幽門螺桿菌vacA－B基因表達工程菌的構建及其產物的製備方法
2023-06-21 12:44:21 1
專利名稱：幽門螺桿菌vacA－B基因表達工程菌的構建及其產物的製備方法
技術領域：
本發明是關於幽門螺桿菌(Hp)細胞空泡毒素A基因片段(vacA-B)表達工程菌的構建及其產物的製備方法，具體內容為採用PCR方法獲取vacA基因的片段B，構建vacA-B基因的表達工程菌，並選擇合適的培養基及培養方法得到表達活力高、表達水平高及純度高的目的蛋白。
幽門螺桿菌細胞空泡毒素A(VacA)具有較高的抗原性；傳統的幽門螺桿菌(Hp)培養方法一般需5-7天，浪費時間，且從菌體中提取該蛋白的工藝煩瑣，回收率低，故採用基因重組技術製備該蛋白是獲得抗原的重要途徑。
本發明的目的是構建幽門螺桿菌vacA-B基因表達的工程菌及其產物的製備方法。
為達到上述目的，本發明所採用的技術方案為一種幽門螺桿菌vacA-B基因表達工程菌的構建，其特殊之處在於選取幽門螺桿菌DNA中vacA基因5』-端909bp的片段B，其核苷酸序列如下ATGGCCTTTTTCACAACCGTGATCATTCCAGCCATTGTTGGGGGTATCGCTACAGGCACCGCTGTAGGAACGGTCTCAGGGCTTCTTAGCTGGGGGCTCAAACAAGCCGAAGAAGCCAATAAAACCCCAGATAAACCCGATAAAGTTTGGCGCATTCAAGCAGGAAAAGGCTTTAATGAATTCCCTAACAAGGAATACGACTTATACAGATCCCTTTTATCCAGTAAGATTGATGGAGGTTGGGATTGGGGGAATGCCGCTAGGCATTATTGGGTCAAAGGCGGGCAACAGAATAAGCTTGAAGTGGATATGAAAGACGCTGTAGGGACTTATACCTTATCAGGGCTTAGAAACTTTACTGGTGGGGATTTAGATGTCAATATGCAAAAAGCCACTTTACGCTTGGGCCAATTCAATGGCAATTCTTTTACAAGCTATAAGGATAGTGCTGATCGCACCACGAGAGTGGATTTCAACGCTAAAAATATCTCAATTGATAATTTTGTAGAAATCAACAATCGTGTGGGTTCTGGAGCCGGGAGGAAAGCCAGCTCTACGGTTTTGACTTTGCAAGCTTCAGAAGGGATCACTAGCGATAAAAACGCTGAAATTTCTCTTTATGATGGTGCCACGCTCAATTTGGCTTCAAGCAGCGTTAAATTAATGGGTAATGTGTGGATGGGCCGTTTGCAATACGTGGGAGCGTATTTGGCCCCTTCATACAGCACGATAAACACTTCAAAAGTAACAGGGGAAGTGAATTTTAACCACCTCACTGTTGGCGATAAAAACGCCGCTCAAGCGGGCATTATCGCTAATAAAAAGACTAATATTGGCACACTGGATTTGTGGCAAAGCGCCGGGTTAAACATTATCGCTCCTCCAGAAGGTGGCTATAAGGATAAATAA上述幽門螺桿菌vacA-B基因表達工程菌構建的步驟如下1)從幽門螺桿菌中提取總DNA；2)用PCR方法從基因組DNA中擴增vacA基因的片段B；3)將vacA基因的片段B連接在表達載體pRSETA上；4)將重組載體vacA-B-pRSETA轉化入大腸桿菌BL21DE3中得到工程菌。
上述用PCR方法從基因組DNA獲取vacA基因的片段B，其PCR引物序列設計如下上遊引物5』GC GGA TCC ATG GCC TTT TTC ACA ACC GTG AT 3』下遊引物5』GC CTG CAG TTA TTT ATC CTT ATA GCC ACC TTC 3』上述vacA-B基因與表達載體pRSETA的連接如下1)PCR所採用兩個引物是根據vacA的基因序列設計的；2)vacA基因片段B的5′端連在表達載體pRSETA的BamH I位點上，3′端連在表達載體pRSETA的Pst I位點上，從而構成重組表達載體vacA-B-pRSETA；一種幽門螺桿菌vacA-B基因表達工程菌的表達產物的製備方法如下1)VacA-B抗原的化學誘導及表達；2)VacA-B的分離及純化；3)VacA-B活性鑑定。
下面結合具體實施例；詳細描述如下一、製備模板在Hp培養平板上挑取生長良好的菌落，提取Hp總DNA，溶於100μL無菌水中，稀釋5倍作為模板。
二、目的片段的擴增PCR反應的總體積為25μL，其中含模板2μL，每種引物各10pmol，2.5mmol/L dNTP混合物2μL，10×PCR Reaction Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl22.5μL，耐熱DNA聚合酶0.75U，加H2O到25μL。PCR擴增反應條件為94℃預變性2min；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸3min，共循環40次。反應結束後在10g/L瓊脂糖凝膠上檢查擴增結果，電泳緩衝液為0.5XTAE，溴化乙錠染色，並在紫外燈下切下目的條帶。
三、PCR產物克隆回收PCR產物，溶於40μL的NE溶液中。取0.5ml的EP管2支，其中一支加入目的片段DNA 20μL，另一支加入含有1μg pGEM-3Zf(-)溶，然後各加入10xBuffer 2.5μL，BamH I 1μL(12U)，Pst I 1μL(15U)30℃溫育2h之後37℃溫育2h。反應結束後進行10g/L瓊脂糖凝膠電泳，同前切下目的條帶。將含雙酶切目的片段的瓊脂糖凝膠與含雙酶切pGEM-3Zf(-)的凝膠按3∶1的比例放在同一1.5ml的EP管中，回收DNA溶於30μL NE溶液中，向回收產物中加入4μL T4 DNA Ligase Buffer，1μL T4 DNA Ligase，於12℃保溫16h。將連接產物5μL轉入JM109感受態細胞，同時以水作空白對照，pGEM-3Zf(-)作陰性對照，在含有Amp(100mg/mL)的LB平板上加入20μL 0.1mol/L IPTG和16μL 5％X-Gal做藍白篩選，挑取白色克隆，培養後提取質粒，同前雙酶切鑑定重組質粒。
四、序列測定選擇經雙酶切鑑定陽性的含重組vacA-B-pGEM-3Zf(-)的菌株，測定vacA-B的序列。
五、表達載體的構建將含重組質粒的細菌擴大培養，提取重組質粒，用BamH I和Pst I雙酶切後，獲得909 bp大小的目的片段。將其與同樣雙酶切處理的載體pRSETA連接，轉入BL21DE3菌，獲得重組表達載體vacA-B-pRSETA，並對其進行雙酶切鑑定。
六、目的蛋白的誘導表達挑取含有vacA-B-pRSETA的單個菌落，接種子LB(含Amp 100mg/L)培養液中，在37℃振搖至A600＝0.4。加入IPTG使終濃度達0.5mmol/L，37℃振搖4h，離心收菌。
七、目的蛋白的表達形式和溶解性分析經分級分離及12％SDS-PAGE分析，表達產物主要以包含體及可溶性蛋白兩種形式存在。表達量佔菌體蛋白40％，包含體佔菌體蛋白30％，可溶性蛋白佔菌體蛋白10％。
八、Western blot分析將誘導菌的全菌做SDS-PAGE，使凝膠靠近陰極一側，硝酸纖維素膜(NC膜)靠近陽極一側，轉移緩衝液為25mmol/L Tris-192mmol/LGlycine-200ml/L甲醇，在100V條件下轉移45min，使蛋白從凝膠電轉移至NC膜上。電轉移結束後，取出NC膜，依次進行亮綠(1g/L亮綠-100ml/L冰乙酸-500ml/L甲醇)染色和三蒸水衝洗終止染色，並用鉛筆在目的條帶兩端作標記。加封閉液(含100g/L脫脂奶粉和0.5mL/L Tween 20的pH7.5 TBS)室溫2h封閉非特異性結合位點後，用TBS洗滌液室溫洗膜4次，每次15min。然後依次加兔抗Vac A多抗(37℃作用1--1.5h，用TBS洗滌液室溫同上洗膜)和HRP標記的羊抗兔二抗(37℃作用1--2h，用TBS洗滌液室溫洗膜6次)。最後，將NC膜浸入DAB顯色液中染色，以蒸餾水衝洗終止反應。
九、目的蛋白純化用Ni-NTA親和層析純化誘導菌的上清和包含體，獲得的目的蛋白純度高。
(1)樣品製備離心收集誘導菌，超聲碎菌，離心收集沉澱和上清(2)上清的純化將上清與Ni-NTA充分混勻裝柱，用含咪唑的緩衝液洗脫目的蛋白(3)包含體的純化將沉澱用含8mol/L脲的緩衝液變性，離心收集上清，將上清與Ni-NTA充分混勻裝柱，用pH梯度洗脫目的蛋白。
權利要求
1.一種幽門螺桿菌vacA-B基因表達工程菌的構建，其特徵在於選取幽門螺桿菌DNA中vacA基因的片段B，其核苷酸序列如下ATGGCCTTTTTCACAACCGTGATCATTCCAGCCATTGTTGGGGGTATCGCTACAGGCACCGCTGTAGGAACGGTCTCAGGGCTTCTTAGCTGGGGGCTCAAACAAGCCGAAGAAGCCAATAAAACCCCAGATAAACCCGATAAAGTTTGGCGCATTCAAGCAGGAAAAGGCTTTAATGAATTCCCTAACAAGGAATACGACTTATACAGATCCCTTTTATCCAGTAAGATTGATGGAGGTTGGGATTGGGGGAATGCCGCTAGGCATTATTGGGTCAAAGGCGGGCAACAGAATAAGCTTGAAGTGGATATGAAAGACGCTGTAGGGACTTATACCTTATCAGGGCTTAGAAACTTTACTGGTGGGGATTTAGATGTCAATATGCAAAAAGCCACTTTACGCTTGGGCCAATTCAATGGCAATTCTTTTACAAGCTATAAGGATAGTGCTGATCGCACCACGAGAGTGGATTTCAACGCTAAAAATATCTCAATTGATAATTTTGTAGAAATCAACAATCGTGTGGGTTCTGGAGCCGGGAGGAAAGCCAGCTCTACGGTTTTGACTTTGCAAGCTTCAGAAGGGATCACTAGCGATAAAAACGCTGAAATTTCTCTTTATGATGGTGCCACGCTCAATTTGGCTTCAAGCAGCGTTAAATTAATGGGTAATGTGTGGATGGGCCGTTTGCAATACGTGGGAGCGTATTTGGCCCCTTCATACAGCACGATAAACACTTCAAAAGTAACAGGGGAAGTGAATTTTAACCACCTCACTGTTGGCGATAAAAACGCCGCTCAAGCGGGCATTATCGCTAATAAAAAGACTAATATTGGCACACTGGATTTGTGGCAAAGCGCCGGGTTAAACATTATCGCTCCTCCAGAAGGTGGCTATAAGGATAAATAA
2.根據權利要求1所述的幽門螺桿菌vacA-B基因表達工程菌的構建，其特徵在於1)從幽門螺桿菌中提取總DNA；2)用PCR方法分別從基因組DNA中獲取vacA基因的片段B；3)將vacA基因的片段B連接在表達載體pRSETA上；4)將重組載體vacA-B-pRSETA轉化到大腸桿菌BL21DE3中得工程菌。
3.根據權利要求1或2所述的幽門螺桿菌vacA-B基因表達工程菌的構建，其特徵於上述用PCR方法從基因組DNA中獲取vacA基因的片段B，其設計PCR引物，序列如下上遊引物5』GC GGA TCC ATG GCC TTT TTC ACA ACC GTG AT 3』下遊引物5』GC CTG CAG TTA TTT ATC CTT ATA GCC ACC TTC 3』
4.根據權利要求3所述的幽門螺桿菌vacA-B基因表達工程菌的構建，其特徵在於上述vacA-B基因與表達載體pRSETA的連接如下1)PCR所採用兩個引物是根據vacA的基因序列設計的；2)vacA基因片段B的5′端連在表達載體pRSETA的BamH I位點上，3′端連在表達載體pRSETA的Pst I位點上，從而構成重組表達載體vacA-B-pRSETA；
5.一種幽門螺桿菌vacA-B基因表達工程菌的表達產物的製備方法1)VacA-B抗原的化學誘導及表達；2)VacA-B的分離及純化；3)VacA-B活性鑑定。
全文摘要
本發明公開一種幽門螺桿菌vacA－B基因表達工程菌的構建及其產物的製備方法。該構建方法包括:從幽門螺桿菌中提取總DNA;用PCR方法從基因組DNA中獲取vacA基因的片段B;將vacA－B連接在載體pRSETA上;將載體pRSETA轉入到大腸桿菌BL21DE3中,經培養獲得工程菌。將工程菌發酵培養,經誘導、表達獲得重組蛋白。該方法獲得的重組蛋白—細胞空泡毒素A的B片段(VacA－B),有高度的抗原性,可為免疫學檢測VacA陽性Hp感染的方法提供抗原,還可製成疫苗用於VacA陽性Hp感染的預防及治療。
文檔編號C12N15/63GK1358862SQ0013546
公開日2002年7月17日 申請日期2000年12月15日 優先權日2000年12月15日
發明者江紅, 韓鋒產, 閻小君 申請人:西安高科實業股份有限公司基因生命科技分公司