蔗糖測定試劑盒及蔗糖的濃度測定方法
2023-06-21 06:41:11 5
專利名稱：蔗糖測定試劑盒及蔗糖的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種蔗糖測定試劑盒，同時本發明還涉及測定蔗糖濃度的 方法，屬於食品檢驗測定技術領域。
技術背景當前，蜂蜜摻假的現象嚴重，據調查，在基層收購的蜂蜜中，出現的摻假的樣品中，蔗糖的含量多在10-28%之間，有的甚至高達50%以上。另外， 在中、低檔茶葉加工時摻糖，以增加重量謀取不法利益的現象也比較普遍。 無糖食品查出含有蔗糖的問題，也時有所聞，對糖尿病患者造成危害。申請專利號200510099310.4的一種甘蔗汁中蔗糖含量的檢測方法，公 開一種蔗糖的測定方法，其方法包括蔗糖的水解，還原糖與鐵氰l七鉀的反 應，亞鐵氰化鉀的電位滴定等步驟。由於用常規的滴定法測定蔗糖含量過程繁瑣，準確性差，也有利用高效 液相色譜儀對樣品進行檢測。中華人民共和國國家標準GB 5009.8-85公布了食品中蔗糖的測定方 法，其原理為樣品經除去蛋白質後，其中蔗糖經鹽酸水解轉化為還原螗， 再按還原糖測定。水解前後還原糖的差值為蔗糖含量。本國家標準由全國 衛生標準技術委員會食品衛生標準分委員會提出，由衛生部食品衛生監督 檢驗所歸口。本國家標準由衛生部食品衛生監督檢驗所負責起草。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，計量/連續 監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得 以測定蔗糖濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的蔗糖測 定試劑盒，採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分 析儀上進行蔗糖濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切 實的推廣應用。本發明蔗糖濃度測定方法原理如下蔗糖+磷酸根蔗糖磷酸化酶D-果糖+00-0-葡萄糖-1-磷酸 果糖+輔酶果糖脫氫酶脫氫果糖+還原型輔酶-這種方法應用蔗糖磷酸化酶(Disaccharidephosphorylases; EC 2.4丄7) 偶聯果糖脫氫酶(fructose dehydrogenase; EC 1.1.1.124; EC 1.1.99.11)酶 促反應速率比色法/終點法。蔗糖磷酸化酶酶解蔗糖反應產生果糖，再通過 偶聯果糖脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為 還原型輔酶(在340nrn處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm 處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度， 可以測算蔗糖的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明蔗糖測定試劑盒較為 理想磷酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L蔗糖磷酸化酶 10000 U/L果糖脫氫酶 12000 U/L磷酸根底物可以使用磷酸緩衝液取代，如果使用其他緩衝液，則需要加 入磷酸根底物。本發明的蔗糖測定試劑盒可以是單劑，包括磷酸緩衝液、穩定劑、輔酶、蔗糖磷酸化酶、果糖脫氫酶。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1磷酸緩衝液、穩定劑、輔酶。 試劑2磷酸緩衝液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶、果糖脫氫酶。 輔酶、蔗糖磷酸化酶、果糖脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試 劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1磷酸緩衝液、穩定劑、輔酶。 試劑2磷酸緩衝液、穩定劑、果糖脫氫酶。試劑3磷酸緩衝液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶。輔酶、蔗糖磷酸化酶、果糖脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位置 可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配 製成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定蔗糖濃度的方法，其輔酶可以 是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的蔗糖測定試劑為單試劑，包括: 磷酸緩衝液 穩定劑蔗糖磷酸化酶100mmol/L 500 mmol/L 、 3 mmol/L 10000 U/L 12000U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用 前，加入純淨水，復溶後使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測蔗糖樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘 左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出蔗糖的濃度大小。實施例二本實施例的蔗糖測定試劑為雙試劑，包括試劑1磷酸緩衝液 穩定劑100腿ol/L50 mmol/L3 mmol/L試劑2磷酸緩衝液 穩定劑 蔗糖磷酸化f 果糖脫氫酶100mmol/L500 mmol/L10000U/L12000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測蔗糖樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，牆測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出蔗糖的濃度大小實施例三本實施例的蔗糖測定試劑為三試劑，包括: 試劑1磷酸緩衝液穩定劑輔酶試劑2磷酸緩衝液穩定劑果糖脫氫酶 試劑3磷酸緩衝液穩定劑蔗糖磷酸化酶100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L100mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L100mmol/L500 mmol/L10000U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。測定蔗糖濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間IO分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測蔗糖樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為 正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出庶糖的濃度 大小。申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉。總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，便於推廣應用。
權利要求
1.一種酶比色法及酶聯法的蔗糖的濃度測定方法，其方法原理如下蔗糖+磷酸根 蔗糖磷酸化酶 D-果糖+α-D-葡萄糖-1-磷酸果糖+輔酶 果糖脫氫酶 脫氫果糖+還原型輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出蔗糖的濃度大小測定結果。
2. —種蔗糖測定試劑盒，主要成分包括磷酸緩衝液 20——500 mmol/L穩定劑 1——4000 mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L蔗糖磷酸化酶 1000——80000 U/L果糖脫氫酶 1000——80000 U/L其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用； 也可以配製成液體試劑，直接使用。磷酸根底物可以使用磷酸緩衝 液取代，如果使用其他緩衝液，則需要加入磷酸根底物。
3. 根據權利要求2所述蔗糖測定試劑盒，其特徵在於 由磷酸緩衝液、穩定劑、輔酶、蔗糖磷酸化酶、果糖脫氫酶組成單劑試 劑。
4. 根據權利要求2所述蔗糖測定試劑盒，其特徵在於由磷酸緩衝液、穩定劑、輔酶、蔗糖磷酸化酶、果糖脫氫酶組成雙劑試 劑；試劑l，由磷酸緩衝液、穩定劑、輔酶組成；試劑2，由磷酸緩衝液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶、果糖脫氫酶組成。輔酶、蔗糖磷酸化酶、 果糖脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述蔗糖測定試劑盒，其特徵在於由磷酸緩衝液、穩定劑、輔酶、蔗糖磷酸化酶、果糖脫氫酶組成多劑試 劑；試劑l，由磷酸緩衝液、穩定劑、輔酶組成；試劑2，由磷酸緩衝 液、穩定劑、果糖脫氫酶組成；試劑3，由磷酸緩衝液、穩定劑、蔗糖 磷酸化酶組成。輔酶、蔗糖磷酸化酶、果糖脫氫酶在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述蔗糖測定試劑盒，其特徵在於還包括穩定劑 14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的蔗糖測定試劑盒，同時本發明還涉及測定蔗糖濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括磷酸緩衝液、輔酶、蔗糖磷酸化酶、果糖脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出蔗糖的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101329266SQ20071002473
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優先權日2007年6月21日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司