具有葡聚糖轉移酶活性的多肽和編碼該多肽的核酸的製作方法

2023-05-19 07:35:46 3

專利名稱：具有葡聚糖轉移酶活性的多肽和編碼該多肽的核酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有葡聚糖轉移酶(glucanotransferase)活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的核酸序列。本發明還涉及含所述核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞以及生產和使用所述多肽的方法。
相關領域描述4-α-葡聚糖轉移酶(EC.2.4.1.25)催化將α葡聚糖鏈從一個α-葡聚糖分子轉移到另一個分子(或葡萄糖)的反應。葡聚糖轉移酶廣泛分布於微生物(例如大腸桿菌)和植物組織例如馬鈴薯塊莖、發芽的大麥種子、甜馬鈴薯和菠菜中。
最近，已發現葡聚糖轉移酶能夠催化α葡聚糖的分子內反應。例如，已報導葡聚糖轉移酶能夠催化直鏈澱粉的分子內轉糖基反應(環化反應)，由此合成具有17或更高聚合度(下文稱為「DP」)的環直鏈澱粉。
葡聚糖轉移酶可用於各種工業目的。例如，可利用葡聚糖轉移酶加工α葡聚糖從而生產環葡聚糖。在將酶用於工業目的的情況下，理想的是在儘可能高的溫度(約60℃或更高)完成反應，因為要防止α葡聚糖，即底物逆行，且同時避免，至少減少微生物對系統的汙染。
已分離得到只在中等溫度區間(通常從約30℃-約45℃)具有高活性的葡聚糖轉移酶(麥芽糖轉葡糖基酶)，參見例如Agric.Biol.Chem.53，2653-2659(1989)和J.Chem.Soc.，44-53(1956)。最近，在EP 0 884 384 A2中已描述了同樣能夠產生環葡聚糖的新型耐熱葡聚糖轉移酶(麥芽糖轉葡糖基酶)。
發明簡述因此，本發明的第一個方面涉及具有葡聚糖轉移酶活性的分離的多肽，所述多肽選自(a)具有與SEQ ID NO2的胺基酸1-501所示胺基酸序列有至少65％同一性之胺基酸序列的多肽；
(b)由在低嚴緊度條件下與下列序列雜交的核酸序列編碼的多肽(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示核酸序列的互補鏈；或(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列；(c)(a)或(b)的等位基因變體；(d)由克隆到大腸桿菌DSM 13049中之質粒的編碼葡聚糖轉移酶的DNA序列編碼的多肽，或與所述多肽有至少65％同一性的其變體；和(e)所述多肽的具有葡聚糖轉移酶活性的片段。
本發明的第二個方面涉及含編碼本發明之多肽的核酸序列的分離的核酸序列。
在第三個方面，本發明涉及編碼具有葡聚糖轉移酶活性之多肽的分離的核酸序列，所述核酸序列選自(a)與SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示之核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)在低嚴緊度條件下與下列序列雜交的核酸序列(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示核酸序列的互補鏈；或(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列；(c)(a)或(b)的等位基因變體；(d)已克隆到大腸桿菌DSM 13049中之質粒內的編碼葡聚糖轉移酶的DNA序列，或與所述DNA序列有至少70％同一性的其變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亞序列，其中所述亞序列編碼具有葡聚糖轉移酶活性的多肽片段；或作為(a)、(b)、(c)、(d)或(e)之互補鏈的分離的核酸序列。
在本發明的第四方面是核酸構建體，其含有本發明的核酸序列且所述序列與能夠指導所述多肽在適宜的表達宿主中表達的一個或多個控制序列可操作相連。
在第五個方面，本發明涉及重組表達載體，其包含本發明的核酸構建體、啟動子、轉錄和翻譯終止信號。
在第六個方面，本發明涉及含本發明核酸構建體的重組宿主細胞。
本發明還涉及生產本發明多肽的方法；生產食物的方法和本發明多肽在生產食物方面的用途以及含本發明多肽的洗滌劑組合物。
附圖簡述


圖1顯示質粒pFUKU-Ruben。
圖2顯示當分別用乙酸緩衝液和磷酸緩衝液檢測時，本發明多肽的pH圖譜。
圖3顯示本發明多肽的溫度圖譜(從30℃-75℃)。
圖4顯示本發明多肽的熱穩定性(從50℃-75℃)。
本發明詳述定義本文所用的術語「α-葡聚糖」指α-1，4-葡聚糖(含麥芽糖作為組成型二糖單位的具有鏈結構的多糖)或具有α-1，6-支鏈結構的α-1，4-葡聚糖。所述α-葡聚糖的實例包括直鏈澱粉、支鏈澱粉、澱粉、糖原、蠟狀澱粉、高直鏈澱粉、可溶性澱粉、糊精、水解的澱粉產物和用磷酸化酶酶促合成的支鏈澱粉。
在本發明上下文中，術語「環狀葡聚糖」指僅具有α-1，4-糖苷鍵的環狀α-1，4-葡聚糖和同時具有α-1，4-糖苷鍵及α-1，6-糖苷鍵的支鏈環狀葡聚糖。術語「支鏈」指有至少一個不同於α-1，4-鍵的糖苷鍵的α-葡聚糖(無論是否環狀)。支鏈環狀葡聚糖的實例包括在環狀結構中含具有α-1，6-鍵之支鏈結構的內支鏈環狀葡聚糖，以及在環狀結構外還含有非環狀結構部分的外支鏈環狀葡聚糖。
本文所用術語「葡聚糖轉移酶活性」或「活性」指通過所述多肽在65℃作用於含0.86％(w/v)麥芽三糖和20mM磷酸鈉(pH7.0)的溶液10分鐘時所產生的葡萄糖量而測定的多肽活性。將1單位酶活性定義為用上述條件每分鐘釋放1μmol葡萄糖所需的多肽量。
如本文所定義的，「分離的多肽」是基本上沒有其它多肽的多肽。因此，「分離的多肽」按SDS-PAGE測定，應至少約20％純，優選至少約40％純，更優選至少約60％純，進一步優選至少約80％純，最優選至少約90％純，特別優選至少約95％純。
本文所用術語「分離的核酸序列」指基本上沒有其它核酸序列的核酸序列。因此，「分離的核酸序列」按瓊脂糖電泳的測定，應至少約20％純，優選至少約40％純，更優選至少約60％純，進一步優選至少約80％純，最佳至少約90％純。
在本發明上下文中，術語「表達」包括與多肽生產有關的任何步驟，包括，但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。
「核酸構建體」在本文定義為單鏈或雙鏈核酸分子，其分離自天然基因或已被修飾從而含有以天然情況下不存在的方式組合和相連的核酸片段。當所述核酸構建體含有表達本發明之編碼序列所需的所有控制序列時，術語「核酸構建體」與「表達盒」是同義詞。
本文將術語「編碼序列」定義為直接說明其蛋白質產物之胺基酸序列的核酸序列。編碼序列的界限通常由mRNA 5』末端緊鄰開放閱讀框上遊的核糖體結合位點(原核細胞)或ATG起始密碼子(真核細胞)和mRNA 3′末端緊鄰開放閱讀框下遊的轉錄終止序列確定。編碼序列可包括，但不限於DNA、cDNA和重組核酸序列。
本文所用的術語「控制序列」包括表達本發明多肽所必需的或有利的所有組分。
本文將術語「有效連接」定義為將控制序列放在相對於DNA序列中編碼序列的適宜位置以便所述控制序列指導多肽表達的一種構型。
本文所用術語「宿主細胞」包括親本細胞的因複製過程發生突變而與該親本細胞不同的任何子代細胞。
具有葡聚糖轉移酶活性之多肽改善食品的用途本發明多肽通過作用於食物中的澱粉而催化澱粉的環化反應。結果，降低了食物中澱粉分子的大小並產生環狀葡聚糖。由該反應產生的環狀葡聚糖有低粘度、高可溶性、抑制澱粉逆行的能力以及包括各種物質的能力。因此通過使用本發明多肽可改善食物。通常可以使本發明的多肽作用於食物中的澱粉以積累環狀葡聚糖，由此，可改善食品的物理特性，例如貯存過程中的穩定性以及口感的改進。在生物體內環狀葡聚糖很容易降解成葡萄糖，因此，環狀葡聚糖具有良好的可降解性以及高能量轉化效率。
將本發明多肽用於改善各種含澱粉食物，包括日本餐後甜點(例如，歐洲蕨大米餅、大米餅、大米果凍和大米豆餅)，點心(例如，日本薄脆餅乾、馬鈴薯薄片和其它點心)，小麥食品(例如，麵包、餡餅、比薩餅、蛋糕、小甜點、餅乾和薄脆)，麵條(例如，小麥麵條、蕎麥麵條、奶酪麵條和義大利麵食例如義大利麵條和通心麵)，gyoza skins，shumai skins，加工的海味(例如魚棒和魚醬蛋糕)，冷凍的或冷藏的加工食品，斷奶食品，嬰兒食品，寵物食品，動物飼料，飲料(例如運動飲料)，運動食品和營養補充食品。
含大量澱粉的大米食品、日本餐後甜點、點心、小麥食品和麵條是可應用本發明的優選食品的實例。其它優選食品的實例是其中在低溫貯存過程中穩定性很重要的冷凍或冷藏的加工食品。
本文所用術語「食物材料」指產生上述食品的任何材料，以及在食品加工過程中提供的任何製品。
通過檢測食品中澱粉的分子大小是否因環狀葡聚糖的產生而降低，可確定應用了本發明多肽的食品是否得到改善。
分別含本發明多肽的食品材料、食品添加劑組合物和食品改善劑也在本發明範圍內。食品添加劑包括調味品(例如醬油、醬油調味液(dip)、辣醬油(Worcester sauces)、肉湯基料(broth bases)、燉煮基料、咖哩基料、湯料基料、蛋黃醬、調味品、蕃茄醬和組合調味品)。食品改善劑的實例包括抗逆行劑(anti-retrogradation agents)和用於蒸過的米的改善劑。
含具有葡聚糖轉移酶活性之多肽的洗滌劑組合物由於現有洗滌劑很難除去澱粉斑，例如直鏈澱粉斑，因此，設想本發明的多肽由於能催化已結晶的澱粉，例如直連澱粉改變為更易溶於水的環狀化合物，而用於所述洗滌劑中。
因此，本發明還涉及含本發明多肽的清潔或洗滌劑組合物；本發明多肽用於除去澱粉斑、特別是用於除去直連澱粉斑的用途；以及用於從硬表面或衣物上除去澱粉斑，特別是除去直連澱粉斑的方法，所述方法包括將含直連澱粉斑的硬表面或含直連澱粉斑的衣物與本發明多肽或本發明的清潔或洗滌劑組合物接觸。
這類清潔和洗滌劑組合物在本領域已有很多描述，對適宜清潔和洗滌劑組合物的進一步描述可參考WO 96/34946；WO 97/07202；WO 95/30011。
洗滌劑組合物可將本發明的酶加入洗滌劑組合物並因此使之成為其中的組分。
本發明的洗滌劑組合物可以例如配成手洗或機洗的洗滌劑組合物，該組合物包括一種適於髒織物預處理的洗衣添加劑組合物和一種增加織物柔軟度的漂洗組合物，或者配成一種用於一般家用堅硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者配成手或機器洗碗操作中使用的洗滌劑。
在一個具體方面，本發明提供一種含有本發明的酶的洗滌劑添加劑。所述洗滌劑添加劑和洗滌劑組合物可以含有一種或多種其它的酶如蛋白酶、脂肪酶、角質酶(cutinase)、澱粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或過氧化物酶。
通常所選酶的特性應當與所選洗滌劑相容，(即，pH最適值，同其它酶組分和非酶組分的相容性等)，並且所述酶應當以有效量存在。蛋白酶合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的蛋白酶。優選微生物來源。化學修飾型或蛋白質工程化的突變體也可包括在內。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優選鹼性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。鹼性蛋白酶的實例是枯草蛋白酶，尤其源自芽孢桿菌屬的枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(WO89/06279所述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是WO89/06270和WO94/25583中所述的胰蛋白酶(例如，來源於豬或牛)和鐮孢屬(Fusarium)蛋白酶。
有效蛋白酶的實例是WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中所述變體，尤其是在一個或多個下列位置具有置換的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
優選市售蛋白酶包括Alcalase、Savinase、Primase、Duralase、Esperase和Kannase(Novo Nordisk A/S)、Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、Purafect OxP、FN2、和FN3(Genencor InternationalInc.)。
脂肪酶合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的脂肪酶。化學修飾的或蛋白質工程化的突變體也包括在內。有效脂肪酶的實例有腐質黴屬(Humicola)(同義詞Thermomyces)的脂肪酶，如來自EP 258068和EP 305216所述H.lanuginosa(T.lanuginosus)或WO96/13580所述H.insolens；假單胞菌脂肪酶，如來自產鹼假單胞菌或P.pseudoalcaligenes(EP 218272)、洋蔥假單胞菌(EP331376)、司徒茨假單胞菌(GB 1372034)、螢光假單胞菌、假單胞菌屬菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)；芽孢桿菌脂肪酶，如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等，(1993)，Biochemica etBiophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短芽孢桿菌(WO 91/16422)。
其它實例是脂肪酶變體，如WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202所述的脂肪酶變體。
優選市售脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo NordiskA/S)。
澱粉酶合適的澱粉酶(α和/或β)包括細菌和真菌來源的澱粉酶。化學修飾的或蛋白質工程化的突變體也包括在內。澱粉酶包括，例如從芽孢桿菌(如GB1296839所述地衣芽孢桿菌菌株)中獲得的α-澱粉酶。有效的α-澱粉酶的實例是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424所述變體，尤其是在一個或多個下列位置上具有置換的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
市售澱粉酶有DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(NovoNordisk A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(Genencor International Inc.)。
纖維素酶合適的纖維素酶包括細菌和真菌來源的纖維素酶。化學修飾的或蛋白質工程化的突變體也包括在內。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質黴屬、鐮孢屬、草根黴屬、支頂孢屬的纖維素酶，例如產自US4435307、US5648263、US5691178、US5776757和WO89/09259中所公開的Humicola isolens、嗜熱毀絲黴和尖孢鐮孢的真菌纖維素酶。
特別合適的纖維素酶是具有顏色保護優點的鹼性或中性纖維素酶。這種纖維素酶的實例是EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中所述的纖維素酶。其它實例是纖維素酶變體如WO94/07998、EP0531315、US5457046、US5686593、US5763254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中所述的那些變體。
市售纖維素酶包括Celluzyme和Carezym(Novo Nordisk A/S)，Clazinase和Puradax HA(Genencor International Inc.)，及KAC-500(B)(KaoCorporation)。
過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶。化學修飾的或蛋白質工程化的突變體也包括在內。有效的過氧化物酶實例包括來自Coprinus，例如來自C.cinereus的過氧化物酶及其在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所述的變體。
市售過氧化物酶包括Guardzme(Novo Nordisk A/S)。
洗滌劑組合物中可包含去汙酶，方式是加入分別含一或多種酶的不同添加劑，或加入含所有這些酶的組合添加劑。本發明的洗滌添加劑，即獨立添加劑或組合添加劑可配製成顆粒、液體、漿等。優選的洗滌添加劑形式是顆粒(特別是不起塵的顆粒)，液體(特別是穩定的液體)，或漿。
不起塵的顆粒可以如US4106991和4661452中所公開的來生產，並可以任選通過本領域已知方法加塗層。蠟塗材料的實例是平均摩爾量為1000至20000的聚(環氧乙烷)產物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個環氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；其中醇含有12至20個碳原子並且其中存在15至80個環氧乙烷單位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；及脂肪酸的單-和雙-和甘油三酯。適於通過流體床技術來應用的成膜塗層材料的實例在GB1483591中給出。液體酶預製劑可以按已有方法通過加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸而穩定。被保護的酶可以按照EP238216中的方法來生產。
本發明的洗滌劑組合物可以是任何適當的形狀，例如條狀、片狀、粉狀、顆粒狀、糊狀或液體。液體洗滌劑可以是含水型(通常含有高達70％的水和0-30％的有機溶劑)，或不含水型。
洗滌劑組合物含有一種或多種表面活性劑，其可以是非離子型(包括半極性形式)和/或陰離子型和/或陽離子型和/或兩性離子型。表面活性劑通常佔總重量的0.1％至60％。
當包含在其中時，所述洗滌劑通常含有約1％至約40％的陰離子表面活性劑如線性烷基苯磺酸鹽、α-烯屬磺酸酯、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽、仲鏈烷磺酸鹽(alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或鏈烯基琥珀酸或(肥)皂。
當包括其中時洗滌劑通常含有約0.2％至40％的非離子表面活性劑如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷(polyglycoside)、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸單乙醇胺、脂肪酸單乙醇胺、多羥基烷基脂肪酸胺或葡糖胺的N-醯基N-烷基衍生物(「glucamide」)。
洗滌劑可含有0-65％的洗滌助洗劑或絡合劑如沸石、二磷酸、三磷酸鹽、膦酸酯、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基琥珀酸、可溶性矽酸鹽或分層矽酸鹽(例如來源於Hoechst的SKS-6)。
洗滌劑可含有一種或多種聚合物。實例是羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯基醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧化物如聚丙烯酸類、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
所述洗滌劑可含有漂白系統，其可含有H2O2源如過硼酸鹽或過碳酸鹽，所述H2O2源可以同過酸-形成漂白激活劑如四乙醯基乙二胺或壬醯氧苯磺酸類進行混合。或者，漂白系統可以含有過氧酸的例如醯胺、亞胺或碸形式。
本發明的洗滌劑組合物中的酶可以採用傳統的穩定劑來進行穩定，所述穩定劑是，例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲醯苯基硼酸，並且所述組合物可以按照WO92/19709和WO92/19708中所述進行配製。
洗滌劑也可含有其它傳統的洗滌劑成分如織物調節劑，這些有粘土、增泡劑、抑泡劑、抗腐蝕劑、汙垢懸浮劑、抗汙垢再沉積劑、染料、殺菌劑、增白劑、水助溶劑、抑鏽劑或香料。
根據本發明的設計，任何酶，特別是本發明的酶可以以相當於每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白，優選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別優選每升洗滌液0.1-1mg酶蛋白的量加到所述洗滌劑組合物中。
還可將本發明的酶加至WO97/07202(引入作為參考)中公開的洗滌劑配方中。
具有葡聚糖轉移酶活性的多肽在本發明的第一個實施方案中，分離的多肽具有與SEQ ID NO2的胺基酸1-501(即成熟多肽)至少65％同一性的胺基酸序列。在本發明的一個令人感興趣的實施方案中，所述多肽與SEQ ID NO2的胺基酸1-501有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性(下文稱為「同源多肽」)。
在一優選的實施方案中，同源多肽具有與SEQ ID NO2的胺基酸1-501有5個胺基酸不同，例如4個胺基酸不同，例如3個胺基酸不同，如2個胺基酸不同或1個胺基酸不同的胺基酸序列。
用可有效進行蛋白質和DNA的對比排列的完整Smith-Waterman對比排列法完成序列排列和同一性分值的計算。分別將默認評分矩陣BLOSUM50和同一性矩陣用於蛋白質和DNA的對比排列。對於蛋白質來說，缺口中第一個殘基的罰分為-12，對於DNA來說，則為-16。而對於蛋白質來說，缺口中其它殘基的罰分為-2，而對於DNA來說，則為-4。對比排列使用fasta軟體包v20u6版本(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools forBiological Sequence Analysis″，PNAS 852444-2448，and W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA″Methods inEnzymology 18363-98)。
將具有SEQ ID NO2的胺基酸1-501之胺基酸序列的葡聚糖轉移酶與最接近的現有技術進行對比排列，即與具有EP 0 884 384中公開之序列的葡聚糖轉移酶使用上述方法進行排列，得到下列同一性百分比胺基酸序列間的同一性％為62.5％，核酸序列間的同一性％為65.5％。
優選，本發明多肽含有SEQ ID NO2的胺基酸1-501，其等位基因變體或其具有葡聚糖轉移酶活性的片段。顯然，本發明多肽還可由SEQ ID NO2的胺基酸1-501所示胺基酸序列組成。
等位基因變體指佔據相同染色體座位之基因的任何兩種或多種不同形式。等位基因變體通常通過突變產生，導致種群內產生多樣性。基因突變可以是沉默的(所編碼的多肽沒有改變)或可編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
在本發明的第二個實施方案中，分離的多肽是由在低嚴緊度條件下，優選，在中等嚴緊度條件下，更優選在高嚴緊度條件下與下列序列雜交之核酸編碼的分離的多肽(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503，或(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，NewYork)。
SEQ ID NO1中核苷酸1-1503所示核酸序列的互補鏈的亞序列可以至少是100個核苷酸或優選至少200個核苷酸。此外，所述亞序列應編碼具有葡聚糖轉移酶活性的多肽片段。所述多肽還可以是具有葡聚糖轉移酶活性之多肽的等位基因變體或片段。
按照本領域熟知的方法，可以用SEQ ID NO1或其亞序列的核酸序列以及SEQ ID NO2或其片段的胺基酸序列設計核酸探針以鑑定和克隆編碼來自不同屬或種之菌株的具有葡聚糖轉移酶活性之多肽的DNA。具體地說，可以用所述探針與所研究屬或種的基因組或cDNA雜交，然後進行標準Southern印跡法，以便鑑定和分離其中相應的基因。所述探針可明顯短於完整序列，但應為至少15個，優選至少25個，更優選至少35個核苷酸長。也可以施用較長的探針。DNA和RNA探針均可使用。通常將所述探針標記以檢測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。所述探針包括在本發明範圍內。
因此，可以在從所述其它生物體製備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交並編碼具有葡聚糖轉移酶活性之多肽的DNA。通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，或本領域技術人員已知的其它分離技術可以從所述生物體中分離基因組DNA或其它DNA。將來自所述文庫的DNA或分離的DNA轉移並固定在硝酸纖維素或其它適宜的載體材料上。為了鑑定與SEQ ID NO1或其亞序列同源的克隆或DNA，在Southern印跡中使用所述載體材料。就本發明目的而言，雜交指在低至高嚴緊度條件下，與對應於SEQ ID NO1所示核酸序列、其互補鏈、或其亞序列的標記型核酸探針雜交的核酸序列。用X-射線膠片檢測在這些條件下與所述核酸探針雜交的分子。
在第二個令人感興趣的實施方案中，所述核酸探針是編碼SEQ ID NO2的(成熟)多肽或其亞序列的核酸序列。在第三個令人感興趣的實施方案中，所述核酸探針是SEQ ID NO1。在第四個令人感興趣的實施方案中，所述核酸探針是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區。在第五個令人感興趣的實施方案中，所述核酸探針是包含在質粒pFuKu-Ruben中的核酸序列，該質粒包含在大腸桿菌DSM 13049中，其中所述核酸序列編碼具有葡聚糖轉移酶活性的多肽。在第六個令人感興趣的實施方案中，所述核酸探針是包含在質粒pFuku-Ruben中的成熟多肽的編碼區，所述質粒包含在大腸桿菌DSM13049中。
對於至少100個核苷酸長的探針來說，將低至高嚴緊度條件定義為在42℃ 5×SSPE、0.3％ SDS，200μg/ml剪切並變性的鮭精DNA，以及對於低嚴緊度來說25％甲醯胺、對於中嚴緊度來說35％甲醯胺或對於高嚴緊度來說50％甲醯胺中，根據標準Southern印跡分析進行預雜交和雜交。
對於至少100個核苷酸長的探針來說，最終用2×SSC、0.2％ SDS，優選在至少50℃(低嚴緊度)，更優選在至少55℃(中嚴緊度)，最佳在至少65℃(高嚴緊度)下將載體材料洗滌3次，每次15分鐘。
對於約15至約70個核苷酸長的短探針來說，將嚴緊度條件定義為在相對於按照Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 481390)計算的理論Tm低5℃-10℃的溫度下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％ NP-40、1×Denhardt′s溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸氫二鈉、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA/ml中，根據標準Southern印跡分析進行預雜交，雜交，和雜交後洗滌。
對於約15至約70個核苷酸長的短探針來說，將載體材料在低於理論Tm5℃-10℃的溫度下，在6×SCC+0.1％ SDS中洗滌1次，15分鐘，然後用6×SSC洗滌2次，每次15分鐘。
如上文所說明的，本發明的多肽可以是具有SEQ ID NO2之胺基酸序列的多肽或其成熟多肽，其中一個或多個胺基酸已由另一(或多個)胺基酸取代，其中已缺失和/或插入一個或多個胺基酸。
優選，胺基酸改變是微小性質的改變，即不會顯著影響所述蛋白質摺疊和/或活性的保守胺基酸取代；小缺失，通常缺失1-約30個胺基酸；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端甲硫氨酸殘基；最多約20-25個殘基的小接頭肽；有利於通過改變淨電荷或另一功能，例如聚-組氨酸序列、抗原表位或結合結構域而純化的小的延伸。
保守取代的實例是下組內的取代鹼性胺基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水胺基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族胺基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小分子胺基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性的胺基酸取代是本領域已知的，如H.Neurath and R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York所述。最常發生的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly以及其相反的取代。
在本發明非常令人感興趣的實施方案中，所述多肽是熱穩定性的，即本發明多肽在升高的溫度下仍保持了其酶活性。
因此，本發明人已開發了一種本領域技術人員很容易使用的適宜的初步檢測以評估一種分離的多肽是否可以被認為是熱穩定的。因此，當按本文所述檢測時，特別優選的多肽是在67℃，優選在70℃，在20mM磷酸鹽緩衝液，pH7.0中保溫10分鐘後仍保持了至少75％活性，例如至少80％活性，例如至少85％，優選至少90％，例如至少95％，特別是基本上全部活性的多肽。在這種意義上，應理解100％活性指前述的葡聚糖轉移酶活性，即上述百分比值是在65℃，20mM磷酸鹽緩衝液，pH7.0中保溫10分鐘後相對於所述多肽活性而測定的。
所述酶優選應有6-8的最佳pH，特別優選約6.5-約7.5，例如約6.75-約7.25，例如約7。
此外，本發明多肽優選通過作用於α葡聚糖，例如直鏈澱粉，而能通過分子內的轉糖基反應產生環狀葡聚糖。另外，本發明多肽優選應通過作用於包含支鏈結構，即具有α-1，6-鍵的α-葡聚糖，例如支鏈澱粉，而能夠產生支鏈環狀葡聚糖。
此外，同樣被認為在本發明範圍內的多肽是優選純化形式的分離的多肽，其與具有SEQ ID NO2之胺基酸序列的多肽或其成熟多肽具有免疫化學同一性或部分免疫化學同一性。免疫化學特性通過熟知的Ouchterlony雙向免疫擴散方法經免疫學交叉反應同一性試驗確定。具體地說，按照Harboe和Ingild在In N.H.Axelsen，J.Krll，and B.Weeks，editors，A Manual ofQuantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，Chapter 23，or Johnstone and Thorpe，Immunochemistry in Practice，BlackwellScientific Publications，1982(更具體的頁數為27-31)所述的方法免疫接種兔(或其它齧齒動物)製備含多克隆抗體的抗血清，所述多克隆抗體可與具有SEQ ID NO2之胺基酸序列的多肽或其成熟多肽的表位發生免疫反應性或與所述表位結合。具有免疫化學同一性的多肽是以相同的方式與所述抗血清反應的多肽，所述方式如沉澱物的完全融合、相同的沉澱物形態學和/或利用特定免疫化學技術的相同的電泳遷移率。免疫化學同一性的進一步解釋見Axelsen，Bock和Kroll在In N.H.Axelsen，J.Krll，and B.Weeks，editors，A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell ScientificPublications，1973，Chapter 10。具有部分免疫化學同一性的多肽是以部分相同的方式與所述抗血清反應的多肽，如沉澱物的部分融合、部分相同的沉澱物形態學和/或利用特定免疫化學技術的部分相同的電泳遷移率。有關部分免疫化學同一性的解釋見Bock和Axelsen在In N.H.Axelsen，J.Krll，and B.Weeks，editors，A Manual ofQuantitative Immunoelectrophoresis，BlackwellScientific Publications，1973，Chapter 11。
所述抗體還可以是單克隆抗體。可按照E.Harlow和D.Lane，editors，1988，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York所述的方法製備和使用單克隆抗體。
總之，本發明的多肽優選具有下述多肽的葡聚糖轉移酶活性的至少20％，所述多肽具有SEQ ID NO2的胺基酸1-501所示胺基酸序列。
特別優選的是具有下述多肽的葡聚糖轉移酶活性的至少30％，例如至少40％，例如至少50％，優選至少60％，例如至少70％，例如至少80％，更優選至少90％或至少95％的多肽，其中所述多肽含有SEQ ID NO2的胺基酸1-501所示胺基酸序列。
本發明多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發明目的而言，本文所用術語「獲得自」與給定來源聯用時應指，由核酸序列編碼的多肽是由已插入了來自所述來源的核酸序列的一種來源或細胞產生。在優選的實施方案中，所述多肽被分泌到細胞外。
在一本發明令人感興趣的實施方案中，本發明多肽可衍生自棲熱菌屬(Thermus)，特別是衍生自紅色棲熱菌(Thermus rubens)，例如紅色棲熱菌ATCC 31556。
本發明人已從紅色棲熱菌ATCC 31556中分離出編碼具有葡聚糖轉移酶活性之多肽的基因並將其插入大腸桿菌DH12S中。按照用於專利程序目的的國際認可的微生物保藏的布達佩斯條約，在1999年9月20日將含所述基因的大腸桿菌菌株保藏在德國微生物和細胞培養物保藏中心，Mascheroder Weg 1 B，D-38124 Braunschweig，保藏號為DSM 13049。
因此，在本發明進一步的實施方案中，本發明的多肽是由克隆到大腸桿菌DSM 13049的質粒中的葡聚糖轉移酶編碼部分的DNA編碼的多肽，或與所述多肽具有至少65％同一性的變體。就所述變體而言，優選所述變體多肽與由克隆到大腸桿菌DSM 13049中的質粒中的葡聚糖轉移酶編碼部分的DNA編碼的多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。
本發明多肽可以是細菌多肽。例如所述多肽可以是革蘭氏陽性菌的多肽，例如芽孢桿菌屬(Bacillus)的多肽，如嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalkalophisus)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、或蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的多肽；或鏈黴菌屬(Streptomyces)的多肽，如淺青紫鏈黴菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)的多肽；或革蘭陰性細菌例如大腸桿菌(E.coli)或假單胞菌屬細菌(Pseudomonas sp)的多肽。
本發明多肽可以是真菌多肽，更優選酵母多肽，如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia的多肽；或更優選絲狀真菌多肽，如支頂孢屬(Acremonium)、麴黴屬(Aspergillus)、短柄黴屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、腐質黴屬(Humicola)、Magnaporthe、毛黴屬(Mucor)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、鏈孢黴屬(Neurospora)、擬青黴屬(Paecilomyces)、青黴屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、草根黴屬(Thielavia)、Tolypocladium、或木黴屬(Trichoderma)多肽。
在優選的實施方案中，所述多肽是卡爾斯伯糖酵母(Sccharomycescarlsbergensis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯維糖酵母(Saccharomyces Kluyveri)、Saccharomyces norbensis、或卵型糖酵母(Saccharomyces oviformis)的多肽。
在另一優選的實施方案中，所述多肽是棘孢麴黴(Aspergillusaculeatus)、泡盛麴黴(Aspergillus awamori)、臭麴黴(Aspergillus foetidus)、日本麴黴(Aspergillus japonicus)、構巢麴黴(Aspergillus nidulans)、黑麴黴(Aspergillus niger)、米麴黴(Aspergillus oryzae)、杆孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢(Fusariumculmorum)、禾穀鐮孢(Fusarium graminearum)、禾赤鐮孢(Fusariumgraminum)、異孢鐮孢(Fusarium heterosporum)、合歡木鐮孢(Fusariumnegundi)、尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛黴(Mucor miehei)、嗜熱毀絲黴(Myceliophthora thermophila)、粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa)、產紫青黴(Penicillium purpurogenum)、Trichodermaharzianum、康寧氏木黴(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或綠色木黴(Trichoderma viride)的多肽。
應理解對於前述物種，本發明包括完美和不完美的狀態以及其他分類學等同物，例如無性型，而不論它們是以何種種名已知。本領域技術人員很容易確定相應等同物的同一性。
這些種的菌株很容易從各種收集中心，例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和農業研究服務專利培養物保藏中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection)、北方地區研究中心(NRRL)獲得。
此外，用上述探針可以從其他來源，包括分離自自然界(例如，土壤、堆肥、水等)的微生物中鑑定和獲得所述多肽。從自然界分離微生物的技術是本領域熟知的。通過類似地篩選另一微生物的基因組或cDNA文庫可一得到所述核酸序列。一旦用所述探針檢測到了編碼多肽的核酸序列後，用本領域技術人員熟知的技術(參見例如Sambrook等，1989，同上文)可以分離或克隆所述序列。
由本發明核酸序列編碼的多肽還包括融合的多肽或可裂解的融合多肽，其中在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端融合另一多肽。通過將編碼另一多肽的核酸序列(或其部分)與本發明核酸序列(或其部分)融合生產融合的多肽。生產融合多肽的技術是本領域已知的，包括連接所述多肽的編碼序列以便它們位於同一讀碼框中，然後在相同啟動子和終止子控制下表達融合多肽。
核酸序列本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的核酸序列。
在一令人感興趣的實施方案中，所述核酸序列與SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示的核酸序列有至少70％同一性。優選所述核酸序列與SEQ IDNO1的核苷酸1-1503所示的核酸序列有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在本發明另一令人感興趣的實施方案中，所述核酸序列含有SEQ IDNO1的核苷酸1-1503所示的核酸序列或其等位基因變體，或其能夠編碼本發明多肽的片段。顯然，所述核酸序列可由SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示的核酸序列組成。
在另一優選的實施方案中，所述核酸序列是已克隆到大腸桿菌DSM13049內質粒中之DNA序列的葡聚糖轉移酶編碼部分，或其與所述DNA序列有至少70％同一性的變體。就所述變體而言，優選所述變體DNA序列與已克隆到大腸桿菌DSM 13049內質粒中之DNA序列的葡聚糖轉移酶編碼部分有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性。
本發明還包括編碼具有SEQ ID NO2之胺基酸序列的多肽或其成熟多肽的核酸序列，所述核酸序列因遺傳密碼簡併性而與SEQ ID NO1有所不同。本發明還涉及SEQ ID NO1的編碼具有葡聚糖轉移酶活性之SEQ IDNO2片段的亞序列。
SEQ ID NO1的一個亞序列是包含在SEQ ID NO1的核苷酸1-1503中，但已從5′和/或3′末端缺失了一個或多個核苷酸的核酸序列。
本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的核酸序列，所述核酸序列在低嚴緊度條件下，優選在中等嚴緊度條件下，更優選在高嚴緊度條件下與下列序列雜交(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示核酸序列的互補鏈，或(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列。本發明還涉及(i)、(ii)和(iii)的互補鏈。
用於分離或克隆編碼多肽之核酸序列的技術是本領域已知的，包括從基因組DNA分離、從cDNA製備或其組合。例如通過熟知的聚合酶鏈反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選以檢測具有共同結構特徵的克隆化DNA片段，可從所述基因組DNA克隆本發明的核酸序列。參見，例如Innis等，1990，PCRA Guide to Methods and Application，Academic Press，New York.。可以使用其它核酸擴增方法例如連接酶鏈反應(LCR)，連接激活轉錄(LAT)以及以核酸序列為基礎的擴增(NASBA)。可從紅色棲熱菌ATCC 31556或另一或相關生物體中克隆所述核酸序列，所述核酸序列還可例如是所述核酸的多肽編碼區的等位基因變體或種變體。
例如通過遺傳工程中所用的標準克隆方法可獲得分離的核酸序列，使其從其天然位置再定位到可被複製的不同位置。所述克隆方法涉及切割並分離含編碼所述多肽之核酸序列所需的核酸片段，將所述片段插入載體分子中，然後將該重組載體插入到能複製多拷貝核酸序列或核酸序列克隆的宿主細胞中。所述核酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成的或其任何組合。
為了達到本發明的目的，按上述方法確定兩個核酸序列間的同一性程度。
修飾編碼本發明多肽的核酸序列對於合成與所述多肽基本相似的多肽是必需的。「基本相似」於所述多肽指所述多肽的非天然形式。這些多肽經基因工程改造而在一定程度上不同於從其天然來源分離的多肽，例如在比活性、熱穩定性、最佳pH等方面有所不同的變體。可根據SEQ ID NO1的多肽編碼部分指示的核酸序列構建變體序列，如其亞序列，和/或通過導入核苷酸取代來構建所述變體序列，所述核苷酸取代不產生由所述核酸序列編碼的另一多肽的胺基酸序列，但對應於用於生產所述酶的宿主生物所偏好的密碼子使用特點，或通過導入可產不同胺基酸序列的核苷酸取代來構建所述變體序列。有關核苷酸取代的一般描述參見例如Ford等1991，Protein Expression and Purification 295-107。
對於本領域技術人員顯而易見的是，可以在對於所述分子的功能非常重要的區域外進行所述取代，這樣仍得到活性多肽。按照本領域已知的方法，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(參見例如Cunningham and Wells，1989，Science 24410811085)可鑑定對於本發明分離的核酸序列所編碼之多肽的活性至關重要的胺基酸殘基，因此優選不經過取代即可完成所述鑑定。在後一種技術中，在分子的每個正電荷殘基處誘導突變，然後檢測所得突變分子的葡聚糖轉移酶活性以鑑定對於分子活性至關重要的胺基酸殘基。底物-酶作用位點可通過對核磁共振分析、晶體照相術或光親和標記等技術所測定的三維結構的分析來確定(參見例如de Vos等1992，Science 255306-312；Smith et al.，1992，Journal of Molecular Biology 224899-904；Wlodaver et al.，1992，FEBS Letters 30959-64)。
核酸構建體本發明還涉及含有與能夠在適宜宿主細胞中指導所述多肽表達的一種或多種控制序列可操作相連的本發明核酸序列的核酸構建體。
可以以多種方式操作編碼本發明多肽的分離的核酸序列以提供所述多肽的表達。在將核酸序列插入到載體中之前對其操作是優選或必需的，這取決於表達載體。用重組DNA方法修飾核酸序列的技術是本領域熟知的。
控制序列包括表達本發明多肽所必需或有利於其表達的所有組分。每個控制序列可以是編碼所述多肽之核酸序列的天然的或外源的。所述控制序列包括，但不限於前導序列、聚腺苷酸序列、原肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。至少，控制序列包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。所述控制序列可帶有用於導入特異性限制位點的接頭，以便於將控制序列與編碼多肽之核酸序列的編碼區相連。
控制序列可以是適宜的啟動子序列，一種由宿主細胞識別的用於表達所述核酸序列的核酸序列。啟動子含有介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中有轉錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，並且所述啟動子可得自編碼與所述宿主細胞同源或異源之細胞外或細胞內多肽的基因。
用於指導本發明核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的適宜啟動子的實例得自大腸桿菌lac操縱子，天藍色鏈黴菌瓊脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(penp)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，和原核生物β-內醯胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 753727-3731)以及tac啟動子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 8021-25)的啟動子。其它啟動子描述於「Useful Proteins fromrecombinant bacteria」in Scientific American，1980，24274-94；和in Sambrook等，1989，同上文。
用於指導本發明核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的適宜啟動子的實例是得自米麴黴TAKA澱粉酶、米赫根毛黴(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定的α-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴(Aspergillus awamori)葡糖澱粉酶(glaA)、米赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴磷酸丙糖異構酶、構巢麴黴乙醯胺酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)基因的啟動子，以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性α-澱粉酶和米麴黴磷酸丙糖異構酶基因的一種雜合啟動子)，及其突變、截短的和雜合啟動子。
在酵母宿主中，有用的啟動子得自啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母半乳糖激酶(GAL1)、啤酒糖酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)和啤酒糖酵母3-磷酸甘油激酶基因。Romanos等1992，Yeast 8423-488描述了用於酵母宿主細胞的其它有用的啟動子。
所述控制序列還可以是適宜的轉錄終止序列，即可被宿主細胞識別以終止轉錄的序列。將終止子序列與編碼所述多肽之核酸序列的3』末端可操作相連。在宿主細胞中有功能的任何終止子均可用於本發明。
用於絲狀真菌宿主細胞的優選終止子得自米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、黑麴黴α糖苷酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。
用於酵母宿主細胞的優選終止子得自啤酒糖酵母烯醇化酶、啤酒糖酵母細胞色素C(CYC1)和啤酒糖酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。Romanos等1992(同上文)描述了用於酵母宿主細胞的其它有用的終止子。
控制序列還可以是適宜的前導序列，即mRNA上對細胞的翻譯很重要的非翻譯區。前導序列被可操作的連接到編碼異源多肽的核酸序列的5』端。任何在該細胞中有功能的前導序列都可以在本發明中使用。。
用於絲狀真菌宿主細胞的優選前導序列得自米麴黴TAKA澱粉酶和構巢麴黴磷酸丙糖異構酶。
用於酵母宿主細胞的適宜前導序列得自啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母3-磷酸甘油酸激酶、啤酒糖酵母α因子和啤酒糖酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因。
控制序列還可以是聚腺苷酸序列，即與所述核酸序列3』末端可操作相連，且轉錄後可被宿主細胞作為向已轉錄的mRNA上添加聚腺苷酸殘基的信號而識別的序列。在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸序列均可用於本發明。
用於絲狀真菌宿主細胞的優選聚腺苷酸序列得自米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴α葡萄糖苷酶的基因。
Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990描述了用於酵母宿主細胞的有用的聚腺苷酸序列。
控制序列還可以是信號肽編碼區，其編碼與異源多肽的氨基端相連的胺基酸序列，並且指導該編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核酸序列的編碼序列的5』端可以天然包含信號肽編碼區，該區天然地和編碼分泌性多肽的編碼區的片段在翻譯閱讀框架內連接在一起。或者，編碼序列的5』端可以包含相對於該編碼序列外來的信號肽編碼區。在編碼序列沒有天然包含信號肽編碼區的序列中，需要外來信號肽編碼區。或者，可以簡單地用外來信號肽編碼區替代天然信號肽編碼區以提高多肽的分泌。信號肽編碼區可以從麴黴屬的葡糖澱粉酶或澱粉酶基因、或從根毛黴(Rhizomucor)屬的脂肪酶或蛋白酶基因中得到。然而，指導表達的異源多肽進入細胞分泌途徑的任何信號肽編碼區，都可以在本發明中使用。
用於細菌宿主細胞的有效信號肽編碼區是得自芽孢桿菌NCIB 11837產麥芽糖澱粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α澱粉酶、地衣形芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣形芽孢桿菌β-內醯胺酶、嗜熱脂肪中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢桿菌prsA的基因。Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews 57109-137描述了其它信號肽。
用於絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼區是得自米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、米赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶和Humicola lanuginosa脂酶的基因。
用於酵母宿主細胞的有用信號肽得自啤酒糖酵母α因子和啤酒糖酵母轉化酶的基因。Romanos等1992(同上文)描述了其它有用的信號肽編碼區。
控制序列還可以是編碼位於多肽氨基末端之胺基酸序列的多肽編碼區。所得的多肽已知為酶原或多肽原(在某些情況下為酶原)。多肽原通常是無活性的並可從所述多肽原通過催化或自我催化裂解而轉變為成熟有活性的多肽。所述多肽編碼區可得自枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、啤酒糖酵母α因子、米赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)的基因。
當信號肽和前肽區都存在於多肽的氨基端時，前肽區與多肽的氨基端緊鄰，而信號肽區和前肽區的氨基端緊鄰。
還優選加入能調節與細胞生長相關的異源多肽表達的調控序列。調控系統的實例包括應答化學或物理刺激(包括在有調控化合物存在的情況下)而導致基因表達的開啟或關閉的那些。原核生物系統中的調節序列包括lac、tac和trp操縱子系統。在酵母中，可使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可用TAKAα-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是可以是基因擴增的序列。在真核生物系統中，這些包括存在氨甲蝶呤時擴增的二氫葉酸還原酶基因，以及有重金屬時可擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼所述多肽的核酸序列應與所述調節序列可操作相連。
表達載體本發明還涉及含有本發明的核酸序列、啟動子和轉錄及翻譯終止信號的重組表達載體。可將上述各種核酸和調控序列連接在一起以生產一種重組表達載體，使其包含一個或多個方便的限制位點，所述位點能允許編碼多肽的核酸序列在這類位點插入或置換。或者，本發明的核酸序列可以通過將該核酸序列或含有該核酸序列的核酸構建體插入適當表達載體來表達。在創建表達載體的過程中，可使編碼序列在表達載體中與適當調控序列可操作性地連接以便表達。
重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其可方便地進行重組DNA操作並且能使核酸序列表達。載體的選擇將主要決定於載體與引入了該載體的宿主細胞之間的相容性。載體可以是線性或閉合環狀質粒。
載體可以是自主複製載體，即以染色體外實體形式存在的載體，其複製獨立於染色體的複製，例如質粒，染色體外元件，小染色體(minichrmosome)或人工染色體。載體可含有任何確保自我複製的手段。或者，載體可以是引入宿主細胞後整合到基因組中並與其整合的染色體一起複製的那種。此外，可使用單個載體或質粒，或一起含有待引入宿主細胞基因組中的全長DNA的兩個或更多個載體或質粒，或轉座子。
本發明的載體優選含有一個或多個選擇性標記，其能容易地選擇出轉化細胞。一個選擇性標記是一種基因，其產物能提供對殺生物劑或病毒的抗性、對重金屬的抗性、原養型至營養缺陷型的轉變等。細菌選擇性標記的實例是來源於枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予了抗生素抗性如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性的標記。適合於酵母宿主細胞的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用於在絲狀真菌細胞中使用的可篩選標誌可以選自，但不限於，amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲醯轉移酶)、bar(膦絲菌素乙醯轉移酶)、hygB(潮黴素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷醯轉移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)，及它們的等同物。優選用於麴黴細胞中的為構巢麴黴或米麴黴的amdS和pyrG基因以及吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發明的載體優選含有使所述載體可以穩定整合到宿主細胞基因組中或者可以在細胞中不依賴於細胞的基因組而自我複製的元件。
為了整合到宿主細胞基因組中，所述載體可依賴於編碼多肽的核酸序列或載體上任何其它元件來通過同源或非同源重組而穩定整合到基因組中。或者，載體可能含有其它核酸序列，這些序列可指導通過同源重組整合進入宿主細胞基因組。其它核酸序列能夠在染色體的精確位置使載體整合到宿主細胞基因組中。為了提高在精確位置整合的可能性，整合元件應優選含有足夠量的與相應靶序列高度同源的核酸，例如100-1500個鹼基對，優選400-1500個鹼基對，最佳800-1500個鹼基對，以便提高同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。
此外，整合元件還可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，通過非同源重組可將載體整合到宿主細胞的基因組中。
為了進行自主複製，所述載體還可含有能夠使載體在所研究的宿主細胞中自主複製的複製起始點。細菌複製起始點是實例是使載體可以在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的複製起始點，使載體可以在芽孢桿菌中複製的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的複製起始點。用於酵母細胞的複製起始點的實例是2μ複製起始點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合，ARS4和CEN6的組合。複製起始點可以是帶有突變的複製起始點，所述突變可以使其在宿主細胞中發揮溫度敏感性的作用(參見例如Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 751433)。
可將一個以上拷貝的本發明核酸序列插入到宿主細胞中以提高基因產物的產率。通過將至少一個以上其它拷貝的序列整合到宿主細胞基因組中或者通過包括可擴增選擇性標記基因與所述核酸序列，其中通過在存在適宜選擇性標記的條件下列培養含擴增拷貝的選擇性標記基因，由此增加了核酸序列的拷貝數的細胞可篩選所述細胞，這樣可以使核酸序列拷貝數增加。
用於連接上述元件以構建本發明重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見例如Sambrook等，1989，同上文)。
宿主細胞本發明還涉及含有本發明核酸序列的重組宿主細胞，其優選在多肽的重組生產中使用。
將含有本發明核酸序列的載體引入宿主細胞中，使載體以上述染色體整合體的形式或自主複製的染色體外載體的形式維持。對宿主細胞的選擇很大程度上決定於編碼所述多肽的基因和它的來源。
宿主細胞可以是單細胞微生物，例如原核生物，或非單細胞微生物，例如真核生物。
有用的單細胞是細菌細胞如革蘭氏陽性細菌包括，但不限於，芽孢桿菌，例如嗜鹼性芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌；或鏈黴菌細胞，例如，淺青紫鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌，或革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌和假單胞菌。在一個優選的實施方案中，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另一個優選的實施方案中，芽孢桿菌細胞是嗜鹼性芽孢桿菌。
將表達載體引入細菌宿主細胞可通過原生質體轉化(例見，Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學168111-115)，通過利用感受態細胞(例見，Young和Spizizin，1961，細菌學雜誌81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學雜誌56209-221)，通過電穿孔(例見，Shigekawa和Dower，1988，生物技術6742-751)，或通過接合作用(例見，Koehler和Thorne，1987，細菌學雜誌1695771-5278)而實現。
宿主細胞可以是真核細胞例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在優選的實施方案中，所述宿主細胞是真菌細胞。此處所用的「真菌」包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、接合菌門(Zygomycota)(Hawksworth等在Ainsworth和Bisby真菌詞典，第8版，1995，CAB國際，大學出版社，Cambridge，UK中進行了定義)、以及卵菌門(Oomycota)(被Hawksworth等引用，1995，出處同上，171頁)和全部的產有絲分裂孢子的真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，出處同上)。
在更優選的實施方案中，真菌細胞是酵母細胞。此處所用的「酵母」包括產囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(Endomycetales)、產擔子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)、以及屬於半知菌(Fungi Imperfecti)的酵母(Blastomycetes)。因為將來酵母的分類可能會有變化，就本發明而言，酵母應該按照酵母的生物學和活性(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.編，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中描述的那樣定義。
在更優選的實施方案中，所述酵母宿主細胞是假絲酵母屬、漢森酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、糖酵母屬、裂殖酵母屬、或Yarrowia的細胞。
在最優選的實施方案中，所述酵母宿主細胞是卡爾斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、Saccharomyces douglasii、克魯維糖酵母、Saccharomycesnorbensis、或卵型糖酵母的細胞。在另一最優選的實施方案中，所述酵母宿主細胞是乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)的細胞。在另一最優選的實施方案中，所述酵母宿主細胞是Yarrowia lipolytica的細胞。
在另一最優選的實施方案中，所述真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括真菌亞門(Eumycota)和卵菌亞門(如Hawksworth等，1995，出處同上所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌的特徵是，具有由幾丁質、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖以及其它複合多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲的延長進行營養生長，碳分解代謝為專性需氧型。相反，酵母例如啤酒糖酵母的營養生長是通過單細胞菌體的出芽而碳分解代謝為發酵型。
在甚至更優選的實施方案中，所述絲狀真菌宿主細胞是包括但不限於支頂孢屬(Acremonium)、麴黴屬(Aspergillus)、鐮孢屬(Fusarium)、腐質黴屬(Humicola)、毛黴屬(Mucor)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、鏈孢黴屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、草根黴屬(Thielavia)、Tolypocladium、或木黴屬(Trichoderma)的細胞。
在最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴細胞。在另一最優選的實施方案中，所述絲狀真菌宿主細胞是杆孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢、禾穀鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、玫瑰色鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum的細胞。在甚至更優選的實施方案中，絲狀真菌親本細胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)細胞。在另一最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛黴、嗜熱毀絲黴、粗糙鏈孢黴、產紫青黴、Trichoderma harzianum、康寧氏木黴、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或綠色木黴細胞。
真菌細胞可通過涉及原生質體形成、原生質體轉化、以及細胞壁以其本身已知的方式再生等的過程來轉化。用於轉化麴黴屬宿主細胞的適宜方法描述於EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 811470-1474。用於轉化鐮孢屬的適宜方法見Malardier等1989，Gene 78147-156和WO 96/00787。酵母可用Becker和Guarente在Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153163；以及Hinnen等1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751920描述的方法轉化。
生產方法本發明還涉及產生本發明多肽的方法，所述方法包括(a)培養棲熱菌屬的菌株以生產含所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。優選所述菌株是紅色棲熱菌的菌株，更優選是紅色棲熱菌ATCC 31556。
本發明還涉及產生本發明多肽的方法，所述方法包括(a)在可導致所述多肽產生的條件下培養上述重組宿主細胞；和(b)從所述細胞和/或培養基中回收所述多肽。
在本發明的生產方法中，使用本領域已知的方法，在適於生產該多肽的營養培養基中培養這些細胞。例如，該細胞可以在實驗室或工業發酵罐中，用適當的培養基，在允許多肽表達和/或分離的條件下，通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批、或固態發酵)進行培養。使用本領域已知的方法，在含有碳和氮源以及無機鹽的適當培養基中進行培養。適當的培養基可以從供應商處得到，或者可以根據已經公布(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)的組成來製備。如果該多肽分泌至營養培養基中，可直接從該培養基回收多肽。如果該多肽未被分泌，可從細胞裂解物回收。
這些多肽可以用本領域已知的、對所述多肽特異的方法來檢測。這些檢測方法可以包括特異性抗體的使用、酶產物的形成、或酶底物的消失。例如，可以用酶試驗測定此處所述的多肽的活性。
產生的多肽可以通過本領域已知的方法進行回收。例如，該多肽可以通過傳統程序從培養基中回收，包括但不限於，離心、過濾、提取、噴霧乾燥(spray-drying)、蒸發、或沉澱。
該多肽可以通過本領域已知的各種方法進行純化，包括但不限於，層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦、和大小排阻層析)、電泳方法(例如，製備型等電聚焦)、差異溶解(differential solubility)(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE、或提取(參見，例如，蛋白純化，J.-C.Janson和Lars Ryden編輯，VCH出版社，紐約，1989)。
植物本發明還涉及用編碼具有葡聚糖轉移酶活性之多肽的核酸序列轉化的轉基因植物、植物部分或植物細胞以便以可回收的數量表達並生產所述多肽。可從植物或植物部分回收所述多肽。或可用含所述重組多肽的植物或植物部分例如改善食品或飼料的質量，例如提高營養價值、適口性和流變特性或破壞抗營養因子。
所述轉基因植物可以是雙子葉的(a dicot)或單子葉的(a monocot)。例如，單子葉植物的實例是草，例如草地早熟禾(藍草、早熟禾屬(Poa))、草料草例如festuca、lolium、溫帶草(temperate grass)，例如剪股穎屬(Agrostis)和穀類植物，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱、和玉米。
雙子葉植物的實例是菸草、豆類，例如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、黃豆和大豆，以及十字花科植物(芸苔科(Brassicaceae))，例如花椰菜、油菜籽和近親模型植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的實例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子和塊莖。特定植物組織，例如葉綠體、質外體、線粒體、液泡、過氧物酶體和胞質也被認為是植物部分。此外，無論什麼組織來源的細胞均可被認為是植物部分。
本發明還包括所述植物、植物部分和植物細胞的子代。
按照本領域已知的方法可以構建表達本發明多肽的轉基因植物或植物細胞。簡而言之，通過將編碼本發明多肽的一種或多種構建體摻入植物宿主基因組，然後使所得的修飾的植物或植物細胞繁殖成轉基因植物或植物細胞可構建所述植物或植物細胞。
方便地，所述表達構建體是核酸構建體，所述核酸構建體含有與在所選植物或植物部分中表達所述核酸序列所需的適宜調節序列可操作相連的、編碼本發明多肽的核酸序列。此外，所述表達構建體可含有用於鑑定所述表達載體已整合至其中的那些宿主細胞的選擇性標記以及將所述構建體導入目標植物中所需的DNA序列(後者取決於所用的DNA導入方法)。
調節序列，例如啟動子和終止子序列和任選的信號或轉位序列的選擇取決於例如何時、何處以及如何表達所述多肽。例如，當若編碼本發明多肽之基因的表達可以是組成型或誘導型，或是發育、階段或組織特異性的，且可將所述基因產物靶向至特異性的組織或植物部分例如種子或葉。調節序列可參見Tague等1988，Plant Physiology 86506。
對於組成型表達，可使用35S-CaMV啟動子(Franck等，1980，Cell 21285-294)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯存庫(sink)組織例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(Edwards Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)或來自代謝庫(sink)組織例如分生組織(Ito等1994，Plant Mol.Biol.24863-878)的啟動子，種子特異性啟動子例如來自稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子(Wu等1998，Plant and Cell Physiology 39885-889)，來自蠶豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4和未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)，來自種子油體蛋白的啟動子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39935-941)，來自Brassica napus的貯存蛋白napA啟動子，或本領域已知的任何其它種子特異性啟動子，例如WO 91/14772描述的那些。此外，所述啟動子可以是葉特異性啟動子例如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology102991-1000)，小球藻病毒腺苷酸甲基轉移酶基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 2685-93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248668-674)或創傷誘導型啟動子例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22573-588)。
還可將啟動子增強元件用於在植物中使所述酶的表達水平更高。例如，所述啟動子增強元件可以是位於所述啟動子和編碼本發明多肽之核苷酸序列間的內含子。例如Xu等，1993，同上文公開了稻肌動蛋白1基因的第一內含子提高表達的用途。
選擇性標記基因和所述表達構建體的任何其它部分可選自本領域可獲得的其它相應基因。
將核酸構建體導入植物基因組可按照本領域已知的常規方法，例如土壤桿菌(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、生物彈射(biolistic)轉化和電穿孔(Gasser等，1990，Science 2441293；Porykus，1990，BiolTechnology 8535；Shimamoto et al.，1989，Nature 338274)。
目前，根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumegaciens)-介導的轉移是用於產生轉基因雙子葉植物的方法(有關綜述，參見Hooykas and Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 1915-38)。也可用其轉化單子葉植物，但通常優選用其它轉化方法轉化單子葉植物。目前，用於產生轉基因單子葉植物的方法是對胚胎愈傷組織或正在發育的胚胎進行粒子(用轉化DNA包被的顯微金或鎢顆粒)轟擊(Christou，1992，Plant Journal 2275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5158-162；Vasil et al.，1992，BiolTechnology 10667-674)。用於轉化單子葉植物的另一種方法是基於Omirulleh等1993，PlantMolecular Biology 21415-428所述的原生質體轉化。
轉化後，按照本領域熟知的方法篩選其中已摻入所述表達載體的轉化體，然後再生成完整植株。
本發明還涉及用於生產本發明多肽的方法，所述方法包括(a)在可導致所述多肽生產的條件下，培養含編碼具有葡聚糖轉移酶活性之多肽的核酸序列的轉基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。
進一步通過下列非限制性實施例說明本發明。
材料和方法分子克隆技術描述於J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor，NewYork.
使用下列市售質粒/載體pT7 Blue(Invitrogen，Netherlands)和pBAD/Myc-HisB(Invitrogen，Netherlands)。
將下列菌株用於轉化和蛋白質表達大腸桿菌DH12S(GIBCO BRL，LifeTechnologies，U.S.A.)。
用作緩衝液和底物的化學物質是至少試劑級的市售產品。
葡聚糖轉移酶活性的確定按照改進過的Takaha等，在J.Biol.Chem.268，1391-1396(1993)中所述的方法確定葡聚糖轉移酶活性底物溶液溶解於pH調整到7.0的20mM磷酸鈉中的1％(w/v)麥芽三糖。
活性測量(1)在65℃預保溫300μl底物溶液。
(2)加入50μl酶溶液，並在65℃保溫10分鐘。
(3)加入50μl 0.04 N NaOH，以終止反應。
(4)使所述溶液在室溫靜置10分鐘以便使α-和3-葡萄糖端基異構體以達平衡。
(5)用Glucose B-檢測試劑盒(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Japan)確定釋放的葡萄糖的量。
將1單位酶活性定義為在上述條件下每分鐘釋放1μmol葡萄糖所需的酶量。
實施例實施例1紅色棲熱菌葡聚糖轉移酶基因探針的製備根據其它已公開的葡聚糖轉移酶基因設計引物gt-1和gt-5，然後與來自紅色棲熱菌的基因組DNA一起用於聚合酶鏈反應(PCR)。在下列來源的葡聚糖轉移酶中鑑定了上述葡聚糖轉移酶基因Solanum tuberosum，登記號(AC)q06801J.Biol.Chem.268，1391-1396(1993)；丁酸梭菌NCIMB7423，AC 137384Microbiology 143(10)，3287-3294(1997)；大腸桿菌K-12，AC p15977Mol.Microbiol.2，473-479(1988)；人(Homosapiens)，AC p35573J.Biol.Chem.267，9294-9299(1992)；流感嗜血桿菌，AC p45176Science 269，496-512(1995)；肺炎鏈球菌，AC p29851Cell 31，327-336(1982)；集胞藍細菌屬菌株，AC p72785DNA Res.3，109-136(1996)；水生棲熱菌，AC AB016244Appl.Environ.Microbiol.65，910-915(1999)；和布氏疏螺旋體，AC AE001127Nature 390，580-586(1997)。
PCR引物gt-15′-GGI GAY ATI CCI ATH TAY RTI GS-3′gt-55′-RTT RTC RTG IGT ICC IGT RTA-3′I＝肌苷R＝A或GY＝C或TH＝A或T或CS＝G或C在下列條件下完成PCR70μl H2O10μl 10X反應緩衝液15μl 25mM MgCl2
2μl Taq聚合酶(Boehlinger)2μl 25mM dNTPs1μl 模板(＞1μg)步驟194℃，75秒步驟294℃，45秒步驟352℃，45秒步驟472℃，90秒(步驟2-431個循環)步驟572℃，180秒在瓊脂糖凝膠上分離PCR反應混合物，從其它公開的數據(參見上數參考資料)計算所擴增PCR片段的預期大小，大約為600bp。將這些片段用SuprecTM-01(TAKARA)進行凝膠純化，然後用Takara連接試劑盒版本2連接到pT7Blue載體中。然後通過電穿孔將連接的混合物轉化到大腸桿菌DH12S中。用限制酶消化檢測來自所得轉化體的質粒以確定紅色棲熱菌葡聚糖轉移酶插入片段的大小。
實施例2紅色棲熱菌葡聚糖轉移酶基因的克隆用所述插入片段作為紅色棲熱菌葡聚糖轉移酶探針，對來自紅色棲熱菌的消化的基因組DNA進行Southern雜交以篩選用於產生亞克隆的適宜的限制酶。選出雜交的1.8kb Kpn I和Sac II片段以及雜交的1.6kb Sca I和Kpn片段用於葡聚糖轉移酶基因亞克隆。分別用Kpn I-Sac II和Sea I-KpnI消化紅色棲熱菌基因組DNA。然後將這兩種分離的片段從瓊脂糖凝膠中切出，然後克隆至pBluescript SK(-)中。通過將連接的克隆轉化到大腸桿菌DH12S細胞中來製備這兩個文庫。用Hybond-N+膜(Amersham PharmaciaBiotech，Japan)對這兩個文庫的轉化體進行菌落轉移，然後與DIG-標記的探針雜交。撿出陽性菌落，用PCR檢測插入片段。製備來自所選菌落的質粒，然後通過ABI PRISMETM310 Genetic Analyzer測序。
實施例3表達載體的構建通過使用分別包括Nco I和Xba I限制位點的引物ruben-Nco和ruben-Xba，從紅色棲熱菌基因組DNA擴增完整葡聚糖轉移酶基因。用Nco I和Xba I切割PCR-擴增的片段使得可定向克隆到用Nco I和Xba I消化的pBAD/Myc-His A載體中。所得載體pFuku-ruben(示於
圖1中)轉化至TOP10大腸桿菌中並用阿拉伯糖誘導後，產生本發明的多肽。
引物ruben-Nco用於擴增紅色棲熱菌葡聚糖轉移酶基因的PCR引物(正向)。下劃線的核苷酸導入Nco I位點5′-GCGCCATGGAACTCCAACGCGCTTTTG-3′ruben-Xba用於擴增紅色棲熱菌葡聚糖轉移酶基因的PCR引物(反向)。下劃線的核苷酸導入Xba I位點5′-GCGTCTAGATCAAGCGCGCTGGCTGGCCTC-3′另將含完整紅色棲熱菌葡聚糖轉移酶編碼核苷酸序列的pBAD/Myc-HisB轉化到保藏在德國有關微生物和細胞培養物保藏中心，保藏號為DSM13049(見下文)的大腸桿菌DH12S中。
實施例4本發明多肽的表達紅色棲熱菌葡聚糖轉移酶在用pFuku-ruben轉化的TOP10大腸桿菌中異源表達。在28℃，將大腸桿菌細胞在含100μlg/ml氨苄青黴素的SB培養基中培養過夜。然後加入0.1％阿拉伯糖誘導表達。將細胞通過離心沉澱，然後重懸在20mM磷酸緩衝液(pH6.0)中。緩衝液的量相當於1/20生長培養基。然後對細胞進行超聲處理，離心除去碎片。
實施例5pH圖譜按上述將細胞提取物70℃預熱10分鐘，除去碎片，然後在65℃分析預處理的細胞提取物的葡聚糖轉移酶活性。將兩種不同的緩衝液用於底物溶液的製備4.5≤pH≤6.0醋酸鈉緩衝液5.5≤pH≤8.5磷酸鈉緩衝液如圖2所示，本發明多肽的最佳pH為6.5-7.5。
實施例6溫度圖譜為了確定所述酶的溫度圖譜，按上述將細胞提取物70℃預熱10分鐘，除去碎片，然後在30-75℃，pH7.0，分析預處理的細胞提取物的葡聚糖轉移酶活性。如圖3所示，該酶的最佳溫度為50℃-70℃。
實施例7熱穩定性為了確定所述酶的熱穩定性，按上述將細胞提取物在50-75℃間，以不同的溫度預熱10分鐘，除去碎片，然後在65℃分析預處理的細胞提取物的葡聚糖轉移酶活性。如圖4所示，在70℃所述酶是穩定的，但此後所述酶的穩定性急劇降低。
生物材料的保藏根據布達佩斯條約，下列生物材料已保藏在德國微生物和細胞培養物保藏中心(Mascheroder Weg 1 B，D-38124 Braunschweig)並給出下列保藏號。
保藏物登記號保藏日大腸桿菌DH12S pFuku-Ruben DSM 13049 1999年9月20
序列表110諾沃挪第克公司(Novo Nordisk A/S)120具有葡聚糖轉移酶活性的多肽和編碼該多肽的核酸1306012.204-WO1401411602170PatentIn Ver.2.121012111503212DNA213紅色棲熱菌(Thermus rubens)220221CDS222(1)..(1503)4001atg caa ctc caa cgc gct ttt gga att ttg ctc cac ccc acc agt ttt 48Met Gln Leu Gln Arg Ala Phe Gly Ile Leu Leu His Pro Thr Ser Phe1 5 10 15ccg ggt cgc tgg ggg att ggg gct ctg ggc cgc gag gcc gag cgg ttt 96Pro Gly Arg Trp Gly Ile Gly Ala Leu Gly Arg Glu Ala Glu Arg Phe20 25 30ttg gac tgg ctg gcc gat gcg gga gcc cgc tgg tgg cag gtc tta ccg 144Leu Asp Trp Leu Ala Asp Ala Gly Ala Arg Trp Trp Gln Val Leu Pro35 40 45ctg ggc cct acc agt tac ggc gac tcg ccg tac cag tcc ttc tcg gct 192Leu Gly Pro Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Ser Ala50 55 60ttt gcc ggt aac ccg tat ttg gtt gac ccc gag atg ctg att gaa aaa 240Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Val Asp Pro Glu Met Leu Ile Glu Lys65 70 75 80ggc tgg ctg gaa caa agc gaa gcg ccc ccg ccg tat ccg acc cag cgc 288Gly Trp Leu Glu Gln Ser Glu Ala Pro Pro Pro Tyr Pro Thr Gln Arg85 90 95gtg 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His Phe Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp290 295 300Glu Val Pro Phe Gly Arg Pro Asn Ala Val Glu Gly Arg Trp Val Lys305 310 315 320Ala Pro Gly Glu Lys Leu Phe Ala Ala Val Arg Ala Gln Leu Ser Asp325 330 335Ala Pro Ile Ile Ala Glu Asp Leu Gly Val Ile Thr Pro Glu Val Glu340 345 350Ala Leu Arg Asp Gly Phe Gly Phe Pro Gly Met Lys Ile Leu Gln Phe355 360 365Ala Phe Ser Gly Glu Asp Asn Ala Phe Leu Pro His Asn Tyr Pro Ala370 375 380His Gly Asn Val Val Val Tyr Ser Gly Thr His Asp Asn Asp Thr Thr385 390 395 400Leu Gly Trp Phe Arg Thr Ala Pro Glu Ala Glu Arg Ala Phe Met Arg405 410 415Ala Tyr Leu Ala Arg Tyr Gly Ile Arg Cys Leu Ser Glu Tyr Glu Val420 425 430Ala Gly Ala Leu Ile Glu Leu Ala Phe Lys Ser Pro Ala Lys Leu Ala435 440 445Ile Val Pro Leu Gln Asp Val Leu Gly Leu Gly Pro Glu Ala Arg Met450 455 460Asn Phe Pro Gly Arg Leu Gly Asp Asn Trp Ala Trp Arg Tyr Ala Glu465 470 475 480Gly Asp Leu Glu Pro Gly Leu Ala Ala Gly Leu Arg Ala Leu Ala Glu485 490 495Ala Ser Gln Arg Ala500
權利要求
1.具有葡聚糖轉移酶活性的分離的多肽，選自下列(a)具有與SEQ ID NO2的胺基酸1-501所示胺基酸序列有至少65％同一性之胺基酸序列的多肽；(b)由在低嚴緊度條件下與下列序列雜交的核酸序列編碼的多肽(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示核酸序列的互補鏈；或(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列；(c)(a)或(b)的等位基因變體；(d)由克隆到大腸桿菌DSM 13049的質粒中的編碼葡聚糖轉移酶的DNA序列編碼的多肽，或與所述多肽有至少65％同一性的其變體；和(e)所述多肽的具有葡聚糖轉移酶活性的片段。
2.權利要求1的多肽，其具有與SEQ ID NO2中胺基酸1-501所示胺基酸序列至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的胺基酸序列。
3.權利要求1的多肽，含有SEQ ID NO2的胺基酸1-501所示胺基酸序列。
4.權利要求3的多肽，由SEQ ID NO2的胺基酸1-501所示胺基酸序列組成。
5.權利要求1的多肽，其中所述多肽與克隆到大腸桿菌DSM 13049中質粒上的DNA序列的葡聚糖轉移酶編碼部分所編碼的多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或99％的同一性。
6.權利要求1的多肽，其由在中等嚴緊度條件，優選高嚴緊度條件下與下列序列雜交的核酸序列編碼，(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示之核酸序列的互補鏈，或(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列。
7.權利要求1的多肽，其中所述多肽是具有SEQ ID NO2中胺基酸1-501所示胺基酸序列的多肽的變體，其包含一個或多個胺基酸取代、缺失和/或插入。
8.權利要求1的多肽，其在20mM磷酸鹽緩衝液pH7.0中於67℃、優選70℃保溫10分鐘後保留至少75％的活性，所述活性是相對於所述多肽在20mM磷酸鹽緩衝液pH7.0中65℃保溫10分鐘後的活性而測定的。
9.權利要求8的多肽，其在20mM磷酸鹽緩衝液pH7.0中於67℃、優選70℃保溫10分鐘後仍保留至少80％，例如至少85％，優選至少90％，例如至少95％，特別優選基本上全部的活性。
10.權利要求1的多肽，其能夠通過分子內轉糖基化反應產生環狀葡聚糖，底物是α-葡聚糖。
11.權利要求1的多肽，其衍生自棲熱菌屬，優選紅色棲熱菌。
12.權利要求11的多肽，其衍生自紅色棲熱菌ATCC 31556。
13.權利要求1-12的任一多肽，其具有下述多肽的葡聚糖轉移酶活性的至少20％，其中所述多肽含有SEQ ID NO2的胺基酸1-501所示胺基酸序列。
14.權利要求13的多肽，其具有下述多肽的葡聚糖轉移酶的至少30％，例如至少40％，例如至少50％，優選至少60％，例如至少70％，例如至少80％，至少90％或至少95％，其中所述多肽包含SEQ ID NO2的胺基酸1-501所示胺基酸序列。
15.含有編碼權利要求1-14任一多肽之核酸序列的分離的核酸序列。
16.編碼具有葡聚糖轉移酶活性之多肽的分離的核酸序列，選自(a)與SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示之核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)在低嚴緊度條件下與下列序列雜交的核酸序列(i)SEQ ID NO1的核苷酸1-1503所示核酸序列的互補鏈；或(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列；(c)(a)或(b)的等位基因變體；(d)已克隆到大腸桿菌DSM 13049中之質粒內的編碼葡聚糖轉移酶的DNA序列，或與所述DNA序列有至少70％同一性的其變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亞序列，其中所述亞序列編碼具有葡聚糖轉移酶活性的多肽片段；或作為(a)、(b)、(c)、(d)或(e)之互補鏈的分離的核酸序列。
17.權利要求16的核酸序列，含有與SEQ ID NO1中核苷酸1-1503所示核酸序列至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
18.權利要求16的核酸序列，含有與克隆至大腸桿菌DSM 13049中之質粒上的編碼葡聚糖轉移酶的DNA序列至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
19.一種核酸構建體，其含有權利要求15-18任一項的核酸序列且所述序列與能指導所述多肽在適宜表達宿主中表達的一或多個控制序列可操作地相連。
20.一種重組表達載體，含有權利要求19所述核酸構建體、啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號。
21.含權利要求19之核酸構建體的重組宿主細胞。
22.用於生產權利要求1-14任一多肽的方法，所述方法包括(a)培養棲熱菌屬的菌株，優選紅色棲熱菌的菌株，例如紅色棲熱菌ATCC 31556以產生含所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。
23.用於生產權利要求1-14任一多肽的方法，所述方法包括(a)在能導致所述多肽產生的條件下培養權利要求21中定義的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。
24.權利要求1-14任一多肽用於生產食品的用途。
25.權利要求24的用途，其中所述食品選自日本餐後甜點，點心，小麥食品，麵條，gyoza skins，shumai skins，加工的海味，冷凍的或冷藏的加工食品，斷奶食品，嬰兒食品，寵物食品，動物飼料，飲料，運動食品和營養補充食品。
26.用於生產食品的方法，所述方法包括將權利要求1-14定義的任一多肽在加熱烹飪前或即刻後加到食品材料中，從而使所述多肽作用於食品材料中的澱粉以產生環狀葡聚糖。
27.權利要求26的方法，其中所述食品選自日本餐後甜點，點心，小麥食品，麵條，gyoza皮，shumai皮，加工的海味，冷凍的或冷藏的加工食品，斷奶食品，嬰兒食品，寵物食品，動物飼料，飲料，運動食品和營養補充食品。
28.含有權利要求1-14定義的任一多肽的清潔或洗滌劑組合物。
29.權利要求1-14定義的任一多肽用於除去澱粉斑，特別是除去直鏈澱粉斑的用途。
30.用於從硬表面或衣物上除去澱粉斑，特別是除去直鏈澱粉斑的方法，所述方法包括將含直鏈澱粉斑的硬表面或含直鏈澱粉斑的衣物與權利要求1-14定義的任一多肽接觸或與權利要求28定義的組合物接觸。
全文摘要
本發明涉及具有葡聚糖轉移酶活性的分離的多肽以及編碼所述多肽的分離的核酸序列。本發明還涉及含所述核酸序列的構建體、載體和宿主細胞以及生產和利用所述多肽的方法。
文檔編號C12N1/21GK1384875SQ00814673
公開日2002年12月11日 申請日期2000年10月16日 優先權日1999年10月20日
發明者福山志朗 申請人:諾維信公司