棄掉上清(未包埋組裝的Hb及混合溶液中 殘留的DMS0)，沉澱再經0. 9 %生理鹽水洗滌3遍後，收集沉澱，得到自組裝形成微囊化人工 納米紅細胞，凍幹貯存備用。自組裝形成微囊化人工納米紅細胞的鑑定1、外觀的透射電鏡觀察(TEM)將人工納米紅細胞凍幹品10mg，用生理鹽水復溶後稀釋至質量濃度為0.05 0. l%,100w超聲分散5min後將其滴加至銅網上，空氣中常溫乾燥後置於透射電子顯微鏡 下觀察微球形態。觀察結果如圖2所示，微囊化的人工納米紅細胞大多呈球形，形態圓整；不同重量 配比組份所形成的人工納米紅細胞的粒徑為200 300nm。2、包封率檢測在微囊化的人工納米紅細胞製備完成後，反應混合物在20000r/min離心30min， 取Iml離心上清液檢測其中游離的血紅蛋白，從而計算血紅蛋白被改性澱粉自組裝的包封 率。上清液當中的血紅蛋白的濃度檢測採用標準氰化高鐵血紅蛋白法測定在Iml上清液 中加入2ml的血紅蛋白轉化液試劑，並且在酶標儀上測540nm處的OD值。與同樣處理的鐵 標準液、空白樣品比色，計算得到上清液中的游離的血紅蛋白濃度，根據上清液的總體積進 而得到總的游離血紅蛋白。按以下公式進行包封率的計算
包封率X 100 ο/ο
Hb總包封率檢測結果顯示在改性澱粉進行自組裝包埋血紅蛋白時，在固定超聲的功 率時，隨時間延長，包封率逐漸增大；而固定超聲功率和時間時，隨殼材比例增加，包封率 逐漸增大。而在200W超聲IOmiru血紅蛋白與改性澱粉質量比例為1 5時，包封率可達 98. 8% ο3、FTIR光譜分析採用紅外分析儀(Nicolet5SXC，Germany)分別改性澱粉包埋前後的牛血紅蛋白 進行紅外分析，以檢測其結構是否發生變化。紅外分析結果如圖3所示，包埋後的牛血紅蛋白檢測曲線SEHb與包埋前天然牛血 紅蛋白檢測曲線Hb相比天然Hb的紅外特徵吸收1540CHT1是N-H的彎曲振動，而1647CHT1 處的吸收則是C = O的吸收振動，曲線SEHb與曲線Hb相比吸收峰值基本沒有發生改變，這說明牛血紅蛋白被包埋後其特徵結構得到了很好的保留，而改性澱粉自組裝的包埋對血紅 蛋白的化學結構影響不大。4、P5tl和Hill係數的測定P50是當人工紅細胞中Hb氧飽和度為50%時對應的氧分壓，這是表示人工紅細胞 攜氧能力的一個重要指標。Hill係數是反映Hb各亞基上血紅素結合氧的協同性的重要指 標。用血氧分析儀Hemox analyzer (美國 TCS Scientific Corp 產品)在 37°C測定 改性澱粉包埋前後的牛血紅蛋白的P5tl和Hill係數血氧分析儀用Clark型氧電極(美國 Yellow Spring公司)測定氧分壓，並同時用雙波長的分光光度計測定血紅蛋白的氧飽和 度。將氧平衡曲線用最小二乘法與Adair方程擬合，可計算出各種氧平衡參數。通過計算 40 75%氧飽和度⑴比值的對數與氧分壓的對數(IogPO2)之比，可求出Hill係數(η)。Hill係數(η)的計算公式如下 檢測結果表明包埋前天然牛血紅蛋白的P50為26. 5mmHg，而改性澱粉包埋後的 人工納米紅細胞P5tl為28. 5mmHg，說明人工納米紅細胞保留了良好的攜氧、釋氧能力。測得 包埋前天然牛血紅蛋白Hill係數為2. 4，人工納米紅細胞Hill係數為2. 1，略有下降，但變 化不是很大，這說明了牛血紅蛋白在微囊化後仍具有較好的協同性。而如圖4所示的包埋前後牛血紅蛋白的氧離曲線，其中，橫坐標為氧分壓，縱坐標 為氧飽和度，包埋後的牛血紅蛋白檢測曲線Nano-Hb與包埋前天然牛血紅蛋白檢測曲線Hb 相比在相同氧分壓下所攜帶的氧氣與天然的牛血紅蛋白能力相當，保留了良好的攜氧、釋 氧能力。5、體外補體激活以及凝血、溶血檢測體外測試人工納米紅細胞對補體激活以及凝血、溶血的檢測，分別採用小鼠血清、 紅細胞或血漿來進行。測定時，將人工納米紅細胞懸浮液(以內含Hb的量計，150g/L)分別 與小鼠血清、紅細胞懸浮液150g/L、血漿以1 10(體積比)的比例混合後，進行測定。補 體 C3 含量用儀器 BehringN^helometer IOOAnalyzer 檢測，同時以 zymosan (0. 25mg/ μ 1) 作為陽性對照，0.9%生理鹽水作為陰性對照；溶血率以蒸餾水作為陽性對照，以0.9%生 理鹽水作為陰性對照；凝固時間以肝素鈉15U/ml作為陽性對照，0.9%生理鹽水作為陰性 對照。每個測試點取3個平行樣，結果取平均值。檢測結果如表1所示表1體外補體激活、溶血性及凝血試驗 檢測結果表明人工納米紅細胞與小鼠血清混合後，C3含量為0. 293士0. 004g/L, 溶血率為1.8%，凝固時間15. 9 士 0.5s，與對照組血清補體量無統計學差異，說明人工紅細 胞對小鼠補體系統無明顯激活，血漿中凝血酶無增多，凝固因子測定結果合格，溶血率在要 求的5%以內，測試合格。6、體內血小板計數檢測按每kg小鼠體重的注射IOml人工納米紅細胞懸浮液(濃度以內含Hb的量計， 150g/L)的比例，對小鼠尾靜脈注射人工納米紅細胞懸浮液後，考察輸注後24h內小鼠血小 板數量的變化情況。每個測試點取3隻小鼠，結果取平均值。檢測結果如表2所示，小鼠血 小板計數的正常範圍為1. 57 X IO5 2. 60 X IO5個/ μ 1，輸注人工紅細胞懸浮液後，對小鼠 的血小板無不良影響，未造成明顯的血小板聚集。表 2 血小板計數結果(Table 3 Results of platelet counts) 7、不同保存條件人工納米紅細胞滲漏試驗將50mg人工紅細胞加入IOml 0. 9%生理鹽水充分分散，混勻分成兩組，一組保存 在4°C條件下，另一組為-20°C冷凍保存，分別於l、5、30、60d取兩組製品的上清液，測定上 清血紅蛋白含量。結果如表3所示，-20°C冷凍30天，人工紅細胞滲漏率為5. 4%,60天為 5. 9 %，4°C保存30天，滲漏率6. 7 %，60天為7. 0 %，這說明本發明製備人工納米紅細胞易於保存。表3不同保存條件人工紅細胞滲漏率(％ )
權利要求
一種人工納米紅細胞的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟1)將澱粉溶解後，與其質量2～8倍的油酸在催化劑催化下進行酯化反應，待充分反應後，分離反應生成的澱粉 油酸接枝聚合物；2)將澱粉 油酸接枝聚合物溶於二甲基亞碸，得到澱粉 油酸接枝聚合物溶液；將澱粉 油酸接枝聚合物質量1/8～1倍的血紅蛋白分散於生理鹽水中，並加入生理鹽水體積1～10％的吐溫 20，震蕩混勻並排除氧氣後，在冰浴條件下，滴入澱粉 油酸接枝聚合物溶液，然後將超聲探頭伸入混合溶液的液面下，在超聲條件下使得澱粉 油酸接枝聚合物以納米自組裝的形式對血紅蛋白進行包埋；3)超聲完成後，除去反應混合物中的二甲基亞碸，然後將反應混合物用微孔濾膜過濾，將濾液離心分離，收集沉澱，得到微囊化人工納米紅細胞。
2.如權利要求1所述的人工納米紅細胞的製備方法，其特徵在於，所述的澱粉溶解於 二甲基亞碸，其中澱粉的質量濃度為5 10%，然後加入澱粉質量2 8倍的油酸和0. 5 1倍的過硫酸鉀，在95 105°C下進行酯化反應；待充分反應後，加入過量的乙醇，使澱 粉-油酸接枝聚合物以沉澱的方式析出，並將沉澱用乙醇充分洗滌，然後在95 105°C真空 乾燥，得到澱粉_油酸接枝聚合物。
3.如權利要求1所述的人工納米紅細胞的製備方法，其特徵在於，所述的澱粉_油酸接 枝聚合物溶液的質量濃度為0. 6 4. 8%。
4.如權利要求1所述的人工納米紅細胞的製備方法，其特徵在於，所述的血紅蛋白分 散於生理鹽水後，血紅蛋白的質量濃度為0. 1 0.8%。
5.如權利要求1所述的人工納米紅細胞的製備方法，其特徵在於，所述的滴入澱粉_油 酸接枝聚合物溶液為勻速滴入，滴入速度為1 2ml/min。
6.如權利要求1所述的人工納米紅細胞的製備方法，其特徵在於，所述的超聲探頭的 功率設定為100 200W，超聲時間為5 20min。
7.如權利要求6所述的人工納米紅細胞的製備方法，其特徵在於，所述的超聲探頭的 功率設定為200W，超聲時間為lOmin。
8.如權利要求1所述的人工納米紅細胞的製備方法，其特徵在於，將反應混合物中的 二甲基亞碸透析至重蒸水中，透析過夜以去除反應混合物中的二甲基亞碸；最初3小時內， 每小時更換一次重蒸水，以後每5小時更換一次。
9.如權利要求1所述的人工納米紅細胞的製備方法，其特徵在於，所述的生理鹽水的 質量濃度為0.9%。
10.如權利要求1所述的人工納米紅細胞的製備方法，其特徵在於，所述的微囊化人工 納米紅細胞的粒徑為200 300nm。
全文摘要
本發明公開了一種人工納米紅細胞的製備方法，所述的人工納米紅細胞，是在血紅蛋白外面通過納米自組裝包裹具有雙親性的改性澱粉，形成粒徑為200～300nm的微囊化的人工納米紅細胞。本發明以血紅蛋白作為載氧、釋氧的功能分子，在其外面通過納米自組裝的方式包埋雙親性的改性澱粉微囊，以製備的人工納米紅細胞。所製備的人工納米紅細胞的P50為28.5mmHg，保留了良好的攜氧、釋氧能力；所製備的人工納米紅細胞體外對小鼠補體系統無明顯激活，血漿中凝血酶無增多，凝固因子測定結果合格，而注射到小鼠體內後，對小鼠的血小板無不良影響，未造成明顯的血小板聚集。
文檔編號A61K38/42GK101926984SQ20101024623
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者馮旭陽, 張惠, 徐浩, 徐瑞芬, 徐禮鮮 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學