草酸診斷/測定試劑盒及草酸濃度測定方法
2023-06-21 06:30:16 2
專利名稱：草酸診斷/測定試劑盒及草酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種草酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定草酸濃 度的方法，屬於醫學/食品檢驗測定技術領域。
背景技術：
草酸作為一種最簡單的二元羧酸，普遍存在於植物界中，植物草酸具有 重要的生理功能，並且在植物抗逆性中發揮積極作用。草酸多以鉀鹽或轉 鹽的形式存在，而在秋海棠、芭蕉中卻以游離酸的形式存在，草酸有毒， 能溶解於水。草酸是一種重要的化工原料，廣泛用於醫藥、染料、塗料、 稀土金屬的分離和提純以及衣物的漂白。
測定草酸的方法有離子色譜法、電導離子色譜法、HPLC方法。臨床
上大多數結石屬草酸鈣結石。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶聯法(Couple Reaction)技術，監測還原型煙醯 胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定草酸濃度 的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的草酸診斷/測定試劑盒， 採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行 草酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應 用。本發明草酸濃度測定方法原理如下
草酸+氧草酸氧化酶 二氧化碳+過氧化氫 二氧化碳+乙醯輔酶八+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶
丙酮酸+輔酶八+輔酶
這種方法應用草酸氧化酶(oxalate oxidase; EC 1.2.3.4)偶聯丙酮酸脫 氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2丄51)酶促反應連續監測法/終點比 色法。草酸氧化酶酶解草酸反應產生二氧化碳，再通過偶聯丙酮酸脫氫酶 的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm 處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/ 速度，通過測量340nm處吸光度下降的程度/速度，可以測算草酸的濃度大 小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明草酸診斷/測定試劑盒 較為理想-
緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
草酸氧化酶 10000 U/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
乙醯輔酶A 20 mmol/L
本發明的草酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括-
.緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙醯輔酶A。
試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體
試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、乙醯輔酶A。
試劑2
緩衝液、穩定劑、草酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶。
還原型輔酶、草酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙醯輔酶A在試劑1或試 劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使 用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、乙醯輔酶A。 試劑2
緩衝液、穩定劑、丙酮酸脫氫酶。 試劑3
緩衝液、穩定劑、草酸氧化酶。
還原型輔酶、草酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙醯輔酶A在試劑1、試劑 2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶 解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定草酸濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的 一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的草酸診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
草酸氧化酶 10000 U/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
乙醯輔酶A 20 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用 前，加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測草酸樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出草酸的濃度 大小。 實施例二
本實施例的草酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑 還原型輔酶
乙醯輔酶A
50 mmol/L
0.25 mmol/L
20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100 mmol/L
穩定劑
草酸氧化酶
丙酮酸脫氫酶
500 mmol/L 10000U/L 12000 U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37t;，反應時間10分鐘，起始吸光
度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測草酸樣品與試 劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲 時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出草酸的濃度 大小。 實施例三
本實施例的草酸診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100 mmol/L穩定劑
還原型輔酶
乙醯輔酶A
50 mmol/L
0.25 mmol/L
20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑
丙酮酸脫氫酶
500 mmol/L 12000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑
500 mmol/L
10000U/L
:試劑，可以直接使用。
草酸氧化酶 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體
測定草酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C,反應時間 IO分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測草酸樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向 為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出草酸的濃度 大小。
申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，便於推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的草酸濃度測定方法，其方法原理如下草酸+氧 草酸氧化酶 二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+乙醯輔酶A+還原型輔酶 丙酮酸脫氫酶 丙酮酸+輔酶A+輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出草酸的濃度大小測定結果。
2. —種草酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩衝液 20--500 mmol/L穩定劑還原型輔酶草酸氧化酶丙酮酸脫氫酶乙醯輔酶A1-—4000 mmol/L0.1-0.35mmol/L1000——80000 U/L1000——80000 U/L1-50 mmol/L其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用； 也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙醯輔 酶A組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙醯輔 酶A組成雙劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、乙醯輔 酶A組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、草酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組 成。還原型輔酶、草酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙醯輔酶A在試劑1 或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙醯輔 酶A組成多劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、乙醯輔 酶A組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3， 由緩衝液、穩定劑、草酸氧化酶組成。還原型輔酶、草酸氧化酶、丙酮 酸脫氫酶、乙醯輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特徵在於還包括穩定 齊!J 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的草酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定草酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、還原型輔酶、乙醯輔酶A、草酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出草酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101329328SQ200710024719
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優先權日2007年6月21日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司