Sars流行性肺組織酵母菌疫苗和菌素及其製造方法
2023-11-05 12:28:22
專利名稱：Sars流行性肺組織酵母菌疫苗和菌素及其製造方法
技術領域：
SARS流行性肺組織酵母菌疫苗和菌素及其製造方法屬生物技術領域。
背景技術：
SARS流行性肺組織酵母菌疫苗和菌素及其製造方法本發明至2003年4月18日在中國廣州歷時一個多月，由余國華成功鑑定並確認「非典」、SARS病原體是「流行性肺組織酵母菌」，本病是流行性肺組織酵母菌病，並擬定開發本病原體有關科學研究和生產系列製品(
圖1～5)圖1是動物模型肺組織切片所見的病原體。圖2是肺血管平滑肌的病原體，圖3是肺組織肺泡中的病原體，圖4是肺組織柱狀上皮中大量病原體，圖5是腦組織中病原體顆粒和球狀孢子體，圖6是病原體純培養，也是製造SARS疫苗和菌素的原料。
本發明提供一種由SARS流行性肺組織酵母菌(以下簡稱組織酵母菌)「SARS」流行性肺組織酵母菌疫苗」，(以下簡稱組織胞酵母疫苗)用上述同一組織酵母菌，製造「SARS流行性肺組織酵母菌素」(以下簡稱組織酵母菌素)對所檢索的全部資料，均未發現與本發明同類或相關技術內容的產品及其生產方法。
發明內容
SARS流行性肺組織酵母菌和菌素及其製造方法製造的組織酵母菌疫苗，用於預防組織酵母菌病感染，製造組織胞漿菌素，用於特異性診斷組織酵母菌病。
本發明流行性肺組織酵母菌可用作科學研究，「非典」、SARS測試、和商業用途。除上述製造疫苗和皮試診斷試劑，亦可用其他方法處理後，製造特異性診斷試劑，以及應用本病原體組織酵母菌測試基因排列繪製基因圖譜或其他科學研究、藥物實驗。
1、技術關鍵組織酵母菌疫苗，主要通過菌株擴增、滅活、脫毒組織酵母菌(死菌)製造而成，其滅活方法是使組織酵母菌在水浴中或相當的加溫環境中用100℃5-50分鐘，或60-95℃，1-10小時滅活，採用1％-3％甲醛滅活和同時脫毒，達到滅活目的，並保持組織酵母菌疫苗抗原性良好。
2、技術方案組織酵母菌疫苗是用滅活和甲醛脫毒的方法製造組織酵母菌疫苗。同時還可將組織酵母菌營養控制，反覆不斷傳代(在動物或培養基)或用其他人工的方法使組織酵母菌毒力下降，製造組織酵母菌減毒的活疫苗，用於上述組織酵母菌病感染的預防。
組織酵母菌疫苗的臨床用量單位按含菌數計算，供皮下或肌肉注射的疫苗每次(瓶)為10×108/ml/支，用於滴鼻和噴喉氣霧劑，其劑量為5×109/5ml。並製造組織酵母菌疫苗的系列劑型，氣霧劑、滴鼻滴劑(液體)和用於舌下含的片劑、供皮下或肌肉注射針劑，以及凍乾粉針劑等。採用組織酵母菌減毒活疫苗的劑量是滅活疫苗減量的2～20倍。
3、技術效果SARS流行性肺組織酵母菌病，當今被認為是一種烈性傳染病，本發明研製組織酵母菌疫苗，徹底解決本病的傳播漫延和易感者預防的最佳途徑。世界公認，疫苗是最有效、最方便、最完全和最經濟的預防傳染病方法，組織酵母菌疫苗的研製成功，將對於全社會及至全人類的健康作出貢獻。
組織酵母菌素其製造方法，是採用上述滅活的組織酵母菌，經反覆多次離心洗滌，加入適量無菌溶劑，用超聲波粉碎和反覆凍溶後，用適當溶劑以1∶100-10000稀釋，供特異性診斷組織酵母菌病皮試應用。
對於急性流行病病原學的證確診斷，是消除流行病的傳染源和對患者的及時治療以及預防的關鍵，組織酵母菌素研製成功，提供一種特異性診斷用品，對組織酵母菌病或疑似本病，快速確診能使這些患者對症治療，得到及時救治，早日康服。
為實現上述目標本發明採用技術方案如下組織酵母菌疫苗和組織酵母菌素的製造程序製造組織酵母菌疫苗種子系統生產用菌種採用種子批系統。從原始種子批借代，擴增後凍幹保存為主種子批。從主種子批製備工作種子批。主種子批和工作種子批的各種特性與原始種子一致。工作種子批用於生產。
種子批菌種檢定形態及培養特性將待檢菌種接種於脂、改良沙保羅培養基或其他適宜培養基，均為組織胞漿菌，在血瓊脂培養基上，菌落初呈球狀，腦形、粉紅色至棕色。
菌種傳代及保存菌種凍幹保存於2-8℃，主種子批自啟開後傳代不得超過5代。
原液製備生產用種子將工作種子批菌種啟開後，接種於改良沙保羅或其他適宜培養基，置37℃培養傳代，一般不超過24小時，由此製備適宜數量的生產用工作種子。
生產用培養基用pH7.0-7.4的營養瓊脂和營養肉湯或國家藥品管理當局批准的基他培養基。培養基中含對人體有害或其他過敏原物質。
菌種接種和培養採用大號玻璃瓶密閉式培養種法，接種後置37℃培養22-24小時，在培養物滅菌取樣，塗片染色鏡檢、如發現雜菌，應廢棄。
收集和殺菌培養結束後，收取菌液，直接加熱殺菌或加入終濃度為1.0-％-1.2％的甲醛溶液，置37℃，7天，取樣種於改良沙保羅培養基和虎紅瓊脂做無菌試驗，4℃離心洗滌去甲醛後，加無菌PBS到原量，置2-8℃保存。
半成品配製單批或多批檢定合格的原液合併，用PBS稀釋(磷酸緩衝液)，與原液混合，使每1ml含1-5×109。
組成及用途本品系用組織胞漿菌培養後，經加熱滅活、脫毒處理，製成每瓶含菌1-5×108ml，不含防腐劑，用於預防組織酵母菌感染的生物製劑。
取未分裝的組織酵母菌原液，用超聲濾粉碎和反覆凍溶後，以1∶100-10000的稀釋，製造成為「組織酵母菌素」供組織酵母菌感染患者作皮試之用。「組織酵母菌疫苗」和「組織酵母菌素」的具體製造方法如下；組織酵母菌疫苗和組織酵母菌素製造方法1.定義、組成及用途本品系用組織酵母菌培養後，經甲醛溶液滅活、脫毒處理、製成每瓶含菌1-5×109/ml，不含防腐劑製成。用於SARS流行性肺組織酵母菌病的預防。
2.製造2.1基本要求2.1.1設施與生產質量管理按中國《藥品生產質量管理規範》要求實施。中國化學製藥工業協會，化學工業出版新，2001年P14-3796-105。
2.1.2原料及輔料符合現行《中國生物製品主要原輔材料質控標準》的要求。未納入上述標準的化學試劑，不低於化學純。中國生物製品標準化委員會，化學工業出版新2000年版P49-62。
2.1.3生產用水生產用水符合國家飲用水標準，純化水及注射用水符合現行《中國藥典》2000年版標準。《中國生物製品主要原輔材料質控標準》2000年版，中國生物製品標準化委員會編，P1-2。
2.1.4生產用器具直接用於生產的金屬或玻璃等器具，嚴格清洗及去熱源處理或滅菌處理。
2.15生產及檢定用動物家兔、小鼠、豚鼠符合清潔級。
2.2菌種2.2.1菌種名稱及來源製造用菌種由當地直接檢樣分離獲得並凍幹保存或國家指定的單位保管和分發。
2.2.2種子批的建立生產用菌種採用種子批系統。從原始種子批傳代，擴增後凍幹保存為主種子批。從主種子批製備工作種子批。主種子批和工作種子批的各種特性與原始種子批一致。工作種子批用於生產。
2.2.3種子批菌種檢定2.2.3.1形態及培養特性將待檢菌種接種於改良沙保羅瓊脂或其他適宜培養基，為組織酵母菌，在血瓊脂培養基上菌落初呈球狀、腦形、粉紅色至棕色。
2.2.3.2生化反應所用菌種均用細菌生化鑑定系統，鑑定為組織酵母菌。
2.2.3.3血清凝集試驗用37℃培養20-24小時的培養物，以1％甲醛滅活，用無菌生理氯化鈉溶液稀釋，使其含菌10×108ml，與組織酵母菌免疫診斷血清，充分混合後，置37℃過夜，以肉眼見到凝集之血清最高稀釋度為凝集反應效價。凝集效價應不低於原血清效價之半。
2.2.3.4毒力試驗採取組織酵母菌分別用37℃培養20-24小時的改良沙保羅液體培養物，以無菌生理氯化鈉溶液稀釋成含菌1.2×109/ml、8×108ml、4×108/ml、2×108/ml等濃度菌液，腹腔注射體重14-16g小鼠，同性或雌雄各半，每個濃度菌液使用至少5隻小鼠，每隻0.5ml，觀察3-7天，計算LD50。
2.2.3.5毒性試驗分別採用37℃培養20-24小時的改良沙保羅液體培養物混懸於生理氯化鈉溶液內，70℃加溫2小時(或其他方法)殺菌，不加防腐劑。殺菌試驗合格後，按一定比例混合，稀釋成每1ml含菌4.0×109、2.0×109及1.0×109共3個濃度，每個濃度菌懸液0.5ml腹腔注射體重16-18g小鼠5隻，觀察3天，注射1.0×109至2.0×109個死菌體的小鼠應全部生存。
2.2.3.6抗原性試驗選體重2kg左右之家兔至少3隻，以上述免疫力試驗用菌液注射家兔，注射8次，末次注射後7-10天，採血做定量凝集試驗，測定效價。2/3家兔血清凝集價應不低於1∶2560。
2.2.3.7免疫力試驗用終濃度不超過1.1％±0.1％的甲醛溶液殺菌，以不加防腐劑的菌液稀釋，使其含菌2.0×109ml。選體重14-16g小鼠至少30隻，每次皮下注射菌液0.5ml，間隔5天注射1次，共注射3次，末次免疫後7-10天，用2個MLD毒菌，觀察3天，對照組小鼠死亡數應不低於80％，免疫組小鼠保護率應不低於70％。
2.2.4菌種傳代及保存2.2.4.1菌種凍幹保存於2-8℃，主種子批自啟開後傳代不得超過5代。
2.2.4.2生產前檢查菌種特性，合格後用於生產。
2.3原液製備2.3.1生產用種子將工作種子批菌種啟開後，接種於改良沙保羅培養基或其他適宜培養基，置37℃培養傳代，一般不超過24小時，由此製備適宜數量的生產用工作種子。
2.3.2生產用培養基用pH7.2-7.4的改良沙保羅培養基或國家藥品管理當局批准的其他培養基。培養基中不含對人體有害或其他過敏原物質。
2.3.3菌種接種和培養採用密封三角燒瓶種法，接種後置37℃搖床培養22-24小時，在培養過程中滅菌前取樣做純菌試驗，塗片染色鏡檢、如發現雜菌，應廢棄。
2.3.4收集和殺菌培養結束後，立即加熱100℃，10-30分鐘滅菌，然後加入終濃度為1.0％-1.2％的甲醛溶液，置37℃，7天，取樣種於改良沙保羅培養基做無菌試驗，4℃離心洗滌去甲醛後，加無菌PBS洗二次PBS補至原量，置2-8℃保存。
2.4原液檢定按3.1項進行。
2.5半成品配製單批或多批檢定合格的原液合併，用PBS稀釋，與原液混合，使每1ml含組織胞漿菌1×109。
2.6半成品檢定按3.2項進行。
2.7分批按本版規程通則生物製品分批規程進行。《中國生物製品規程》2000年版，生物製品標準化委員會編，P132.8分裝或凍幹。
按本版規程通則生物製品分裝規程進行。《中國生物製品規程》2000年版，生物製品標準化委員會編，P14
2.9規格本品規格為每小瓶1-5×109/ml，內含適量保護劑。
2.10包裝按本版規程通則生物製品包裝規程進行。《中國生物製品規程》2000年版，生物製品標準化委員會編，P163檢定3.1原液檢定3.1.1無雜菌。
3.1.2無菌試驗按本版規程通則生物製品無菌試驗規程A項進行。《中國生物製品規程》2000年版，生物製品標準化委員會編，P29-343.1.3濃度測定參考「中國細菌濁度標準」進行濃度測定，相當每1毫升含菌應為1×109稀釋時按此濃度計算，誤差不超過10％。
3.1.4原液保存原液靜置保存於2-8℃。
原液採集保存期，自原液合併之日起不超過4個月。保存期自採集滅菌之日起不超過6個月。
3.2半成品檢定3.2.1無菌試驗按本版規程通則生物製品無菌試驗規程A項進行。《中國生物製品規程》中國生物製品標準化委員會編，P29-343.2.2製劑濃度每1ml含組織胞漿菌1×109。
3.3成品檢定3.3.1鑑別試驗與本菌的特異性免疫血清進行玻片凝集試驗，應呈明顯凝集反應。
3.3.2外觀為白色混懸液或白色凍乾粉針劑、溶解後應為乳白色混懸液，不應含有搖不散的凝塊或異物。
3.3.3化學檢定按本版規程附錄生物製品化學及其他檢定方法進行。《中國生物製品規程》中國生物製品標準化委員會編，P669-696。
3.3.3.1PH值為6-7。
3.3.3.2游離甲醛含量不應高於0.1g/L。
3.3.3.3乳糖按現行《中國藥典》2000年版，中國生物製品標準化委員會編P600-603進行。含乳糖。
3.3.4無菌試驗按本版規程通則生物製品無菌試驗規程A項進行。《中國生物製品規程》2000年版，中國生物製品標準化委員會編，P29-34。
3.3.5異常毒性試驗按本版規程通則生物製品異常毒性試驗規程進行。小鼠注射0.5ml，豚鼠注射5ml。《中國生物製品規程》2000年版，中國生物製品標準化委員會編，p40
3.3.6濃度測定用「中國細菌濁度標準」進行濃度測定，每小瓶含組織酵母菌1-5×109/ml。
3.3.7質量標準適應症接種後能提高機體特異性免疫，用於預防組織酵母菌病感染。
組織酵母菌素的製造方法在完成組織酵母菌疫苗的(3、1、4)製造程序基礎上，取上述合併後的組織酵母菌原液離心洗滌三次，用超聲波充分粉碎，並同時在-100℃以下反覆凍溶三次，取出，4℃ 12000次/分離心一小時，棄沉澱，取上清，用注射用水1∶100～10000稀釋，通過無菌試驗，異常毒性試驗，調pH6-7，供SARS流行性肺組織酵母菌病或凝似組織酵母菌病患者皮膚試驗之用，每次0.1ml，皮內注射。
權利要求
1.本發明涉及一種SARS流行性肺組織酵母菌疫苗、菌素及其製造方法其特徵是採用SARS流行性肺組織酵母菌經過菌種擴增、滅活、脫毒製成特異性預防疫苗，或經過人工方法進行減毒製成減毒預防活疫苗，供預防組織酵母菌傳染之用。用上述同源菌種經離心洗滌、超聲粉碎、反覆凍溶製造組織酵母菌素，或用其他方法處理後生產特異性診斷試劑，或作科學研究、基因序列測試和商業用途用、藥物篩選實驗。
2.根據權利要求1或2所述的組織酵母菌疫苗的滅活方法，其特徵是採用100℃ 1-60分鐘，或60-95℃，1-10小時，用1-3％甲醛滅活和脫毒方法製造組織酵母菌滅活疫苗。
3.如權利要求1或2所述的組織胞漿菌疫苗的使用含量，可分裝1-5ml和含菌數為10×108/ml，採用組織酵母菌減毒活疫苗的劑量是滅活疫苗減量的2-20倍。用人工減毒的組織酵母菌活菌參照本製造方法或其他適宜的方法製造組織胞漿菌減毒活疫苗。
4.根據如權利要求1所述的組織酵母菌疫苗，可製成噴喉用氣霧劑、滴鼻用的滴劑、舌下含的片劑、皮下或肌肉注射的針劑和凍乾粉針劑等。
5.根據如權利要求1所述的組織酵母菌素，其特徵是採用滅活的組織酵母菌，經多次洗滌，超聲波粉碎和反覆凍溶，用適宜的溶劑，以1∶100-10000稀釋，供組織酵母菌病特異性診斷之用。
全文摘要
本發明提供一種採用SARS流行性肺組織酵母菌為原料通過菌種擴增、滅活、脫毒等程序，製成SARS流行性肺組織酵母菌氣霧劑、片劑、注射用針劑預防疫苗。用於SARS流行性肺組織酵母菌感染特異性預防。採用上述同源的SARS流行性肺組織酵母菌原液、經洗滌、超聲粉碎和反覆凍溶以製成1∶100～10000組織酵母菌素，供SARS流性肺組織酵母菌病或疑似患者特異性診斷之用。本菌或作科學研究、「非典」基因序列測試等用途。
文檔編號A61K35/76GK1462635SQ0312657
公開日2003年12月24日 申請日期2003年5月16日 優先權日2003年5月16日
發明者餘國華 申請人:餘國華