一種豹紋鰓棘鱸微衛星dna分子標記的構建方法

2023-06-21 14:53:41 1

一種豹紋鰓棘鱸微衛星dna分子標記的構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記的構建方法，該方法通過轉錄組測序篩選到含有豹紋鰓棘鱸微衛星重複序列的Unigene，然後在Unigene序列中檢測到微衛星位點；根據位點兩端序列設計微衛星標記的特異性引物，並檢測其多態性，開發豹紋鰓棘鱸多態性豐富的微衛星標記。並進一步驗證了其中7個豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記，本發明中的豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記可應用於豹紋鰓棘鱸種群的種群遺傳結構和遺傳育種等研究。
【專利說明】一種豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記的構建方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於微衛星分子標記【技術領域】，具體涉及一種豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子 標記的構建方法。

【背景技術】
[0002] 豹紋觸棘S盧（PlectropomusIeopardus)隸屬於S盧形目、飽科、觸棘S盧屬，是我國 重要南方重要的養殖魚類。近些年來，高強度的捕撈壓力已經使得豹紋鰓棘鱸資源處於 過度捕撈狀態。為了保護和管理豹紋鰓棘鱸漁業資源，研究其種群遺傳結構和遺傳變異 水平是非常必要的。微衛星分子標記因具有多態性高、共顯性等優點已經成為目前海水 魚類群體遺傳分析最常用的手段。然而，迄今為止針對豹紋鰓棘鱸開發的微衛星分子標 記只有 35 個（MolecularEcologyResources9:1485 - 1487!Conservationgenetics Resources5:1067 - 1069!ConservationgeneticsResources2:101 - 103)，數量非常有 限，亟待開發更多新的豹紋鰓棘鱸微衛星分子標記。另一方面，目前豹紋鰓棘鱸微衛星開發 主要採用富集文庫法，需要進行DNA提取、基因組文庫構建、探針雜交富集、克隆篩選等步 驟，費時費力，通常只能得到數十個標記。因此急需一種豹紋鰓棘鱸高效的微衛星分子標記 開發技術。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的在於提供一種豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記的構建方法，該方法 高效、簡便，耗時短，能一次開發較多豹紋鰓棘鱸微衛星分子標記。
[0004] 本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：一種豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分 子標記的構建方法，含有以下步驟：
[0005] (1)豹紋鰓棘鱸轉錄組測序提取豹紋鰓棘鱸樣品的總RNA，經含mRNA富集、片 段化mRNA、合成cDNA、末端修復以及加"A"連接工序，建立測序文庫，採用IlluminaHi SeqTM2000測序，獲得豹紋鰓棘鱸原始序列；
[0006] (2)豹紋鰓棘鱸Unigene的獲得及微衛星位點的檢測將轉錄組測序獲得的原始序 列去除接頭和Q值< 10的低質量片段序列後獲得高質量序列，高質量序列進行從頭組裝得 到豹紋觸棘S盧的Unigene,然後在Unigene序列中進行微衛星位點查找，得到多個微衛星位 佔.
[0007] (3)選取多個微衛星位點中的部分微衛星位點進行驗證，根據該部分微衛星位點 的兩端序列設計該微衛星位點的特異性引物，提取豹紋鰓棘鱸基因組DNA，採用該微衛星位 點的特異性引物進行PCR擴增，採用軟體CerVus2. 0進行檢測，檢測到的部分微衛星位點 即為豹紋鰓棘鱸的部分微衛星DNA分子標記，根據不同的微衛星位點設計不同的特異性引 物，即可逐一驗證不同微衛星位點的DNA分子標記。
[0008] 作為本發明的一種優選的實施方式，本發明步驟（2)中採用軟體Trinity對高質 量序列進行從頭組裝得到88813個豹紋觸棘S盧的Unigene,然後用軟體MicroSAtellite在 Unigene序列中進行微衛星位點查找，得到14649個微衛星位點，微衛星位點查找時重複次 數為4?39,其中3716個為單核苷酸重複序列，6332個為二核苷酸重複序列，4020個為三 核苷酸重複序列，310個為四核苷酸重複序列，153個為五核苷酸重複序列，118個為六核苷 酸重複序列。
[0009] 實際上，根據不同的軟體或者不同的測序條件Unigene和微衛星位點的數量會有 稍微的變化，以上僅為採用本發明中的軟體和測序條件而獲得的一種優選的實施方式。
[0010] 本發明步驟（3)中優選選取多個微衛星位點中的7個微衛星位點進行驗證，該7 個微衛星位點的特異性引物如SEQID:1?14所示。
[0011] 實際上，根據檢測到的14649個位點設計特異性引物會有成千上萬，本發明提供 這7對引物只是做驗證，驗證根據這些檢測到的位點可以設計引物把它擴增出來，從而證 明這種方法可以檢測到大量的開發微衛星位點並可以根據這些位點設計特異性引物。
[0012] 本發明對於剩餘的其他位點，也需要設計其他引物擴增出來，本發明僅是隨機檢 測了其中的7個，就是說明可以採用本發明中的方法，對所有的微衛星位點如14649個進行 確認。
[0013] 本發明步驟（3)中特異性引物的設計時引物長度優選為20?25bp，退火溫度優選 為50?60度，PCR擴增產物長度優選在100?400bp。
[0014] 本發明步驟（3)中PCR擴增時採用的反應體系優選為：在20μL反應體系中包括： 0.5以]?特異性引物，0.21111(1階？，1.511111%(：12，1\?0?1311打61'，川了&9〇嫩聚合酶以及50叩 模板DNA，反應程序：94°C5min，94°C30s，每個微衛星位點的退火溫度30s，72°C30s，最後 延伸5min。
[0015] 本發明步驟（3)中獲得的豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記可應用於豹紋鰓棘鱸種 群的種群遺傳結構和遺傳育種研究。
[0016] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：本發明可以一次性檢測到大量的開發微 衛星位點並可以根據這些位點設計特異性引物，該方法高效、簡便，耗時短。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是實施例1中轉錄組測序獲得的豹紋觸棘S盧Unigene;
[0018] 圖2是實施例1中在Unigene序列中檢測到的豹紋鰓棘鱸微衛星位點；
[0019] 圖3是實施例1中位點DXl?DX7在30尾豹紋鰓棘鱸基因組DNA的 MICROSATELLITE分型圖。

【具體實施方式】
[0020] 下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。
[0021] 實施例1
[0022] 豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記的構建方法，含以下步驟：
[0023] 1、豹紋鰓棘鱸轉錄組測序：
[0024] 採用常規Trizol法提取樣品總RNA，DNaseI酶消化總RNA中的DNA，通過帶有 Oligo(dT)的磁珠與mRNA的3'polyA在相互吸附從而富集mRNA，加熱下將mRNA與打斷試 劑作用後，在冰上用乙醇沉澱回收產物，在PCR儀上合成雙鏈cDNA，在Thermomixer中進行 末端修復，使修復產物在3'末端加上鹼基A，再使adapter和加〃A〃產物連接，純化回收擴 增構建文庫，使用IlluminaHiSeq?2000測序。
[0025] 2、豹紋鰓棘鱸Unigene的獲得及微衛星位點的檢測
[0026] 將轉錄組測序獲得的原始序列用去除接頭和低質量（質量值Q< 10)片段序列 之後獲得高質量序列，再使用軟體Trinity對序列進行從頭組裝得到豹紋鰓棘鱸88813個 Unigene(圖1)，然後用軟體MicroSAtellite(MISA)在Unigene序列中檢測14649個微衛 星位點，其中，3716個為單核苷酸重複序列，6332個為二核苷酸重複序列，4020個為三核苷 酸重複序列，310個為四核苷酸重複序列，153個為五核苷酸重複序列，118個為六核苷酸重 復序列，重複次數4-39 (表1，圖2)，選取其中的7個微衛星位點，再用軟體Primer3根據這 7個微衛星位點兩端序列設計微衛星標記的特異性引物。
[0027] 3、豹紋鰓棘鱸多態性微衛星位點的驗證
[0028] 提取30尾豹紋鰓棘鱸基因組DNA，用7對特異性引物進行PCR擴增，反應體系為 20μ?:0·5μΜ引物，0.2mMdNTP，1.5mMMgC12，lXPCRbuffer，lUTaqDNA聚合酶以及 50ng模板DNA。反應程序：94°C5min，94°C30s，每個SSR位點最佳退火溫度30s，72°C30s， 最後延伸5min。PCR產物用ABIPRISM3730DNA自動測序儀分離，片段長度用軟體 GeneMapper根據內標R0X-500確定。軟體Cervus2. 0檢測7個微衛星位點（DX1?DX7)的等 位基因數目為4-12,觀測雜合度和期望雜合度分別為0. 1180-0. 2432和0. 7568-0. 8820 (表 2,圖 3)。
[0029] 表1豹紋鰓棘鱸轉錄組測序檢測到的微衛星位點
[0030]
[

【權利要求】
1. 一種豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記的構建方法，其特徵是含有以下步驟： (1) 豹紋鰓棘鱸轉錄組測序提取豹紋鰓棘鱸樣品的總RNA，經含mRNA富集、片段 化mRNA、合成cDNA、末端修復以及加"A"連接工序，建立測序文庫，採用Illumina Hi SeqTM2000測序，獲得豹紋鰓棘鱸原始序列； (2) 豹紋鰓棘鱸Unigene的獲得及微衛星位點的檢測將轉錄組測序獲得的原始序列去 除接頭和Q值< 10的低質量片段序列後獲得高質量序列，高質量序列進行從頭組裝得到豹 紋觸棘S盧的Unigene，然後在Unigene序列中進行微衛星位點查找，得到多個微衛星位點； (3) 選取多個微衛星位點中的部分微衛星位點進行驗證，根據該部分微衛星位點的兩 端序列設計該微衛星位點的特異性引物，提取豹紋鰓棘鱸基因組DNA，採用該微衛星位點的 特異性引物進行PCR擴增，採用軟體Cervus2.0進行檢測，檢測到的部分微衛星位點即為豹 紋鰓棘鱸的部分微衛星DNA分子標記，根據不同的微衛星位點設計不同的特異性引物，即 可逐一驗證不同微衛星位點的DNA分子標記。
2. 根據權利要求1所述的豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記的構建方法，其特徵是： 步驟（2)中採用軟體Trinity對高質量序列進行從頭組裝得到88813個豹紋鰓棘鱸的 Unigene，然後用軟體MicroSAtellite在Unigene序列中進行微衛星位點查找，得到14649 個微衛星位點，微衛星位點查找時重複次數為4?39,其中3716個為單核苷酸重複序列， 6332個為二核苷酸重複序列，4020個為三核苷酸重複序列，310個為四核苷酸重複序列， 153個為五核苷酸重複序列，118個為六核苷酸重複序列。
3. 根據權利要求1所述的豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記的構建方法，其特徵是：步 驟（3)中選取多個微衛星位點中的7個微衛星位點進行驗證，該7個微衛星位點的特異性 引物如SEQ ID :1?14所示。
4. 根據權利要求1所述的豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記的構建方法，其特徵是：步 驟⑶中特異性引物的設計時引物長度20?25bp，退火溫度50?60度，PCR擴增產物長 度在100?400bp。
5. 據權利要求1所述的豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記的構建方法，其特徵是：步驟 (3)中PCR擴增時採用的反應體系：在20 ii L反應體系中包括：0. 5 ii M特異性引物，0. 2mM dNTP，1.5mM MgCl2，lXPCR buffer，lU Taq DNA 聚合酶以及 50ng 模板 DNA，反應程序： 94°C 5min，94°C 30s，每個微衛星位點的退火溫度30s，72°C 30s，最後延伸5min。
6. 據權利要求1所述的豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記的構建方法，其特徵是：步驟 (3)中獲得的豹紋鰓棘鱸微衛星DNA分子標記可應用於豹紋鰓棘鱸種群的種群遺傳結構和 遺傳育種研究。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357547SQ201410476390
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】蒙子寧, 謝楨楨, 於萃平, 李波, 劉曉春, 張勇, 林浩然 申請人:中山大學