一種尾葉紫薇微衛星dna分子標記及應用的製作方法

2023-06-21 15:10:21

專利名稱：一種尾葉紫薇微衛星dna分子標記及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及DNA分子標記技術，具體地說，涉及一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記 及其應用。
背景技術：
尾葉紫薇(Lagerstroemia caudata)，屬千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬落葉大喬 木，高18 30米，胸徑約40釐米；樹皮光滑，褐色，成片狀剝落；全株無毛；花期4-5月，果 期7-10月。尾葉紫薇開花繁密，香味濃鬱，是培育芳香紫薇品種的優良親本。其在石灰巖 石山稍蔭蔽的山坡上生長良好，萌櫱力較強，是石灰巖石山優良綠化樹種之一。同時，尾葉 紫薇木材堅硬、紋理細緻，淡黃色，適於作上等家俱、室內裝修、細工或雕刻等用材。尾葉紫 薇原產於我國，已被列為瀕危植物(《中國物種紅色名錄》第一卷，高等教育出版社，2004)。目前僅有關於尾葉紫薇單一種群結構的研究(黃晨暉等，2008，尾葉紫薇種群結 構和動態的初步研究，熱帶林業，36 (4)，24 26)，而關於尾葉紫薇資源分布、種群遺傳多 樣性和種質資源保護等方面的研究尚未見報導。簡單重複序列(simple sequence repeat, SSR)，也稱微衛星DNAOiiicrosatellite)，是一種由2 5個核苷酸為單位多次串聯重複的 長達幾十甚至幾百個核苷酸的序列。這些序列廣泛存在於真核生物基因組的不同座位上， 每個座位重複單位的數量可能不完全相同，因而形成多態性。由於其具有多態性豐富、重複 性高、共顯性遺傳等優點，被廣泛應用於植物的群體和進化遺傳研究、種質資源遺傳多樣性 分析、指紋圖譜構建等領域。因此，開發尾葉紫薇微衛星標記，利用其研究尾葉紫薇資源遺 傳多樣性和種群結構，對尾葉紫薇種質資源的保護和利用具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記。本發明的另一目的是提供上述DNA分子標記的篩選方法。本發明更進一步的目的是提供上述DNA分子標記在尾葉紫薇遺傳多樣性研究中 的應用。為了實現本發明目的，本發明的一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記，其中擴增所 述分子標記的引物選自如下引物對DllGF 5' -GTCACAGGTTACCGAATC-3『IlGR 5' -ATGTAAATGGTGAGGAGG-3『2)I2BF 5' -TTCTTGTCTTGGGTATCGC-3『I2BR 5' -GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3『3)12GF 5, -TTCTTCCACTTCCTCCTT-3『I2GR 5' -CAGCCCACATTAACTTTT-3『4)12HF 5『 -AAAGACGCAGAAGGATGG-3『I2HR 5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3『
5)I3GF 5' -ATGTGGTGAATGGGAACT-3『I3GR 5' -TTGGGCTAAAGATATGGA-3『6)I9HF 5『 -GGACCAGATTGTAAATGC-3『I9HR 5' -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3『7)IlOHF 5' -ATTCGATCTGCCCTCTTG-3『IlOHR 5' -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3『8)112HF 5『 -TCCCTTTAACGAGGAATG-3『I12HR 5' -AAGTTTCTCGACGGCTTT-3『9)IIlCF 5' -GTGCTGGAGGAACTGCTA-3『IIlCR 5' -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3『10)II2CF 5' -TTTGGTGGTAGTGGGAGT-3『II2CR 5' -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3『11)II3AF 5『 -CCTAACAAGAAAGGAACAG-3『II3AR 5' -TTTCAGGACATCAGCACC-3『12)II3HF 5『 -CCTCCTCCTGCCACTCCTCT-3『II3HR 5' -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3『13)II6AF 5『 -AGTTACTTATCTCCGCATTC-3『II6AR 5' -GACCATTTTACCCTTTCA-3『14)II8AF 5『 -AAGATATGCTGTTGAGTTT-3『II8AR 5' -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3『15)II12AF 5『 -CAACAGTAAAATTGGAGC-3『II12AR 5' -AGTAGTGATTCGGGTGGA-3『前述的DNA分子標記，其選自編號分別為11G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、110H、112H、 II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A 的核苷酸序列，所述核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 至 SEQID No. 15 所示。本發明的一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記的篩選方法，其包括以下步驟(1)提取尾葉紫薇基因組DNA，用內切酶Rsa I進行酶切，得到大小為300 IOOObp的 DNA 片段； (2)將寡核苷酸 SuperSNX24F (5，-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3，)和末端磷酸化 的 SuperSNX24R(5，-pGATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA_3，)等摩爾混合，形成接頭；(3)將步驟⑵的接頭與步驟(1)的酶切產物連接；(4)以SuperSNX24F為引物，步驟(3)的連接產物為模板，進行PCR反應，富集大小 為300 IOOObp的DNA片段；(5)合成3，Biotin標記的探針20種，將其按照要求[Group2 = (AG)12, (TG)12, (AAC)6, (AAG)8, (AAT)12, (ACT)12, (ATC)8 ；Group3 = (AAAC)6, (AAAG)6, (AATC)6, (AATG)6, (ACAG)6, (ACCT)6, (ACTC)6, (ACTG)6 ；Group4 = (AAAT)8, (AACT)8, (AAGT)8, (ACAT)8, (AGAT)8] 等體積混合(所有探針濃度均為100 μ Μ)，將混合好的探針稀釋100倍待用；(6)將步驟(4)的DNA片段分別與步驟(5)三組探針進行雜交；(7)向雜交後的溶液中加入磁珠，洗滌磁珠；
(8)向洗滌後的磁珠中加入TE，得到含有微衛星DNA片段的上清液；(9)以SuperSNX24F為引物，步驟(7)的上清液為模板，進行PCR反應，得到目的片 段；(10)將步驟(8)的擴增產物轉化至大腸桿菌中，篩選轉化子，進行PCR擴增，對產 物大小為500 1200bp的菌液進行測序，得到50個微衛星序列，其中包含微衛星位點60 個；(11)根據微衛星位點兩端的側翼序列設計引物並以8株尾葉紫薇個體基因組DNA 為模板進行SSR-PCR擴增，得到尾葉紫薇微衛星標記15個，其編號分別為I1G、I2B、I2G、 I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 15 所示。
利用本發明的尾葉紫薇微衛星DNA分子標記分析尾葉紫薇個體間的遺傳學差異， 具體分析方法為
(1)分別對I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、 II12A位點的特異性引物的正向引物的5』端進行6-FAM或JOE標記；
(2)提取尾葉紫薇不同個體的基因組DNA；
(3)分別用標記後的I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、 II6A、II8A、II12A位點的特異性引物，擴增20株尾葉紫薇的基因組DNA。
所述特異性引物的序列分別為
IlGF IlGR I2BF I2BR I2GF I2GR I2HF I2HR I3GF I3GR I9HF I9HR IlOHF 5 IlOHR 5 I12HF 5 I12HR 5 IIlCF 5 IIlCR 5 II2CF 5 II2CR 5 II3AF 55' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5'
-JOEGTCACAGGTTACCGAATC-3 『
-ATGTAAATGGTGAGGAGG-3『
-6_FAMTTCTTGTCTTGGGTATCGC-3 『
-GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3『
-JOETTCTTCCACTTCCTCCTT-3 『
-CAGCCCACATTAACTTTT-3『 _6-faiaaagacgcagmggatgg_3 丨
-CGATTAGTTTCAGCTCGT-3『
_6-famatgtggtgaatgggaact_3 ,
-TTGGGCTAAAGATATGGA-3『 -6_FAMGGACCAGATTGTAAATGC-3 『 -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3『 -JOEATTCGATCTGCCCTCTTG-3 『 -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3『 -6_FAMTCCCTTTAACGAGGAATG-3 『 -AAGTTTCTCGACGGCTTT-3『 -JOEGTGCTGGAGGAACTGCTA-3 『 -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3『 -6_FAMTTTGGTGGTAGTGGGAGT-3 『 -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3『
6-FAM』
CCTAACAAGAAAGGAACAG-31
II3AR 5' -TTTCAGGACATCAGCACC-3『II3HF 5' -J0ECCTCCTCCTGCCACTCCTCT_3『II3HR 5' -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3『II6AF 5' -6_famAGTTACTTATCTCCGCATTC-3『II6AR 5' -GACCATTTTACCCTTTCA-3『II8AF 5' -J0EAAGATATGCTGTTGAGTTT-3『II8AR 5' -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3『II12AF 5' -6_famCAACAGTAAAATTGGAGC-3『II12AR 5' -AGTAGTGATTCGGGTGGA-3『(4)分析PCR產物以及尾葉紫薇DNA多態位點的特徵。本發明的優點在於，提供了 15個尾葉紫薇的微衛星位點及擴增該15個微衛星位 點的引物序列和擴增方法，建立了尾葉紫薇的微衛星DNA分子標記技術體系，並利用這些 標記進行尾葉紫薇遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建和分子標記輔助育種，重複性好，是一種 可靠有效的DNA分子標記。


圖1為本發明IlG位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖2為本發明I2B位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖3為本發明I2G位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖4為本發明I2H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖5為本發明I3G位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖6為本發明I9H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖7為本發明IlOH位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖8為本發明I12H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖9為本發明IIlC位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖10為本發明II2C位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖11為本發明II3A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖12為本發明II3H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖13為本發明II6A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖14為本發明II8A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖15為本發明II12A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；其中，圖1 圖15中1 20分別表示20個不同的尾葉紫薇單株，橫坐標代表擴 增產物大小，縱坐標代表擴增強度。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1尾葉紫薇微衛星文庫的構建包括如下步驟(1)提取尾葉紫薇基因組DNA(DNA secure Plant Kit，購自天根生物)，用內切酶
6Rsa I和Xmn I進行酶切，酶切體系為2. 5 μ L連接緩衝液(NEB)，0. 25 μ L 100 XBSA (NEB), 0. 25 μ L NaCl (5Μ)，1 μ LRsa I (NEB)，1 μ L Xmn I (NEB)，20 μ L DNA(100ng/L)，於 37°C，酶切 40小時，得到大小為300 IOOObp的DNA片段；(2)將 10 μ M 寡核苷酸 SuperSNX24F (5，-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3，)和末端 磷酸化的 SuperSNX24R(5，-pGATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA_3，)等體積混合，95°C變性 10分鐘，緩慢冷卻至室溫，形成接頭；(3)將步驟(2)的接頭7 μ L、T4DNA連接酶(NEB) 2 μ L和10 X連接緩衝液1 μ L混 合後，加入到(1)的酶切產物中，22°C連接2小時後，置於4°C連接40小時以上；(4)以SuperSNX24F為引物，步驟(3)的連接產物為模板，進行PCR反應，體系 為 2.5yL 10XPCR 緩衝液，2. 5μ L BSA, 1. 3 μ LSuperSNX24F (10 μ Μ), 1. 5 μ L dNTPs (各 2. 5mM)，2 μ L MgCl2 (25mM)，13 μ L dH20,0. 2 μ L Taq 酶(5U/ μ L)，2 μ L 連接產物，反應程序 為 95°C 2min ；95°C 20sec,60°C 20sec，72°C 1. 5min，35 個循環反應；15°C保溫。用 2% 的瓊 脂糖凝膠電泳檢測反應產物，富集大小為300 IOOObp的DNA片段；(5)合成3，Biotin標記的探針20種，分為三組，分別按照[Group2 = (AG)12, (TG)12, (AAC)6, (AAG)8, (AAT)12, (ACT)12, (ATC)8 ；Group3 = (AAAC)6, (AAAG)6, (AATC)6, (AATG)6, (ACAG)6, (ACCT)6, (ACTC)6, (ACTG)6 ；Group4 = (AAAT)8, (AACT)8, (AAGT)8, (ACAT)8, (AGAT)8]等體積混合(所有探針濃度均為100 μ M)，將混合好的探針稀釋100倍待用；(6)將步驟(4)的DNA片段分別與步驟(5)的三組探針進行雜交；雜交過程為將 25 μ L 2 X雜交溶液(12 X SSC，0. 2% SDS)，10 μ L生物素標記的一組探針，101 μ L步驟(4) 的DNA片段，5 μ L dH20混合，在PCR儀中進行雜交；雜交程序為95°C 5min,然後迅速降溫 到70°C，再以0. 040C /sec的速率降溫到50°C，然後在50°C保溫lOmin，再以0. 1°C /sec的 速率降溫到40°C，最後迅速降溫到15°C保溫；(7)加入 50 μ L 平衡後的磁珠(10mg/mL, Dynabeads M-280，Invitrogen)，室溫輕 搖30分鐘，使磁架分離，去除溶液；(8)用400 μ L Wl洗液(2 X SSC, 0. 1% SDS)的清洗磁珠2次，棄溶液；用400 μ L W2洗液(1XSSC，0. SDS)清洗磁珠2次，棄溶液；加入400 μ L W2洗液，40°C輕搖2分 鍾，棄溶液；加入400μ LW2洗液，50°C輕搖2分鐘，棄溶液；加入400 μ L W2洗液，45°C輕搖 2分鐘，棄溶液；(9)重複步驟(8) —次;(10)加入200yL TE，95°C保溫5分鐘，磁架分離後，得到含有微衛星DNA片段的
上清液；(11)以SuperSNX24F為引物，步驟(10)的上清液為模板，按照步驟(4)的反應體 系和反應程序進行PCR反應，得到目的片段；(12)將步驟(11)的擴增產物連接到 pCR2. l-T0P0(InvitrogenT0P0 Cloning Kit)載體上，然後將連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，將轉化菌液塗布在含有 50 μ g/mL氨苄青黴素和40mg/mLX-gal的LB固體培養基平板上進行藍白斑篩選。實施例2含尾葉紫薇微衛星序列的陽性克隆的篩選、測序以及尾葉紫薇微衛星引 物的設計包括如下步驟
7
(1)用牙籤挑取72個白色菌落並接種到含50 μ g/mL氨苄青黴素的LB培養基中， 370C，150rmp培養40小時。以菌液為模板，進行PCR反應；PCR 反應體系為2. 5μ L 250 μ g/mL BSA,2. 5μ L 10 X PCR 緩衝液，1 μ L IOmM 引 物M13F 5『-GTAAAACGACGGCCAG-3『, 1 μ L IOmM 引物M13R 5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，，2 μ L 25mM MgCl2,1. 5 μ L 2. 5mM dNTP，0. 2 μ L TaqDNA聚合酶，L 5 μ L菌液，12. 8 μ LdH2O ；反應程 序:95V 3min ；95°C 20sec,50°C 20sec，72°C 1. 5min，35 個循環反應；15°C保溫；(2)用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物，選取PCR條帶單一，產物大小為 500 1200bp的菌液進行測序，得到50個微衛星序列，其中包含微衛星位點60個；(3)根據微衛星位點兩端的側翼序列設計引物並以8株尾葉紫薇個體基因組 DNA為模板進行SSR-PCR擴增，10 μ L反應體系為包括IOng基因組DNA，1 X PCR緩衝液 (IOmM Tris-HCl, 50mM KCl，pH 8. 3)，dNTPs (各 250 μ M)，MgC12 (1. 5mM)，正、反向引物 (各0.5 μ M)，Taq酶(0. 5U)，反應程序為95 °C 3min ；95°C 30sec，最佳退火溫度(48 60°C )30sec,72°C lmin，30個循環反應；72°C 5min，15°C保溫。將各PCR產物在6%變性聚 丙烯醯胺凝膠上檢測各引物多態性，篩選出非特異性條帶擴增少、結果穩定、多態性豐富的 微衛星標記 15 個，分別為 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、 II6A、II8A、II12A，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 15 所示。實施例3利用尾葉紫薇微衛星DNA分子標記分析尾葉紫薇不同個體間的遺傳學差
已 升具體分析方法為(1)分別對 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、 II8A、II12A位點的特異性引物的正向引物的5』端進行6-FAM或JOE標記；(2)提取尾葉紫薇不同單株的基因組DNA (DNA secure PlantKit，購自天根生 物)；(3)分別用 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、 II6A、II8A、II12A位點的特異性引物，擴增20個尾葉紫薇個體的基因組DNA。10 μ L反應體 係為包括 IOng 基因組 DNA，IXPCR 緩衝液(IOmM Tris-HCl，50mM KCl，pH 8. 3)，dNTPs (各 250 μ Μ)，MgCl2 (1. 5mM)，正、反向引物(各 0. 5 μ Μ)，Taq 酶(0. 5U)，反應程序為 95°C 3min ； 950C 30sec，最佳退火溫度(48 60°C )30sec,72°C lmin，30 個循環反應；72°C 5min，15°C
保溫；
所述特異性引物的序列分別為
IlGF5'-JOEGTCACAGGTTACCGAATC-3 『
IlGR5'-ATGTAAATGGTGAGGAGG-3『
I2BF5'-6_FAMTTCTTGTCTTGGGTATCGC-3
I2BR5'-GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3『
I2GF5'-JOETTCTTCCACTTCCTCCTT-3 『
I2GR5'-CAGCCCACATTAACTTTT-3『
I2HF5'_6-FAIaaagacgcagmggatgg_3 丨
I2HR5'-CGATTAGTTTCAGCTCGT-3『
I3GF5'_6-famatgtggtgaatgggaact_3 ,0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
0145]
0146]
0147]
0148]
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
0156]
0157]
0158]
0159]
0160]
I3GR 5' I9HF 5' I9HR 5' IlOHF 5 IlOHR I12HF I12HR IIlCF IIlCR II2CF II2CR II3AF II3AR II3HF II3HR II6AF II6AR II8AF II8AR II12AF 5 II12AR 5
-TTGGGCTAAAGATATGGA-3『 -6_FAMGGACCAGATTGTAAATGC-3 『 -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3『 -JOEATTCGATCTGCCCTCTTG-3 『 -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3『
_6-famtccctttaacgaggaatg_3 ,
-AAGTTTCTCGACGGCTTT-3『 -JOEGTGCTGGAGGAACTGCTA-3 『 -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3『 -6_FAMTTTGGTGGTAGTGGGAGT-3 『 -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3『 -6-FAMCCTAACAAGAAAGGAACAG-3 『 -TTTCAGGACATCAGCACC-3『 -JOECCTCCTCCTGCCACTCCTCT-3 『 -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3『 -6_FAMAGTTACTTATCTCCGCATTC-3 『 -GACCATTTTACCCTTTCA-3『 -JOEAAGATATGCTGTTGAGTTT-3 『 -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3『 『-6_FAMCAACAGTAAAATTGGAGC-3 『 『-AGTAGTGATTCGGGTGGA-3『
0161]所述特異性引物的退火溫度分別為50 0C>50 0C>50°C>50°C>50°C、50°C、50°C、 50°C、52°C、54°C、52°C、60°C、48°C、52°C、54°C。
0162](4)將PCR產物用ABI377遺傳分析儀(Applied Biosystem公司)進行STR基因 分型，使用GeneMapper 4. 0軟體(Applied Biosystem公司)判讀等位基因的具體數值；
0163](5)使用Popgen 1. 32計算期望雜合度、觀察雜合度、多態信息量的值來描述尾葉 紫薇DNA多態位點的特徵，結果如表1所示
0164]表115個尾葉紫薇微衛星多態位點的特徵
0165]
9
權利要求
一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記，其特徵在於，擴增所述分子標記的引物選自如下引物對1)I1GF5′ GTCACAGGTTACCGAATC 3′I1GR5′ ATGTAAATGGTGAGGAGG 3′2)I2BF5′ TTCTTGTCTTGGGTATCGC 3′I2BR5′ GAGCCAGTATTGTCTTCACG 3′3)I2GF5′ TTCTTCCACTTCCTCCTT 3′I2GR5′ CAGCCCACATTAACTTTT 3′4)I2HF5′ AAAGACGCAGAAGGATGG 3′I2HR5′ CGATTAGTTTCAGCTCGT 3′5)I3GF5′ ATGTGGTGAATGGGAACT 3′I3GR5′ TTGGGCTAAAGATATGGA 3′6)I9HF5′ GGACCAGATTGTAAATGC 3′I9HR5′ CTGCTCCTAATATCAGTGTC 3′7)I10HF5′ ATTCGATCTGCCCTCTTG 3′I10HR5′ ACTCGGGTTTACGTGGTG 3′8)I12HF5′ TCCCTTTAACGAGGAATG 3′I12HR5′ AAGTTTCTCGACGGCTTT 3′9)II1CF5′ GTGCTGGAGGAACTGCTA 3′II1CR5′ CACGCTATTCTAAGACAAGG 3′10)II2CF5′ TTTGGTGGTAGTGGGAGT 3′II2CR5′ GTGTCTGCATGGCTGTAA 3′11)II3AF5′ CCTAACAAGAAAGGAACAG 3′II3AR5′ TTTCAGGACATCAGCACC 3′12)II3HF5′ CCTCCTCCTGCCACTCCTCT 3′II3HR5′ CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC 3′13)II6AF5′ AGTTACTTATCTCCGCATTC 3′II6AR5′ GACCATTTTACCCTTTCA 3′14)II8AF5′ AAGATATGCTGTTGAGTTT 3′II8AR5′ TTCACAAAAGAAAGGAAG 3′15)II12AF5′ CAACAGTAAAATTGGAGC 3′II12AR5′ AGTAGTGATTCGGGTGGA 3′
2.如權利要求1所述的DNA分子標記，其選自如SEQID No. 1至SEQ ID No. 15所示的 核苷酸序列。
3.權利要求1或2所述的DNA分子標記在尾葉紫薇篩選或輔助育種中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記，其包括15個尾葉紫薇的微衛星位點。本發明還提供了該尾葉紫薇微衛星DNA分子標記的篩選方法及其在尾葉紫薇遺傳多樣性研究中的應用。此外，本發明還提供了擴增該15個尾葉紫薇微衛星位點的引物序列和擴增方法，建立了尾葉紫薇的微衛星DNA分子標記技術體系，並利用這些標記進行尾葉紫薇遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建和分子標記輔助育種，重複性好，是一種可靠有效的DNA分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK101974617SQ200910244439
公開日2011年2月16日 申請日期2009年12月31日 優先權日2009年12月31日
發明者孫明, 宋平, 張啟翔, 潘會堂, 王學鳳, 田苗, 程堂仁, 蔡明 , 高亦珂 申請人:北京林業大學