人體內的生長激素變異及其用途的製作方法

2023-06-21 06:35:16

專利名稱：人體內的生長激素變異及其用途的製作方法
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本發明涉及一種自然存在的生長激素突變；及其在篩選生長激素異常的患者或用於產生適於治療這種異常的變體療法和治療劑中的用途。
一個多世紀前人們就得知人體身材受遺傳因素的影響。儘管早在1912年就認識到通常呈遺傳隱性形式的家族性矮小身材，但是直到又過去了四分之一個世紀，這種家族性的有關內容才在科學文獻中有所記載。只有到了1966年，人們才認識到這這種隱性遺傳的矮小身材通常與單一性生長激素(GH)缺乏有關。
據估測與GH缺乏有關的矮小身材的出生率為1/4000至1/10000。這些病例的大多數是散發的和自發的，但是其中5％至30％的病例具有與該病症的遺傳病因學一致的患病的一級親屬(affected first-degreerelative)。GH缺乏的遺傳病因學通過對家族性矮小身材進行分子遺傳學分析和最初證實的受影響個體腦垂體表達的生長激素(GH1)基因的突變損傷而得到了證實。家族性矮小身材還可能是由於其它基因(例如P0U1F1，PROP1和GHRHR)發生突變而引起的，而且重要的是如何識別這些不同形式的病症。
生長激素(GH)是一種通過多種作用促進出生後的骨骼和軟組織進行生長的多功能激素。至於GH的直接和間接作用的相對大小仍然是一個爭議。一方面，已經證實了GH在多種組織和器官中的直接作用，而且已證明GH受體存在於多種細胞類型當中。另一方面，大量的數據表明GH的主要作用是通過GH-依賴性胰島素樣生長因子I(IGF-I)介導的。IGF-1在多種組織，主要為肝臟中產生，並且通過自己的受體發揮作用，從而增強多種組織，包括骨、軟骨和骨骼肌的增殖和成熟。除了促進組織的生長，已經證明GH還具有其它多種生物學功能，包括生乳作用、導致糖尿病作用、脂肪分解作用和蛋白合成作用，以及鈉和水的瀦留。
整個兒童期都需要適量GH來維持正常的生長。GH缺乏的新生兒的身長和體重往往是正常的。某些人後天生長的速度很低並可能伴有陰莖小或禁食低血糖，結果隨著年齡的增長逐漸演變為智障。在那些患有單一性生長激素缺乏(IGHD)症的人體中，骨骼的成熟通常隨著身高增加的遲緩而遲滯。通常出現身體肥胖、比實際年齡顯得年輕的面容和第二次出牙的延遲。在受影響的成年人當中可以見到類似於早衰中見到的皮膚變化。
家族性IGHD包括具有遺傳特徵方式的幾種不同病症。將已知與GH1基因座缺陷相關的IGHD類型以及至今為止發現的不同類型的基礎損傷列於表1當中。
表1與GH1基因有關的遺傳性疾病的分類
這些損傷的特性有助於對這些類型的IGHD在臨床嚴重程度、遺傳方式和應答於施用的外源GH而形成抗體的傾向方面所存在的差異做出解釋。大多數的病例是散發性的，並被推斷為是由大腦損傷引起的，所述大腦損傷包括大腦水腫、染色體異常、組織細胞增多症、感染、輻射、隔-視覺發育異常(septo-optic dysplasia)、影響下丘腦或腦垂體的外傷或腫瘤。利用磁共振成像檢測法檢測出約12％的IGHD患者的下丘腦或腦垂體異常。
儘管身材矮小、延遲的「身高速度」或生長速度和延遲的骨骼成熟都被發現缺乏GH，但是這些患者中沒有一個人確定患有這種疾病，其它身體疾病可能導致這種症狀。在本說明書的全文中，「身高速度」和生長速度都被解釋為受試者或患者身高的變化速率，諸如每年以釐米計的身高變化。
證實GH缺乏的刺激試驗採用了L-多巴、導致低血糖的胰島素、精氨酸、胰島素-精氨酸、氯壓定(clonidine)、胰高血糖素或普萘洛爾(propranolol)。每次試驗，不足的GH峰值應答不同(通常＜7-10ng/mL)。還應當對所伴發的LH、FSH、TSH和ACTH的缺乏進行檢測，從而確定垂體機能障礙的嚴重程度，以便制定最佳治療方案。
重組得到的GH已在世界範圍內獲得並通過皮下注射來施用。為了獲得最佳結果，患有IGHD的兒童通常一得到確診就馬上開始替代治療。重組GH的最初使用劑量是基於體重和體表面積，但是精確的用量和用藥次數可以根據方案的不同來進行調整。在青春期，劑量隨著體重的增加而增加到最大用量。因此，當對個體的GH分泌能力重新估評時，應當暫時中斷治療。那些被證實是GH缺乏的人在成年期採用較低劑量的外源GH。
採用GH臺療的病症包括(i)其中證明了其功效的病症和(ii)其用途已被報導但未被公認為標準慣例的其它多種病症。其中證明採用GH治療是有效的病症包括GH缺乏，單一的或伴有垂體激素缺乏(CPHD)和特納綜合症。患有頭兩種病症的個體對GH替代治療產生的臨床反應的不同取決於(i)GH缺乏的嚴重程度及其對生長的副作用、開始治療的年齡、出生時的體重、目前體重和GH的使用劑量；和(ii)與所治療相關的缺乏諸如甲狀腺激素缺乏症的識別和反應；和(iii)治療是否伴有抗-GH抗體的產生。對患有特納綜合症的個體的治療結果隨著身材矮小的嚴重程度、染色體互補和開始治療的年齡的不同而不同。
其中已報導採用了GH的其它病症包括治療某些骨骼發育異常如軟骨發育不全(achondroplasia)、普-威綜合症(Prader-Willisyndrome)、針對外源類固醇繼發的或伴有慢性炎症如類風溼性關節炎的生長抑制、慢性腎衰竭、嚴重的原發性身材矮小、Russell-Silver綜合症和子宮內生長遲緩。
家族性IGHD的分子遺傳水平特徵是幾種病因中重要的一種。所涉及的基因座的識別不但能夠表明生長遲緩的可能的嚴重程度，而且更重要地是，還能夠表明現有各種治療方案的適用度等。而且，基礎基因損傷的檢測能夠證實病症的遺傳病因。在判斷以下問題時還具有預測價值(i)生長遲緩的嚴重程度和(ii)採用GH治療後形成抗-GH抗體的可能性。在某些實例中，病理學損傷的知識還有助於解釋所述病症的異常遺傳模式，因此對患病家族的諮詢是重要的。最終，引起表現為功能異常(與非-功能性截然不同)的IGHD病症的突變損傷的性質鑑定使得人們對GH結構和功能產生了新的認識。
在細胞水平上，單個GH分子結合了兩個GH受體分子(GHR)，從而使它們二聚化。由GH結合的兩個GHR分子的二聚作用被認為是信號傳導所必需的，其還與酪氨酸激酶JAK2相關。胞內酪氨酸激酶JAK2與GHR胞質尾部結合。GH結合後，使兩個JAK2分子非常接近從而使得兩個分子之間和GHR胞質尾部的酪氨酸殘基之間發生交叉磷酸化作用。這些磷酸酪氨酸作為細胞信號介導物諸如STAT 5的停靠位點。然後與磷酸化受體尾部接合的STAT 5使其靠近JAK2，導致通過JAK2使其自身磷酸化。磷酸-STAT 5二聚化並被轉位到核，並在其中反式激活GH-應答基因，從而產生觀察到的GH的生物效應。直到最近還假設GH信號主要是通過JAK/STAT途徑介導的。然而，現在已經明確GH還可以激活磷脂醯肌醇3′-激酶(PI3K)和由p42/44促細胞分裂原激活的蛋白質激酶(MAPK)途徑。STAT 5和PI3K途徑的激活能夠誘導肝IGF-1的產生，而MAPK途徑似乎並不如此。
JAK 2和MAPK的激活取決於GHR胞質結構域中不同於參與STAT 5活化的那些區域的區域。STAT 5活化需要JAK 2-介導的酪氨酸的534、566和627殘基的磷酸化，所述三個殘基位於GH誘導的MAPK活化作用不需要的GHR的胞質結構域的C-末端[Hansen等，J Biol Chem 27112669-12673(1996)]。相反，JAK 2和MAPK途徑的激活取決於富含脯氨酸(盒1)的46-胺基酸延伸區域，該區域臨近細胞膜[Sotiropoulos等，Endocrinology(內分泌學)1351292-1298(1994)]。繼GHR活化後的MAPK活化過程似乎很複雜，包括多個機制。這些機制之一由Shc-Grb2-Sos-Ras途徑的JAK 2-依賴性激活來介導[VanderKuur等，Biol Chem2707587-7593(1995)；VanderKuur等，Endocrinology(內分泌學)1384301-4307(1997)]，所述途徑可能涉及多個停靠蛋白如IRS-1[Liang等，Endocrinology1413328-3336(2000)]、Gab-1[Kim等，Endocrinology1434856-4867(2000)]和EGF受體[Yamauchi等，Nature39091-96(1997)]。通過Ral和磷酸酶D的Src-依賴性活化而進行的MAPK活化的另一個JAK 2-依賴性機制最近得到了報導[Zhu等，J Biol Chem27745592-45603(2002)]。儘管Src活化單獨足以部分激活MAPK，但是通過GH的MAPK全活化需要JAK 2和Src二者的活化[Zhu等，J Biol Chem27745592-45603(2002)]。
已經表明GH的不用作用可以由單一類型的GHR分子介導，不同組織中GHR分子具有不同的胞質結構域或磷酸化位點。當被JAK2激活時，這些不同的胞質結構域可以產生不同的磷酸化途徑，其中一種途徑具有生長效應，其它途徑具有不同的新陳代謝效應。
GH是由前腦垂體的促生長細胞分泌的分子量為22kDa的蛋白質。X-射線晶體學研究證明了GH含有以頭對頭-尾對尾的方式排列的兩對平行α螺旋的核心。該結構靠兩個分子內二硫鍵來穩定(Cys53-Cys165和Cys182-Cys189)。兩個生長激素受體(GHR)分子與GH分子上的兩個結構不同的位點結合，該過程是按照GHR首先與位點1結合然後再與位點2結合的順序進行。GHR與GH的結合增強了GHR分子的二聚化作用。
GH分子的掃描誘變研究提供了GH與其受體間的結合相互作用的圖象，同時定點突變被用來檢測特定殘基的功能。因此，Gly120(在人GH的第三個α螺旋中)被Arg所取代的結果是GHR未能與位點2結合因而阻斷了GHR的二聚化作用。類似地是，人GH蛋白質的殘基Phe44對與催乳素受體進行結合起著重要作用。最後證明了殘基Asp115，Gly119，Ala122和Leu123對於小鼠GH分子的增強生長的潛力非常關鍵。
二聚化的GHR與分子內酪氨酸蛋白激酶JAK2的相互作用導致下遊信號轉導分子的酪氨酸磷酸化、促細胞分裂原-激活蛋白(MAP)激酶的刺激和信號轉導物和轉錄激活劑(STAT蛋白)的誘導。以這種方式，GH通過多個不同的信號途徑能夠影響多個基因的表達。
幾種不同的GH同種型(isoform)是由GH1基因(GH1的參考序列如圖4所示)表達產生的。在9％的GH1轉錄物中，外顯子2被剪接到外顯子3的45bp的另一受體剪接位點，因而缺失了32至46位胺基酸殘基，並產生一種代替正常22kDa蛋白質的20kDa的同種型。該20kDa的同種型似乎能夠刺激生長和分化。決定其它受體剪接位點選擇性所涉及的因素還未被定性，但是其非常明顯具有複雜的特性。在垂體腫瘤組織中已檢測到一種痕量的由缺失了外顯子3編碼的32至71位密碼子產生的17.5kDa的同種型。據報導垂體組織中存在著缺少外顯子3和4或外顯子2、3和4的剪接產物，但是這些似乎編碼非活性的蛋白產物。GH的一種24kDa糖基化變體已有記載。22kDa的主要同種型的胺基酸序列如圖5所示，其中顯示了GH1基因編碼區域的核苷酸序列和含有26個胺基酸前導肽的蛋白質的胺基酸序列。側面的數字是指胺基酸殘基的編號。側面粗體垂直箭頭上的數字指明了外顯子的邊界。末端密碼子以星號標記。
編碼垂體生長激素(GH1)的基因位於染色體17q23上五個相關基因簇中(

圖1)。該66.5kb基因簇已被完全測序[Chen等，Genomics4479-497(1989)以及參見圖4]。存在於生長基因簇中的其它基因座是兩個絨毛膜生長催乳激素基因(CSH1和CSH2)、一個絨毛膜生長催乳激素假基因(CSHP1)和一個生長激素基因(GH2)。這些基因被長度為6至13kb的基因間區隔開，處於相同的轉錄方向，在胎盤中表達，並受控於下遊組織特異性增強子。GH2基因座編碼與由GH1來源的生長激素具有13個胺基酸差別的蛋白質。全部五個基因共有非常類似的結構，該結構具有被短的內含子在相同位置間斷的五個外顯子，在GH1中分別為長度為260bp、209bp、92bp和253bp(圖2)。
GH1基因的外顯子1含有60bp的5′-非翻譯序列(儘管其它轉錄起始位點位於-54)、密碼子-26至-24和對應於26個胺基酸的前導序列的起點的密碼子-23的頭一個核苷酸。外顯子2編碼前導肽的其餘部分和成熟GH的頭31個胺基酸。外顯子3-5分別編碼32-71、72-126和127-191位胺基酸。外顯子5還編碼最後位於多腺苷酸化位點的112bp的3′-非翻譯序列。在GH1多腺苷酸化位點3′100bp處存在一個Alu重複序列元件。儘管所述五個相關基因在整個5′側翼區域和編碼區域是高度同源的，但是它們在3′側翼區域則是不同的。
對GH1基因進行了大量的調查研究，結果在人GH1基因啟動子/五個非翻譯區域的5′端中鑑定出相同的已知多態性，並且在我們的共同懸而未決的專利申請WO03/042245中進行了詳細記載。另外，其它調查研究已經證明了GH1基因中的總體缺失、GH1基因中的微小缺失和單個鹼基對取代。GH1基因的所有這些變體被記載在我們的共同懸而未決的專利申請WO03/042245中，因此技術讀者參照該專利可以得到更多的有關存在的GH1變體性質的背景信息。
由於至今記載的家族性GH缺乏的大多數病例被以常染色體隱性特性遺傳下來，該遺傳性缺乏情形的某些實例一直未被認知似乎是由於家族規模小的原因。類似地，可能將由GH1基因發生多個突變(de novomutations)引起的GH缺乏的病例分為散發性，而且對這種病症的遺傳學解釋既沒有引起人們的興趣也沒有進行探討。最後，根據用於定義缺乏狀態的標準，可能GH缺乏表型和基因型圖譜的整個寬泛程度從未引起臨床上的關注。由於這些原因，目前對GH缺乏流行的估測可能並不準確，因而嚴重低估了在人群中的真實流行程度。
因此我們對GH1基因進行了進一步的調查研究。我們的調查研究結果是鑑定出了新型且意義重大的變體，該變體與GH的診斷和治療密切相關。我們認為所述新型變體的確定表明由於目前依賴於基於放射-免疫測定的GH「功能測試」，因而對GH缺乏的診斷不足。而且表明急需研發一種真正的功能性診斷方法。
因此本發明提供了生長激素核酸分子GH1的分離的變體，該變體含有以下取代+1491C→G，其中1491指的是相對於被指定為1的轉錄起始位點的核苷酸位點。
根據本發明的另一個方面，提供了分離的生長激素核酸分子GH1的變體，該變體含有編碼含有Ile179Met取代的蛋白質即GH蛋白的核酸分子。
具體地是，本發明提供了如上定義的核酸序列，其中所述序列是DNA或RNA序列，諸如cDNA或mRNA。
因此本發明還提供了變體GH1的轉錄物，如含有所述GH1變體所編碼的胺基酸序列的蛋白質(下文稱作『GH變體』)。
因此本發明的另一個方面提供了分離的多肽，該多肽是生長激素蛋白GH的變體，而且含有Ile179Met取代。
出乎意料的是，我們的研究已經證明我們已經鑑定出了一種變體GH，其獨特地差異地激活受體-介導的細胞信號途徑。其不僅是一種以這種獨特方式發揮作用的激動劑，而且在檢測和治療生長激素缺乏方面還是極其重要的。這意味著鑑定生長激素缺乏的試驗應該集中在循環(或內源性)生長激素激活一種以上的受體-介導的細胞信號途徑的能力上。我們的調查研究詳細揭示了循環生長激素的完全功效以及相應的任何生長激素缺乏的性質或鑑定。
因此可以看出，沒有集中在上述變體鑑別或受體-介導的細胞信號途徑的差異活化上面的生長激素缺乏的研究，鑑別不出循環生長激素活性的潛在缺乏，並因此鑑別不出生長激素缺乏。
因此，本發明提供了篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟(a)從個體獲得含有人GH1基因的核酸分子的試驗樣品；(b)對所述分子測序；(c)檢測所述序列中的+1491C→G的取代；和(d)如果所述取代存在則斷定存在GH功能障礙。
優選地，所述試驗樣品含有可以通過常規法提取的基因組DNA。
在本發明的篩選方法中，所述測序步驟可採取常規方式來進行，例如通過PCR對GH1基因的適當區域進行測序。
因此，本發明還提供了篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟
(a)自所述個體獲得含有生長激素GH多肽的試驗樣品；(b)對所述多肽進行測序；(c)檢測所述序列中的Ile179Met取代；和(d)如果所述取代存在則斷定存在GH功能障礙。
上述篩選方法包括能夠臨床實施的且為功能性GH缺乏提供早期診斷的單一血液檢驗。這種早期診斷意味著能夠儘早開始GH治療，從而降低GH功能障礙的任何有害影響。
因此，本發明進一步提供了適於用來實施本發明的篩選方法的試劑盒，該試劑盒含有(a)具有對應於GH1基因的+1491區域的核酸序列的寡核苷酸，所述區域含+1491C→G取代；和(b)具有對應於(a)中所指區域中的野生型序列的核酸序列的寡核苷酸；和任選地(c)一種或多種適於實施PCR的試劑以便擴增患者DNA的目的區域。
這些試劑可包括，例如，對應於含有核苷酸+1491的GH1基因的外顯子的PCR引物和/或本文所定義的引物；和/或用於PCR的其它試劑，諸如Taq DNA聚合酶。
優選地，所述試劑盒中的引物或寡核苷酸含有20至25個鹼基對，諸如針對變異序列的20個鹼基對和針對野生型的20個鹼基對。在任何情況下，對寡核苷酸必須進行選擇以便其針對所選區域是唯一的，並且在基因組中的其它位置上不重複出現。
也可以使用其它核苷酸的檢測方法，諸如納米技術中採用的信號擴增方法(諸如Q-Dots)。而且，還可以採用單分子檢測方法(諸如STM)。在這種情況下，本發明的試劑盒可以含有一種或多種適用於這種選擇方法的試劑。
或者，本發明的所述篩選方法和相應的試劑盒可以基於一種或多種所謂的「替代標記物(surrogate marker)」，所述「替代標記物」是GH1變體或GH變體是否存在的指示，或者與GH1變體或GH變體的存在與否有關聯，所述「替代標記物」諸如是蛋白質/胺基酸序列，如特異於GH變體或GH1的變體的抗體。這種所述「替代標記物」可含有(a)任何生物分子(包括但不限於核苷酸、蛋白質、糖類和脂類)；(b)化合物(包括但不限於藥物及其代謝物和其它化合物)；和/或(c)物理特徵，其在個體中存在與否或存在量是可測的，並且與本發明的GH變體或GH1的變體的存在有關係。
而且，本發明可選擇的合適篩選方法可進一步包括獲得含GH變體(即含有hGH的Ile179Met變異的蛋白質/多肽序列)的試驗樣品，該GH變體通過常規的蛋白質測序法(包括質譜、微陣列分析、熱測序法等)和/或基於抗體的檢測方法(例ELISA)以及進行這種蛋白測序法中的一種或多種方法可鑑定的。
在可選的情況下，本發明的試劑盒可以含有用於這種可選方法的一種或多種試劑。
本發明的另一方面還提供了含Ile179Met取代的而且進一步為受體-介導的細胞信號途徑提供了差異激活的分離的生長激素多肽或蛋白質。
在本發明的一個優選實施方案中，所述分離的多肽或蛋白質變體激活STAT5途徑，但顯示對MAPK途徑的激活降低。
在本發明的另一個優選實施方案中，所述MAPK途徑的活性的降低為低於野生型GH蛋白質活性的70％。而且更優選地，低於50％以及更特別地低於45％或更低。
本發明的另一方面還提供了分離的生長激素蛋白，該蛋白的特徵是在螺旋4的C一端部分中具有胺基酸取代。更優選地，所述取代發生在或臨近於針對GHR殘基Trp169或Trp104的結合位點上。
本發明的另一方面還提供了特徵在於具有降低的激活MAPK途徑的能力的分離的生長激素多肽或蛋白質。
在本發明的優選實施方案中，所述MAPK途徑是ERK途徑。
本發明的另一個方面提供了篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟(a)自所述個體獲得試驗樣品，該樣品包括所述個體的內源性生長激素；(b)檢測所述生長激素以確定其是否激活受體介導的MAPK細胞信號途徑和激活到什麼程度；和(c)如果與野生型GH相比，MAPK細胞信號降低了，則斷定存在GH功能障礙。
本發明的另一個方面提供了上述GH1(核酸)變體或GH(多肽/蛋白質)變體用於診斷生長激素功能障礙或研發合適GH治療劑的用途。
本發明的另一個方面提供了特異於本發明的分離的生長激素多肽或蛋白質的抗體。
本發明還提供了含本發明的GH1或GH變體以及藥學可接受載體的組合物。
而且，本發明提供了(a)含本發明的核酸分子的載體；(b)含所述載體(a)的宿主細胞，如細菌宿主細胞；和(c)用於製備本發明的GH變體的方法，該方法包括(i)培養所述宿主細胞(b)；和(ii)從所述培養基中回收由此製備的GH變體。
(d)如上所述由序列、載體或細胞編碼或表達的存在於所述培養基中的蛋白質或胺基酸序列。
現在參照以下實施例來闡明本發明。
圖1表示在17q23染色體上的GH1基因的位置，涉及四個平行進化同源基因即CSHP1，CSH1，GH2和CSH2；圖2是詳細描述GH1基因，顯示了內含子、外顯子、非翻譯區域、信號肽、編碼區和聚腺苷酸尾的圖解；圖3表示GH1的啟動子和與之相關的高水平的序列多態性；圖4表示GH1基因的參考核酸序列結構；圖5表示GH1基因的核酸編碼序列和相應的多肽序列；
圖6是對生長激素蛋白與相應受體相互作用的分子模建圖解。該圖表示GH殘基Ile179側鏈與GHR殘基Trp169之間的緊密聯繫。Ile179殘基通過空間填充模型來表示。Trp169由棒模型表示，其中GHR殘基167-169分子表面以綠色表示；圖7表示ERK和STAT 5激活的時間過程。所示數據是採用磷-特異性ERK和STAT 5抗體探測的Western印跡，表明依賴於時間的ERK(A)和STAT 5(B)的激活過程。ERK印跡表示上面較弱的帶對應於ERK 1以及下面較深的帶對應於ERK 2。印跡通過圖像光密度測定法來分析，而且數據(整合的密度值IDV)針對全部的ERK或STAT 5被標準化，並且相對GH處理時間(C)作圖，結果表明經GH處理後的ERK激活(陰影柱形圖)在10分鐘時達到峰值，以及STAT 5(實心柱形圖)在5-10分鐘時達到峰值；圖8表示野生型(Wt，A，d)和Ile179Met GH(Met，B，E)對ERK(A-C)和STAT 5(D-F)劑量依賴的(0.5-20nM)的激活過程的Western印跡分析。印跡通過圖像光密度測定法來分析，而且數據(整合的密度值IDV)針對全部的ERK或STAT 5被標準化，結果表明在所有的被研究劑量，GH變體(陰影柱型圖)與野生型GH(實心柱形圖)相比對ERK(C)的激活降低了，這與變體(陰影柱型圖)與野生型GH(實心柱形圖)對STAT 5(F)的類似激活相反；和圖9表示野生型(三角形)和Ile179Me t變體GH的GHR的結合特性。數據表示為被特定125I-標記的GH在0.1-20nM劑量範圍內被未標記的野生型和變體GH所取代的量(％B/Bo)。每個點是四個獨立實驗的平均值±SEM。
實施例1-患者的選擇-安達盧西亞(Andalucia)/巴塞隆納(Barcelona)研究在西班牙的安達盧西亞建立一支不同的患者組。基於FSS的分類選中了74個青春期前的兒童，即他們表現出家族性的身材矮小，在Hormone Research45[(增刊2)64-66(1996)]中由Ranke所定義。這些患者具有至少一個遺傳性身材矮小家族成員。研究中的所有兒童的身高偏差評分(height deviation score)(SDS)為總人口平均值之下-2SDS。經過藥理學刺激實驗後的所有受試者均顯示正常的GH分泌(峰值GH≥10ng/mL)。所採用的藥理學試驗採用的是氯壓定(34例)，普萘洛爾(25例)和胰島素(15例)。每個參加中心和多地區道德委員會對遺傳學的研究給予了許可。參與個體也都籤署了同意意見。
針對身高、體重指數、父母身高、中值父母身高(mid-parentalheight)、IGF-1和IGFBP-3的水平、以ng/mL計的峰值GH分泌和GHBP(以百分數表示)計算了標準差分值。針對其中發現了新的GH1基因損傷的兩個個體(B4和B49)的這些數據和針對被研究的個體組的組平均值被示於表2。
表2與組平均值比較的具有新型GH1突變的個體的生長參數和試驗室研究
*全部生長學數據獲自該年齡實施例2-GH1-特異性片段的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增對按照實施例1選擇的患者和對照進行3.2kb GH1-特異性片段的PCR擴增。利用常規方法從患者的淋巴細胞中提取基因組DNA。
相應於GH1特異序列設計寡核苷酸引物GH1F(5′GGGAGCCCCAGCAATGC3′；-615至-599)和GH1R(5′TGTAGGAAGTCTGGGGTGC 3′；+2598至+2616)以利用ExpandTM高保真系統(Roche)PCR擴增含人GH1基因的3.2kb的單一基因組DNA片段。
將兩支獨立的薄壁的0.65ml PCR管用於每個反應。第一支管裝有500納克(ng)的每種引物(GH1F和GH1R)、200μM dATP、dTTP、dCTP和dGTP和200ng的患者基因組DNA，用無菌水將終體積調節到25μl。第二支管裝有5μl 10x反應緩衝液，用無菌水將終體積調節到24.25μl。兩支管放置在冰上5分鐘。然後，將0.75μl的ExpandTM聚合酶混合物加到第二支管中，將內容物混合後轉移到第一支管中。將該管離心30秒鐘並用30μl輕礦物油(Sigma)覆蓋在反應混合物上。然後將該反應混合物放置在被設置成95℃的480或9700PCR編程式熱循環儀(PerkinElmer)中。
然後在下述條件下對所述反應混合物進行擴增95℃保持2分鐘後進行30個循環的95℃ 30秒鐘、58℃ 30秒鐘以及68℃ 2分鐘。在最後20個循環中，每個循環的68℃的延伸步驟被延長5秒鐘。然後進一步在68℃下溫育7分鐘，接著在進行分析前將反應物冷卻到4℃。針對每套反應物，還要設置空白對照(陰性對照)。除了不含基因組DNA外，空白反應物含所有的試劑，並被用來確保所有的試劑不被汙染。
在進行嵌套PCR前，取十分之一的體積(5μl)在1.5％的瓊脂凝膠上進行分析，檢測PCR擴增是否成功。然後將已經成功進行了PCR-擴增的這些樣品稀釋100倍進行嵌套PCR。
另外，在我們的研究中，用於測序的另外的反向引物是GHBFR(5′TGGGTGCCCTCTGGCC3′；-262至-278)，GHSEQ1R(5′AGATTGGCCAAATACTGG3′；+215至+198)，GHSEQ2R(5′GGAATAGACTCTGAGAAAC3′；+785至+767)，GHSEQ3R(5′TCCCTTTCTCATTCATTC3′；+1281至+1264)，GHSEQ4R(5′CCCGAATAGACCCCGC3′；+1745至+1730)[以轉錄起始位點作為+1來編號；GenBank序號J03071]。將含序列變體的樣品克隆到pGEM-T(Promega，Madison WI)中，然後針對每一個體的至少四個克隆進行測序。
實施例3-嵌套PCR在每種情況下對實施例2中製備的片段進行嵌套PCR，產生7個重疊的亞片段，這7個亞片段一起覆蓋了完整的GH1基因。另外，PCR擴增除了三個患者之外的所有患者的基因座控制區域(參見實施例5)。
利用Taq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer)PCR-擴增起始的3.2kbPCR產物的7個重疊的亞片段。用於這些反應的寡核苷酸及其由GH1基因參考序列測定出的序列位置列於表6。
將經稀釋的長(3.2kb)PCR產物的1μl等分樣品加到0.2ml的薄壁PCR管或96孔微滴板的一個孔中。再加入5μl的10x反應緩衝液，500ng的合適引物對(例如GH1DF和GH1DR)，終濃度達到200μM的dATP，dTTP，dCTP和dGTP，加無菌水至體積49.8μl，接著加入0.2μl Taq Gold聚合酶。
然後將所述管或微滴板放置在Primus 96熱循環儀(MWG Biotech)中，並按照以下條件循環95℃保持12分鐘接著共進行32個循環的95℃ 30秒鐘、58℃ 30秒鐘和72℃ 2分鐘。然後進一步在72℃下溫育10分鐘，接著將反應物冷卻到4℃進行分析。
取十分之一體積(5μl)的反應混合物在0.8％瓊脂糖凝膠上進行分析以確定在利用WAVETMDNA片段分析系統(Transgenomic Inc.Crewe，Cheshire，UK)進行變性高壓液相層析(DHPLC)前所述反應物是否有效。為了增加異源雙鏈的形成，在95℃下將PCR產物變性5分鐘，接著逐漸重退火45分鐘至50℃。將產物加載到DNAsep柱(Transgenomic Inc.)上，並在0.1M三乙胺醋酸酯緩衝液(TEAA pH 7.0)中用2％/分鐘的線性乙腈(BDH Merck)梯度以0.9ml/分鐘的恆定流速進行洗脫。梯度的起點和終點根據PCR產物的大小來調節。每個擴增樣品的分析需要6.5-8.5分鐘，其中包括柱再生和平衡的時間。在利用DHPLCMelt軟體(http//insertion.stanford.edu/melt.html)確定的熔點溫度(TM)下對樣品進行分析，並將結果列於表3中。利用UV-C檢測器(Transgenomic Inc.)檢測被洗脫的DNA片段。
表3用於DHPLC分析和DNA測序的寡核苷酸引物
從對於根據上述實施例1A所選患者獲得的樣品，進行以下過程(實施例4 5)實施例4-GH1-特異性長PCR片段的DNA測序在Primus 96(MWG)或9700(Perkin Elmer)PCR熱循環儀中的0.2ml管或96-孔微滴板中利用BigDye(RTM)測序試劑盒(Perkin Elmer)對含GH1-特異性長PCR片段的克隆進行測序。用於測序的寡核苷酸引物是GH1S1(5′GTGGTCAGTGTTGGAACTGC3′-556至-537)；GH3DF(5′CATGTAAGCCAAGTATTTGGCC3′+189至+210)；GH4DF(5′GACTTTCCCCCGCTGTAAATAAG3′+541至+560)；和GH6DF(5′TCCCCAATCCTGGAGCCCCACTGA3′+1099和+1122)。
利用3.2pmol的合適引物和4μl BigDye測序混合物以20μl的終體積對1μg被克隆的DNA進行測序。然後將所述管或微滴板放置在熱循環儀中並按照以下方式進行循環96℃保持2分鐘，接著將96℃保持30秒鐘、50℃保持15秒鐘和60℃保持4分鐘循環30次。然後在純化前將反應物冷卻到4℃。
通過向完成的測序反應中加入80μl的75％異丙醇進行純化。然後進行混合併在室溫下保持30分鐘。然後在室溫下以14000rpm將所述反應物進行離心20分鐘。然後去除上清液並向沉澱中加入250μl的75％異丙醇。將樣品進行混合併在室溫下以14000rpm離心5分鐘。去除上清液並在75℃下將沉澱乾燥2分鐘。
然後利用ABI Prism 377或3100(Applied Biosystems)DNA測序儀分析樣品。
實施例5-GH1基因突變和多態性對來自巴塞隆納的74名家族性身材矮小的患者進行序列分析發現了三個具有潛在病理學意義的突變-360A→G(患者B4)，+1029位點的GTC→ATC(Val 110→Ile)(患者B53；該變異也被記載在共同申請的待審專利申請PCT/GB01/2126中)和+1491位點的ATC→ATG(Ile179→Met)(患者49)。參見表4。
由於在對照樣品中發現了四個Ile110等位基因(0.025的頻率)，這種變異以多態頻率發生在一般人群當中。分子模建表明該取代對GH的結構可能具有損害作用；進化保守的Val110殘基在螺旋3的N-末端形成疏水核的一部分，其被具有較長側鏈Ile所取代預計將產生空間位阻。與該預測一致，Ile110變體具有大大降低的(正常的40％)激活JAK/STAT信號傳導途徑的能力。因此Val110→Ile的取代表現出與GH活性降低相關的功能多態性，而且其可能影響身高。該變異與啟動子單倍型(haplotype)2有關，其具有非常正常的活性。
關於Ile179Met變異Ile179位於螺旋結構4中的hGH蛋白的表面。在hGHbp/hGH 2∶1複合體中，Ile179直接與位點1的『熱點(hot-spot)』殘基TRP104和TRP169發生作用。因此可能Ile179被蛋氨酸殘基所取代會干擾位點1的精確立體結構，因而影響信號傳導，導致hGH的功能發生重大改變。
(c)對照中的GH1編碼序列變異的研究還利用實施例2和3中的方法對總共80個白種(Caucasian origin)健康英國人的GH1基因的編碼區域進行了篩選以便尋找變體。在單個個體中發現了五個沉默取代[Asp26位點的GAC→GAT，Ser85位點的TCG→TCC，Ser85位點的TCG→TCA，Thr123位點的ACG→ACA和Asn109位點的AAC→AAT。Thr123多態性變體之前已被報導過(Counts等，Endocr Genet255-60(2001))。
另外，還發現了三個錯義取代[ACC→ATC，Thr27→Ile；AAC→GAC，Asn47→Asp；GTC→ATC，Val110→Ile，分別為1，1和4等位基因/160等位基因]；在我們的共同申請的待審專利申請PCT/GB01/2126(患者66)中公開的患者研究中只發現了Val10→Ile取代。分子模建表明這種取代對GH結構可能會產生不利影響；在螺旋3的N-末端Val110形成了疏水核的一部分，其被較長側鏈Ile取代後將產生空間位阻。因此不管對照還是患者人群中發生Val110→Ile取代都影響身高。其它解釋如上述實施例5(b)所述。儘管如此，在對照人群中較少的錯義突變卻證明了患者組中發現的損傷的病理學意義。
實施例6 Ile 179 Met變體的生物學活性經全長人GH受體(GHR)轉染且根據提高的GHR表達水平篩選出來的細胞HK293細胞(HK293Hi細胞)被用來測定GH變體的生物活性[Ross等，Mol Endocrinol11265-73(1997)；von Laue等，J Endocrinol165301-311(2000)]。將細胞鋪板到24孔板(每孔100000個細胞)中，在含10％FCS的DMEMF-12(1∶1)中保持24小時。利用基於脂質的轉染試劑(FuGENE 6，Roche Molecular Biochemicals)以及STAT5-反應性螢光素酶報導基因構建體[Ross等，同前，von Laue等，同前]和用以調整轉染效率的組成型表達的β-半乳糖苷酶的表達載體(pCH110；Amersham Pharmacia Biotech)過夜共轉染細胞。然後將細胞與用含2.5×10-7M地塞米松的無血清DMEMF-12(1∶1)稀釋到已知常規濃度範圍(0.1-10nM)內的變體和野生型GH一起溫育6小時以使GHR進行二聚化、STAT5活化且螢光素酶表達。溫育後，對細胞進行裂解，並利用Promega螢光素酶分析系統在微板發光計(Applied Biosystems)中測定螢光素酶。因此螢光素酶的表達提供了GHR活性的測量，因而也提供了GH變體的生物活性的測量。以一式四份的形式進行實驗，並至少重複3次。通過方差分析(ANOVA)並利用Student-NewmanKeuls多重比較檢驗進行比較來對螢光素酶分析數據進行統計學分析。
實施例7-哺乳細胞的GH分泌研究將大鼠垂體(GC)細胞系用含有包括了野生型GH1完整基因的3.2kb片段的pGEM-T質粒(受控於單倍型1啟動子)和受控於其相關單倍型的錯義變體的等價構建體進行轉染。將細胞鋪板到24-孔板(每孔200000個細胞)中，並在含15％馬血清和2.5％FCS的DMEM(完全培養基)中培養過夜。利用基於脂質的轉染試劑Tfx-20(Promega)將細胞用500ng GH1質粒和β-半乳糖苷酶表達載體(pCH110；Amer sham Pharmacia Biotech)進行共轉染。在每孔含1μl Tfx-20的200μl無血清培養基中進行1小時的轉染，然後向每孔中加入0.5ml的完全培養基。將細胞培養48小時，回收培養基並裂解細胞以便進行β-半乳糖苷酶分析，以校正轉染效率的差異。利用與大鼠GH不發生交叉反應的人GH IRMA(NicholsInstitute Diagnostics)定量分析培養基中的GH的變體。如生物活性試驗所述進行實驗和數據分析。
實施例8-錯義變體的功能性特徵通過取代人GH的X-射線結晶結構中的合適胺基酸殘基來模建(model)成熟蛋白中的錯義突變。
分子模建(Molecular modelling)通過檢測人GH的X-射線結晶結構中的合適胺基酸殘基來對Ile179Met變體進行結構分析(PDB3HHR)[19]。比較野生型和突變型GH結構的靜電作用、氫鍵、疏水性作用和表面暴露。利用ICM分子模建軟體包(Molsoft LLC，San Diego，CA)繪製分子圖(圖6)。
實施例9-GH變體的蛋白水解消化將胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或蛋白酶K(全部得自Sigma，Poole，UK)加到由表達野生型GH或Ile179Met變體(60nM)的昆蟲細胞回收到的100μl培養基中以使終濃度達到0.1μg/ml，然後在37℃下溫育1小時。之前對野生型GH的劑量-依賴性研究表明0.1μg/ml是由所有三種酶啟動降解反應的濃度。處理1小時後，加入10μl胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑(500μg/ml)來終止胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化作用，加入1μl PMSF(0.1M)來終止蛋白酶K的消化作用。然後將每個反應再在37℃下溫育15分鐘。利用微型凝膠裝置(Bio-Rad Laboratories)在12％的凝膠上進行SDS-PAGE來對樣品進行分析。也對在37℃下溫育了1小時的未被消化的等量野生型GH和Ile179Me t變體進行跑膠。如以前所述[Lewis等，J Neuroendrocinol14361-367(2002)]將凝膠電印跡到PVDF膜上，用小鼠單克隆抗人GH抗體(Lab Vision，Fremont，CA，USA)進行探測，稀釋1∶500倍，利用抗小鼠IgG-HRP綴合物(1∶5000，Amersham Biosciences)進行檢測，通過增強化學發光進行顯色(ECLPlus，Amersham Biosciences)。利用Alpha Imager 1200數字顯象系統(Alpa Innotech Corp，San Leandro，CA，USA)對膜(film)進行分析，並將結果表示為酶降解後的GH殘餘量佔未消化GH的百分率。將實驗重複3次並通過雙尾t-試驗進行統計學評估。
實施例10-MAP激酶途徑的活化通過用野生型GH和Ile179Met變體刺激3T3-F442A脂肪原細胞研究Ile179Met變體激活MAP激酶信號轉導途徑至與野生型GH相同程度的能力。將細胞(250000)鋪板到10cm的培養皿中，並在實驗前利用含10％小牛血清的DMEM培養三天。用PBS洗所述平板，並以無血清DMEM中溫育進行兩次連續2小時衝洗期。在第二次衝洗結束時將GH直接挑到(spiked)無血清DMEM中，並將細胞培養適當的時間。然後除去培養基，並用含1mM原釩酸鈉的冰冷的PBS衝洗細胞，用含1mM原釩酸鹽和1mM PMSF的0.5ml Laemmli緩衝液進行裂解，並按照上文所述利用10％凝膠通過SDS-PAGE進行分析。將凝膠印跡到PVDF膜上，並利用抗體進行探測，所述抗體檢測在Thr202/Tyr204殘基磷酸化的活化(磷酸化的)形式的p42/p44MAP激酶(Cell Signaling Technology)以及在Tyr694/Tyr699殘基磷酸化的STAT 5(Upstate Biotechnology)。進行印跡、利用ECL Plus(Amersham)進行觀測，並按照上文所述進行圖像分析。為了確保泳道間加載的蛋白量相同，剝下印跡並利用識別完整MAPK或STAT 5(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)的抗體進行再探測。磷-特異性和完整的STAT 5抗體與STAT 5a和5b具有相同的交叉反應。根據採用的初級抗體，第二抗體是抗小鼠或是抗兔IgG-HRP綴合物(1∶5000，Amersham Biosciences)。按照上述方法通過圖像光密度測定法對膜進行分析。磷-MAP和磷-STAT 5的結果參照同一樣品中的完整MAP或STAT5進行標準化。
還進行了確定MAPK和STAT 5被我們的實驗模型中的野生型GH激活的時間歷程的初步的研究。由GH激活STAT 5是快速的，高峰出現在5-10分鐘，接著逐漸下降，而MAPK的激活高峰在10分鐘，接著飛快下降，經過60分鐘返回到活化基礎水平(圖7)。因此選擇10分鐘GH的處理時間來進行下面的研究，因為這是MAPK的最大激活時間，而且是處於STAT 5的最大激活的平臺期。採用一定濃度範圍的野生型GH和變異GH(0.5-2.0nM)將細胞處理10分鐘並分析MAPK和STAT 5的活化(圖8)。
實施例11-Ile179Met變體的功能性特徵通過源自19個脊椎動物的直向同源GH蛋白的ClustalW多序列比對檢測了疏水性殘基Ile179的進化保守性[Krawczak等Gene237143-151(1999)]。
實施例12-受體結合研究利用被全長人GHR轉染的且基於提高的GHR表達篩選的HK293hi細胞(HK293hi細胞)進行受體結合研究[Ross等，Mol Endocrinol11265-273(1997)；von Laue等，J.Endocrinol165301-311(2000)]。利用氯胺T(0.7mM)將2μg GH(人垂體碘化等級，Calbiochem，SanDiego，CA，USA)用37MBq碘-125(Amersham Biosciences，LittleChalfont，Bucks，UK)標記45秒達到87MBq/nM的比活性，並利用Sephadex G-10柱進行純化。將細胞鋪板到12孔平板(每孔300000個細胞)中，並在含10％胎牛血清的DMEM/F-12(1∶1)中培養過夜。用無血清DMEM/F-12將培養物衝洗一次，在無血清培養基中於37℃下預培養3小時，然後用含1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液(PBS-BSA)衝洗兩次，並與具有不同含量的野生型或Ile179Met GH的1ml PBS-BSA中被標記的GH一起在室溫下溫育3小時(200000cpm/孔)。在溫育結束時，用PBS-BSA將細胞衝洗兩次並用1M NaOH溶解以便對所結合的125I-GH進行定量。在兩個孔中進行實驗(n＝4)，並通過對數據進行Scatchard分析來計算出Kd值。
結果Ile179Met變體的功能特徵通過源自19個脊椎動物的直向同源GH蛋白的ClustalW多序列比對檢測了疏水性殘基Ile179的進化保守性[Krawczak等Gene237143-151(1999)]。該殘基在除了海龜以外的所有脊椎動物中是疏水性纈氨酸，表明在人譜系中Ile的取代是保守性的。與人GH平行進化同源基因簇的比較結果表明與Ile179相似的殘基是CSH1，CSH2和CSH中的Met(CSHP1)。這與已通過基因轉換成為模板的保守Ile179Met取代一致。
通過取代人GH的X-射線晶體結構中的殘基來模建Ile179Met取代。Ile179位於螺旋4的C-末端區域，其參與位點1結合，而且當其被部分暴露時，能夠與「熱點」GHR殘基Trp169的側鏈發生疏水性作用。而且與GHR間的作用發生在Ile179的側鏈和主鏈原子與GHR的殘基Lys167和Gly168的主鏈原子之間。Ile179側鏈被蛋氨酸的側鏈的取代在與Trp169殘基的側鏈之間產生了不希望有的範德華力(例如空間的)，而且表明這些疏水作用在取代過程中可能是保守的。進行受體結合研究來確定野生型GH和Ile179Met變體對GHR親合性。但氨酸殘基的引入沒能改變受體的結合(圖9)；發現野生型和Ile179Met GH分子的Kd值分別是1.99nM和2.04nM。這表明如果野生型和變體GH的結合特性間存在著差異，那麼這種差異是很微小(subtle)的且不會改變靜態系統中測定的Kd。丙氨酸-掃描誘變已經鑑定出Ile179Met是作為決定受體親合力的殘基的組成部分；非保守性丙氨酸取代導致GHR結合的急劇下降(Kd從0.34增到0.92nM)[Cunningham和Wells，Science2441081-1084(1989)]。考慮到Ile179對受體結合親合力起作用這樣一個事實，Ile179Met變體可能對GHR受體結合起著微小(subtle)的作用。
因此我們研究了Ile179Met GH變體與GHR間的幹擾作用是否能夠導致STAT 5和MAPK途徑的活化降低。通過螢光素酶報導基因測定對STAT5活化進行了間接研究，通過Western印跡測定被激活的磷酸-STAT5的水平來直接研究STAT 5的活化。通過Western印跡測定被激活的磷酸-MAPK的水平來直接研究MAPK的活化。
Ile179Met變體在昆蟲細胞中進行表達，並採用螢光素酶報導基因分析系統(11，12)來測定其信號轉導活性。欲成為生物活性的GH，其必須與兩個GHR分子結合由此引發受體二聚化。GHR的二聚化激活了細胞內的酪氨酸激酶JAK2，其轉而通過磷酸化作用激活轉錄因子STAT 5。磷酸化的STAT 5發生二聚化，轉位到核中，並與STAT 5-反應性啟動子結合，由此啟動GH-反應性基因的表達。本文採用的GH生物活性分析試驗需要該途徑的所有步驟具有功能。濃度為1nM時，與野生型GH相比，發現Ile179Met變體具有激活JAK/STAT信號轉導途徑的正常(99±4％野生型)活性(圖10)，所述濃度大約為GH在該試驗系統中的ED50值。儘管該變體可能清楚地表明對靜態體外系統沒有不良影響，但是其可能對不是JAK/STAT信號轉導途徑具有不良影響。或者，Ile179Met取代可能對GH的摺疊、分泌或體內穩定性產生不良影響，或者對仍不明確的GH軸產生不良作用。
進行利用特異於磷酸化(被激活的)形式的MAPK和STAT 5的抗體進行的Western印跡實驗來評價Ile179Met變體激活MAP激酶和STAT 5途徑的能力。在整個研究的濃度範圍內Ile179Met變體顯示激活MAPK的能力降低，然而在STAT 5的活化方面沒有差異(新圖8)。分析利用最大單劑量的GH(20nM)進行的多次實驗所得到的數據表明Ile179Met激活MAPK的能力顯著降低到僅為野生型水平的45％(對於Ile179Met變體為基礎活化水平的4.35±0.66倍，而對於野生型GH為基礎活化水平的9.76±2.52倍；平均值±SEM，n＝5獨立實驗，p＜0.05，Student’s t-檢驗，圖8)。這與在20nM的濃度時該變體激活STAT 5的能力與野生型GH水平相同(野生型為基礎水平的36.50倍，而Ile179Met變體為基礎水平的38.62倍)的情況不同。Western印跡數據證實了由STAT 5-反應性螢光素酶報導基因測定得到的結果，表明野生型GH與Ile179Met變體具有類似的活性水平。相反，MAPK的活化只為野生型GH引發的一半水平。
為了進一步探討這些可能性，在大鼠垂體GC細胞中對Ile179Met變體的分泌情況進行了研究。將在GH1啟動子單倍型1控制下的野生型GH1基因轉染到GC細胞中，結果表明引起人GH的分泌(利用人GH-特異性抗體由ELISA檢測到的)超過48小時，分泌濃度為64pM。Ile179Met變體(也受控於GH1啟動子單倍型1，其在患者B49體內與該啟動子順式結合)的分泌水平按照上述方法測定，所測到的GH分泌水平被表示為野生型的百分比。由於分泌是野生型值的97±4％，可推斷該突變可能對GH的分泌幾乎沒有或根本沒有影響。
最後，Ile179Met變體還被胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K作用以確定該變體是否比野生型GH更易蛋白水解裂解。然而，事實證明Ile179Met變體抗蛋白水解裂解的能力與野生型GH相似，表明兩種形式的GH在蛋白摺疊方面沒有明顯差異。在本文中值得考慮的是，我們以前鑑定的GH變體的大約67％[Millar等，Hum Mutat21424-440(2003)]與野生型GH相比其對蛋白水解的敏感性增加了。與不存在錯誤摺疊一致，Ile179Met變體在大鼠垂體細胞中的分泌水平與野生型GH沒有區別。
據我們所掌握的知識，由受體激動劑激活的細胞信號途徑的差異活化難以預測。與Ile179Met變體相反，我們實驗室以前的研究所鑑定出的所有GH變體或者分泌水平低或者激活JAK/STAT途徑的活性低或者兩者都低[Millar等，Hum Mutat21424-440(2003)]。因此我們相信GHR被Ile179Met GH變體激活後能夠正常激活JAK 2，但不能激活Src，結果導致STAT 5的完全激活，但僅僅部分激活MAPK。
在表現為身材矮小的兒童體內GH變體能正常激活STAT 5但對MAPK的激活降低，這些情形產生了一些有趣的問題，即有關MAPK在介導GH活性方面可能發揮的作用。以前的研究表明MAPK不參與IGF1基因表達的GH誘導[Shoba等，Endocrinology1423980-3986(2001)；Frago等，Endocrinology1434113-4122(2002)]。然而，仍有可能的是該變體可能仍然對先證者所證明的身材矮小有影響，也許與編碼其它GH軸蛋白的非相連基因座位的變體共同作用。因此在調節GH的促進生長效應方面，MAPK途徑可能比已鑑定的所起的作用更大。
表4在針對有家族性身材矮小的74名個體進行的篩選中發現的GH1基因損傷
核苷酸的編號是基於GH1參考序列(GenBank序號J03071)，其中+1＝轉錄起始位點。按照Horan等(2003)為臨近的單倍型啟動子編號。之前已由Miyata等所報導(1997)。
權利要求
1.分離的人生長激素核酸分子GH1的變體，該變體含有以下取代+1491C→G，其中1491指的是相對於被指定為1的轉錄起始位點的核苷酸位點。
2.分離的生長激素核酸分子GH1的變體，含有編碼一種蛋白質的核酸分子，該蛋白質即為GH蛋白質，而且該蛋白質含取代Ile179Met。
3.如權利要求1或2所述的分離的核酸分子，其中所述分子是gDNA、cDNA或mRNA。
4.如權利要求1、2或3所述的核酸分子的轉錄物。
5.如權利要求1、2或3所述的核酸分子編碼的分離多肽。
6.分離的多肽，為生長激素蛋白GH的變體，而且含有取代Ile179Met。
7.篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟(a)從個體獲得含有人GH1基因的核酸分子的試驗樣品；(b)測序所述分子；(c)檢測所述序列中的+1491C→G的取代；和(d)如果所述取代存在則斷定存在GH功能障礙。
8.如權利要求7所述的篩選方法，其中所述測序步驟包括PCR技術。
9.篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟(a)從所述個體獲得含有生長激素GH多肽的試驗樣品；(b)對所述多肽進行測序；(c)檢測所述序列中的Ile179Met取代；和(d)所述取代存在則斷定存在GH功能障礙。
10.適於用來實施權利要求7、8或9所述篩選方法的試劑盒，該試劑盒含有(a)具有對應於GH1基因的+1491區域的核酸序列的寡核苷酸，所述區域含+1491C→G取代；和(b)具有對應於(a)中所指區域中的野生型序列的核酸序列的寡核苷酸；和任選地(c)一種或多種適於實施PCR的試劑以便擴增患者DNA的目的區域。
11.適於在權利要求7-9所述方法中使用的，以及任選地在權利要求10所述試劑盒中提供的寡核苷酸。
12.含Ile179Met取代的而且進一步為受體-介導的細胞信號途徑提供了差異激活的分離的生長激素多肽或蛋白質。
13.如權利要求12所述的分離多肽或蛋白質，其中所述多肽或蛋白質激活STAT5途徑，而顯示對MAPK途徑的激活降低。
14.如權利要求13所述的分離多肽或蛋白質，其中所述MAPK途徑活性的降低為低於野生型GH蛋白質活性的70％。
15.如權利要求14所述的分離的多肽或蛋白質，其中所述降低的活性為低於50％。
16.如權利要求13所述的分離的多肽或蛋白質，其中所述降低的活性為低於45％。
17.分離的生長激素多肽或蛋白質，其特徵在於激活MAP激酶途徑的能力降低了。
18.如權利要求17所述的分離的多肽或蛋白質，其中所述MAPK途徑是ERK途徑。
19.一種篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟(a)獲得源自所述個體的試驗樣品，該樣品含有所述個體的內源性生長激素；(b)檢測所述生長激素來確定其是否激活受體介導的MAPK細胞信號途徑以及激活到什麼程度；和(c)如果與野生型GH相比，MAPK細胞信號降低了，斷定存在GH功能障礙。
20.如權利要求1-3所述的分離的核酸分子用於診斷生長激素功能障礙或開發合適療法的用途。
21.如權利要求12-18所述的分離的多肽或蛋白質用於診斷生長激素功能障礙或開發合適療法的用途。
22.特異於權利要求12-18所述分離的生長激素多肽或蛋白質的抗體。
23.含權利要求1-3所述核酸分子以及藥用載體的藥物組合物。
24.含權利要求12-18所述分離的多肽或蛋白質以及藥用載體的藥物組合物。
25.含權利要求1-3所述核酸分子的載體。
26.含權利要求25所述載體的宿主細胞。
27.用於製備權利要求12-18所述分離的多肽或蛋白質的方法，包括(a)培養權利要求26的宿主細胞；和(b)從所述培養基中回收由所述細胞產生的多肽或蛋白質。
28.由權利要求27所述方法生產的多肽或蛋白質。
全文摘要
本發明涉及自然發生的生長激素突變；用於檢測該突變的方法及其在篩選具有生長激素功能障礙的患者的用途或用於生產適於治療這種異常的變異蛋白的用途。
文檔編號C07K14/61GK1711280SQ200380103099
公開日2005年12月21日 申請日期2003年11月4日 優先權日2002年11月12日
發明者D·N·庫珀, A·M·普羅克特, J·格雷戈裡, D·S·米勒, M·劉易斯, A·尤利德 申請人:加的夫大學學院諮詢有限公司