一種活體細胞表面形貌原子力顯微鏡快速精確表徵方法與流程
2023-06-21 05:48:26 2
本發明涉及細胞研究領域的形貌表徵方法，且特別涉及一種活體細胞表面形貌原子力顯微鏡快速精確表徵方法。
背景技術：
：細胞作為生命體的最小功能單位，其本身的性質(如表面形貌、體積等)與生命過程直接相關，這些細胞性質的檢測研究具有重要的生物學與臨床意義。原子力顯微鏡(AtomicForceMicroscope，AFM)，一種可用來研究包括絕緣體在內的固體材料表面結構的分析儀器。它通過檢測待測樣品表面和一個微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來研究物質的表面結構及性質。將一對微弱力極端敏感的微懸臂一端固定，另一端的微小針尖接近樣品，這時它將與其相互作用，作用力將使得微懸臂發生形變或運動狀態發生變化。掃描樣品時，利用傳感器檢測這些變化，就可獲得作用力分布信息，從而以納米級解析度獲得表面形貌結構信息及表面粗糙度信息。原子力顯微鏡(AFM)作為近年來發展起來的一種納米級成像與力學測量手段，不僅具有納米級的空間解析度，同時原子力顯微鏡還可以在溶液(如細胞培養液、生理緩衝液等)中進行測量，可以充分保證被測量細胞的活性。因此，原子力顯微鏡已成為研究活體細胞表面形貌的有力工具。但是原子力顯微鏡在細胞學研究中也存在著一些不足之處，其中之一是當原子力顯微鏡在對細胞進行掃描時，探針與細胞表面間作用力會引起細胞膜形變，使所獲得的細胞形貌偏離其真實形貌。由於細胞表面非常柔軟，所以即使成像作用力控制在皮牛量級，仍將引起細胞膜顯著形變。雖然已有研究通過記錄細胞表面每一點的原子力顯微鏡力曲線與高度信息，然後通過計算獲得了理論上零作用力情況下的細胞形貌圖像。但是該類方法往往紀錄數據時間較長，導致測量時間解析度過低，不適合細胞快速變化過程的研究。技術實現要素：本發明提出一種活體細胞原子力顯微鏡快速精確表徵方法，具有較高精度，較高時間解析度等特點。為了達到上述目的，本發明提出一種活體細胞原子力顯微鏡快速精確表徵方法，包括如下步驟：步驟一：使用原子力顯微鏡獲取細胞表面彈性值基本穩定的作用力範圍，及其對應楊氏模量值；步驟二：使用原子力顯微鏡獲得活體細胞在設定成像力下的來回掃描高度圖像；步驟三：對探針與細胞間相互作用進行受力分析，將兩者間相互作用分解為豎直成像力與水平側向力；步驟四：根據成像力大小、在此力下細胞表面形貌、細胞表面彈性係數計算獲得細胞在未受作用力時細胞表面形貌。進一步的，所述步驟一為使用原子力顯微鏡獲取細胞頂部處的力曲線,獲得不同作用力下細胞彈性模量。進一步的，所述細胞表面彈性值基本穩定的作用力範圍為10-1000pN。進一步的，所述步驟二為使用原子力顯微鏡接觸模式，調節成像力至步驟一所獲作用力範圍，測得活體細胞的高度及摩擦力的來回掃描圖像。進一步的，所述步驟二為使用原子力顯微鏡接觸模式，調節成像力至930pN，對活體細胞進行高度成像，成像速率為2Hz，記錄來回掃描圖像。進一步的，所述步驟三中細胞實際表面上一點(x0,y0)在探針作用下，在第一次掃描時移動至(x1,y1)，在第二次掃描時移動至(x2,y2)，當δ1、δ2分別為細胞表面法向形變時，則上述變量關係如公式1：同時δ1、δ2又必須滿足赫茲模型，即公式2：δ1=2(F|cosθ|+f1|sinθ|)(1-v2)|πEtan(α)|δ2=2(F|cosθ|-f2|sinθ|)(1-v2)|πEtan(α)|;]]>細胞表面所受水平側向力與該點豎直高度成線性比例，即公式3：f1=py1f2=py2;]]>使用迭代法聯解公式1-3，可得到校正後各接近實際情況的細胞形狀，其中所述θ為細胞剖面的切向角，F為成像力，v為細胞泊松比，E為細胞楊氏模量，α為原子力顯微鏡探針尖的開放角，p為比例常數。進一步的，所述活體細胞為貼壁培養活體細胞。進一步的，所述活體細胞按照如下方法培養：將細胞培養瓶中的培養液除盡，向細胞培養瓶中加入4ml0.025％胰酶溶液，晃動培養瓶以確保培養瓶底部所有區域均被胰酶溶液所覆蓋；立即從培養瓶中吸出3ml胰酶溶液，將培養瓶置於培養箱中1-5分鐘；在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，當觀察到細胞形態變圓後，輕敲培養瓶使細胞從瓶壁脫落；向培養瓶中加入3ml培養液中止胰酶，並將培養瓶中全部溶液轉移到15ml無菌離心管中，再向培養瓶中加入3ml培養液，並用吸管吹打底面數次，然後將溶液移入上述離心管中；180xg離心7分鐘，棄去上清，並向離心管中加入4ml培養液，吹散沉澱形成新的細胞懸浮液；根據實驗時樣品細胞生長密度要求，移出一定量懸浮液至無菌培養皿或放有無菌玻片的培養皿中；向培養皿中再加入4ml培養液，將培養皿置於37℃，5％CO2培養箱中培養；培養12至48小時後取出，對活體細胞進行原子力顯微鏡成像。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：與傳統原子力顯微鏡細胞表面形貌表徵相比，修正了成像力造成的細胞表面形變，本發明的方法具有精度高的特點；與記錄細胞表面每一點的原子力顯微鏡力曲線與高度信息，然後通過計算獲得了理論上零作用力情況下的細胞形貌圖像的方法相比，本發明的方法具有測量、計算量少、可快速獲得細胞表面形貌、時間解析度高的特點，更加適用於快速變化過程的細胞表面形貌研究。附圖說明圖1所示為本發明較佳實施例的活體細胞原子力顯微鏡快速精確表徵方法流程圖。圖2所示為內皮細胞頂部以及培養皿基底表面獲得的原子力顯微鏡力曲線示意圖。圖3所示為人臍靜脈內皮細胞原子力顯微鏡成像獲得的高度形貌圖。圖4和圖5所示為原子力顯微鏡掃描成像時細胞受到的豎直成像力與水平側向力受力分析示意圖。圖6所示為基於同一細胞剖面trace和retrace高度曲線的校正前後曲線示意圖。具體實施方式以下結合附圖給出本發明的具體實施方式，但本發明不限於以下的實施方式。根據下面說明和權利要求書，本發明的優點和特徵將更清楚。需說明的是，附圖均採用非常簡化的形式且均使用非精準的比率，僅用於方便、明晰地輔助說明本發明實施例的目的。請參考圖1，圖1所示為本發明較佳實施例的活體細胞原子力顯微鏡快速精確表徵方法流程圖。本發明提出一種活體細胞原子力顯微鏡快速精確表徵方法，包括如下步驟：步驟一S100：使用原子力顯微鏡獲取細胞表面彈性值基本穩定的作用力範圍，及其對應楊氏模量值；步驟二S200：使用原子力顯微鏡獲得活體細胞在設定成像力下的來回掃描高度圖像；步驟三S300：對探針與細胞間相互作用進行受力分析，將兩者間相互作用分解為豎直成像力與水平側向力；步驟四S400：根據成像力大小、在此力下細胞表面形貌、細胞表面彈性係數計算獲得細胞在未受作用力時細胞表面形貌。根據本發明較佳實施例，所述步驟一為使用原子力顯微鏡獲取細胞頂部處的力曲線,獲得不同作用力下細胞彈性模量。隨著探測作用力增大，細胞形變增大，在最初一定範圍內測得的楊氏模量主要為細胞表面彈性，其值基本穩定，隨著探針更深的壓入細胞，細胞核、基底等對測得楊氏模量值的貢獻逐漸增大，測得楊氏模量值也會隨之增加。因此通過測量獲得細胞表面彈性值基本穩定的作用力範圍，及其對應楊氏模量值。使用原子力顯微鏡接觸模式力曲線測試模塊分別測量人臍靜脈內皮細胞頂部以及培養皿基底表面力曲線(如附圖1所示)，其作用力範圍從0至1.2nN連續增加；使用赫茲模型計算不同作用力下細胞表面彈性值，獲得細胞表面彈性值基本穩定的作用力範圍為10-1000pN，在此範圍內其楊氏模量穩定在5.2kPa左右。所述步驟二為使用原子力顯微鏡接觸模式，調節成像力至步驟一所獲作用力範圍，測得活體細胞的高度及摩擦力的來回掃描(trace和retrace)圖像。進一步的，所述步驟二為使用原子力顯微鏡接觸模式，調節成像力至930pN，對活體細胞進行高度成像，成像速率為2Hz，記錄來回掃描圖像(如附圖2所示)。本發明可在5分鐘內獲得細胞表面無外力作用下的形貌圖像，其圖像像素點為512X512。請參考圖4和圖5，圖4和圖5所示為原子力顯微鏡掃描成像時細胞受到的豎直成像力與水平側向力受力分析示意圖。所述步驟三中細胞實際表面上一點(x0,y0)在探針作用下，在第一次掃描時移動至(x1,y1)，在第二次掃描時移動至(x2,y2)，當δ1、δ2分別為細胞表面法向形變時，則上述變量關係如公式1：x1=x0+δ1|sinθ|y1=y0-δ1|cosθ|,{x2=x0-δ2|sinθ|y2=y0-δ2|cosθ|;]]>同時δ1、δ2又必須滿足赫茲模型，即公式2：δ1=2(F|cosθ|+f1|sinθ|)(1-v2)|πEtan(α)|δ2=2(F|cosθ|-f2|sinθ|)(1-v2)|πEtan(α)|;]]>細胞表面所受水平側向力與該點豎直高度成線性比例，即公式3：f1=py1f2=py2;]]>使用迭代法聯解公式1-3，可得到校正後各接近實際情況的細胞形狀，其中所述θ為細胞剖面的切向角，F為成像力，v為細胞泊松比，E為細胞楊氏模量，α為原子力顯微鏡探針尖的開放角，p為比例常數。根據本發明較佳實施例，所述活體細胞為貼壁培養活體細胞。進一步的，所述活體細胞按照如下方法培養：將細胞培養瓶中的培養液除盡，向細胞培養瓶中加入4ml0.025％胰酶溶液，晃動培養瓶以確保培養瓶底部所有區域均被胰酶溶液所覆蓋；立即從培養瓶中吸出3ml胰酶溶液，將培養瓶置於培養箱中1-5分鐘；在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，當觀察到細胞形態變圓後，輕敲培養瓶使細胞從瓶壁脫落；向培養瓶中加入3ml培養液中止胰酶，並將培養瓶中全部溶液轉移到15ml無菌離心管中，再向培養瓶中加入3ml培養液，並用吸管吹打底面數次，然後將溶液移入上述離心管中；180xg離心7分鐘，棄去上清，並向離心管中加入4ml培養液，吹散沉澱形成新的細胞懸浮液；根據實驗時樣品細胞生長密度要求，移出一定量懸浮液至無菌培養皿或放有無菌玻片的培養皿中；向培養皿中再加入4ml培養液，將培養皿置於37℃，5％CO2培養箱中培養；培養12至48小時後取出，對活體細胞進行原子力顯微鏡成像。雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明。本發明所屬
技術領域：
中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾。因此，本發明的保護範圍當視權利要求書所界定者為準。當前第1頁1 2 3