單胺氧化酶活性測定方法及單胺氧化酶診斷試劑盒的製作方法
2023-06-22 23:36:01 2
專利名稱：單胺氧化酶活性測定方法及單胺氧化酶診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶法測定單胺氧化酶活性的方法，以及應用該方法配製而成的單胺氧化酶診斷試劑盒，屬於醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
現有技術中，測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有螢光法、免疫抑制法和化學分光光度法。螢光法是以β-苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化酶，其依據是β-苯乙胺在10～100mg時反應速度最大，高於苄胺和5-羥色胺的反應速度。免疫學方法則利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發生反應，測定反應後形成的單胺氧化酶同工酶，目前應用較多的單克隆抗體有MAO-A3C9、MAO-A4F10、MAO-A7B10、MAO-A7E10和MAO-B1C2等。
相對而言，化學分光光度法應有更為普遍。可以用單胺氧化酶催化胺類釋放出的過氧化氫(H2O2)去氧化10-N-甲基氨基甲醯基-3，7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)等發色劑進行測定，也可以應用苄胺(Benzylamine)、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、β-苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine，又稱「3-對羥基苯乙胺」，3-parahdroxyphenylethylamine)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine)等作為反應底物來測定單胺氧化酶的活性。其中，應用苯甲胺類型底物測得的單胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺作底物測得的活性約為3-對羥基苯乙胺作底物的30％。目前，單胺氧化酶測定多用苄胺和對苯甲胺-β-偶氮萘酚作為底物。苄胺法的原理是苄胺在單胺氧化酶的作用下生成苄醛，然後在強鹼性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應，生成醛苯腙，這在生化儀上測定較困難；對苯甲胺-β-偶氮萘酚方法則需要用環乙烷提取，限制了該方法的實用性，且不能應用全自動生化儀分析。
發明內容
本發明的目的是提供一種可以克服現有技術缺點的測定單胺氧化酶活性的方法，以及應用該方法配製而成的單胺氧化酶診斷試劑盒。採用該試劑盒中的試劑，能夠利用紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀進行單胺氧化酶活性測定，而且測定速度快、準確度高，為在醫學檢測領域切實推廣單胺氧化酶活性測定方法及其診斷試劑盒提供技術支撐。
為實現本發明的目的，一種測定單胺氧化酶活性的方法，採用以下步驟進行首先，將需要測定的樣品與含有胺類化合物、2-酮戊二酸酯、穀氨酸脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻，使之發生以下反應，
然後，將反應混合物置於紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm的吸光度的下降速度，進而測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。
上述測定單胺氧化酶活性的方法中，所述胺類化合物是以下物質之一，苄胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質的衍生物。
測定過程中，被測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500，反應溫度控制在20℃～50℃，反應時間控制在2～30分鐘，檢測時設定副波長在405nm以上。
實現本發明單胺氧化酶活性測定方法的診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成
緩衝液40～200mmol/l，胺類化合物0.5～20mmol/l，2-酮戊二酸酯 0.5～50mmol/l，還原型輔酶0.15～0.3mmol/l，穀氨酸脫氫酶 10000～500000U/l，穩定劑/試劑總體積 10～80％。
也可以將以上單劑中的各種成分進行組合配製成雙劑，以利於消除內、外源氨汙染，比如 雙劑的配方不僅僅限於上述表中所列，其中試劑I的成分2-酮戊二酸酯、還原型輔酶、穀氨酸脫氫酶等，可以放在試劑II；試劑II中的胺類化合物也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利於消除內、外源氨汙染，還有利於試劑更穩定
與雙劑類似，三劑的配方也不僅僅限於上述配方，其中試劑I中的2-酮戊二酸酯和還原型輔酶可以放在試劑II或試劑III中，試劑II中的穀氨酸脫氫酶可以放在試劑I或試劑III中，試劑III中的胺類化合物也可以放到試劑I或者試劑II中，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。
本發明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當中，所述胺類化合物優選以下物質之一苄胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質的衍生物，但選擇範圍不受這些列舉所限制。
配製診斷試劑盒時，選擇緩衝液的基本要求是PH值在6.0～11.0範圍之內，可以是「三羥甲基氨基甲烷～鹽酸(Tris-HCl)緩衝液」、「三乙醇胺(Triethanolamine)緩衝液」、「2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩衝液」、「咪唑～鹽酸(Imidazole-HCl)緩衝液」、「雙甘氨肽(Glycylglycine)緩衝液」、「檸檬酸～檸檬酸鈉緩衝液」、「巴比妥鈉～鹽酸緩衝液」、「碳酸鈉～碳酸氫鈉緩衝液」、「硼酸～硼砂緩衝液」、「甘氨酸～氫氧化鈉緩衝液」、「硼砂～氫氧化鈉緩衝液」、「磷酸(Phosphate)緩衝液」或者「磷酸鹽(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)緩衝液」中的至少一種，但緩衝液的選擇範圍並不受這些列舉所限制。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II、三劑的試劑I/試劑II/試劑III當中通常加入穩定劑，其用量約佔所在試劑總體積的10～80％(或者濃度在10～50mmol/l範圍之內)。
用作穩定劑的物質可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、穀氨酸鹽、還原型穀胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。
上述診斷試劑盒的成分當中，所述氧化型輔酶是——氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、氧化型硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD+)或者氧化型硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP+)；所述還原型輔酶是——還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、還原型硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者還原型硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。
研究表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關係的診斷試劑盒較為理想，也是本發明的優選方案緩衝液 80～120mmol/l，胺類化合物 1～10mmol/l，2-酮戊二酸酯 3～20mmol/l，還原型輔酶 0.2～0.3mmol/l，穀氨酸脫氫酶 50000～200000U/l，穩定劑/試劑總體積20～50％。
本發明技術路線上採取單胺氧化酶偶聯穀氨酸脫氫酶反應連續監測單胺氧化酶的活性，具體為單胺氧化酶水解苄胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺等胺類化合物產生氨，再通過偶聯穀氨酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶反應成氧化型輔酶。由於還原型輔酶在340nm有非常明顯的吸收峰，而它們對應的氧化型輔酶在340nm沒有吸收峰，反應所產生的吸光度的變化與樣品中單胺氧化酶的活性成正比。因此，在固定時間間隔內測定主波長340nm處吸光度的下降速度，便能很好地反映出樣品中單胺氧化酶的活性大小。
本發明技術方案的突出的實質性特點和顯著的進步主要表現在(1)本發明完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，通過將還原型輔酶反應成氧化型輔酶，定量反映出被測樣品中單胺氧化酶的活性，測試結果準確；(2)參與酶偶聯反應的成分都是外加的，不受內、外源物質的汙染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結果，而且反應是在緩衝液條件下進行，不會汙染環境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便於行業內推廣應用；(5)應用本發明提供的測定方法可以製成液態試劑、乾粉試劑、幹試劑等多種形式的試劑，用於測定各種樣品中單胺氧化酶的活性大小；(6)本發明提供的液態單胺氧化酶活性診斷試劑盒，穩定性好，存在於其中的各種酶的三維空間結構保持完整，很好地保證了應用測試效果。配成雙劑或者三劑以後，能夠進一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測結果更加可信，試劑更為穩定，可以長時間儲存。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明技術方案作進一步說明。這些例子僅是一些應用範例，不能理解為對本發明權利要求保護範圍的一種限制。
實施例一(單劑)按以下成分和用量配製單胺氧化酶活性診斷試劑盒雙甘氨肽緩衝液80mmol/l，丁基胺1mmol/l，2-酮戊二酸酯 3mmol/l，thio-NADH 0.2mmol/l，穀氨酸脫氫酶 50000U/l，乙二醇50％(佔試劑總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度37℃、反應時間10分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上，被測單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應方向為負反應(吸光度下降，下同)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和配成的單劑，兩者在分析儀內部自動混勻，檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。對同一批樣品多次重複以上過程，測試結果重複性好、精確度高。
實施例二(雙劑)按以下成分和用量配製單胺氧化酶活性診斷試劑盒試劑I——咪唑～鹽酸緩衝液100mmol/l，2-酮戊二酸酯12mmol/l，NADPH 0.25mmol/l，穀氨酸脫氫酶120000U/l，甘油50％(佔試劑I總體積)；
試劑II——咪唑～鹽酸緩衝液100mmol/l，β-苯乙基胺 6mmol/l，乙二醇 20mmol/l。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度30℃、反應時間15分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上，被測單胺氧化酶樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應方向為負反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
先加入樣品和試劑I，5分鐘之後加入試劑II，三者在分析儀內部自動混勻，檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。對同一批樣品多次重複以上過程，測試結果重複性好、精確度高。
實施例三(三劑)按以下成分和用量配製單胺氧化酶活性診斷試劑盒試劑I三乙醇胺緩衝液120mmol/l，2-酮戊二酸酯 20mmol/l，thio-NADPH0.3mmol/l，丙二醇20mmol/l；試劑II——三乙醇胺緩衝液120mmol/l，穀氨酸脫氫酶 200000U/l，丙二醇50％(佔試劑II總體積)；試劑III——三乙醇胺緩衝液120mmol/l，
酪胺10mmol/l，乙二醇 20mmol/l。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度25℃、反應時間20分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上，被測樣品與試劑I、試劑II和試劑III的總體積之比為1∶25，試劑I、試劑II和試劑III的用量為8∶1∶1，反應方向為負反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
先加入樣品和試劑I、試劑II，5分鐘之後加入試劑III，它們在分析儀內部自動混勻，檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。對同一批樣品多次重複以上過程，測試結果重複性好、精確度高。
實施例四(雙劑優選例)按以下成分和用量配製單胺氧化酶活性診斷試劑盒試劑I——Tris-HCl緩衝液100mmol/l，2-酮戊二酸酯 7mmol/l，NADH 0.25mmol/l，穀氨酸脫氫酶 150000U/l，甘油 50％(佔試劑I總體積)；試劑II——Tris-HCl緩衝液100mmol/l，苄胺 3mmol/l，甘油 50％(佔試劑II總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度37℃、反應時間10分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上，被測樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應方向為負反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
先加入樣品和試劑I，5分鐘之後加入試劑II，三者在分析儀內部自動混勻，發生以下原理性反應
檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。對同一批樣品多次重複以上過程，測試結果重複性好、精確度高。
本發明的顯著特色之一是可以消除內、外源氨的汙染。消除內、外源氨的作用發生在整個反應時間段的前半部分，在後半段時間，受汙染的內、外源氨已經被消耗殆盡，而後半段時間檢測所需要的氨都是產生於單胺氧化酶的活性。
總之，實驗證明採用本發明的測定方法，完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀器，測定出單胺氧化酶樣品的活性大小，測試靈敏度高、精確度好，不受內、外源物質的汙染。而且，本發明提供的單胺氧化酶活性診斷試劑盒，穩定性好，長時間存放之後仍然能夠準確檢測各種類型樣品中單胺氧化酶的活性。
權利要求
1.一種測定單胺氧化酶活性的方法，包括以下步驟①將待測樣品與含有胺類化合物、2-酮戊二酸酯、穀氨酸脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻，使之發生以下反應，②將反應混合物置於紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm的吸光度的下降速度，測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。
2.根據權利要求1所述的測定單胺氧化酶活性的方法，其特徵在於所述胺類化合物是以下物質之一，苄胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質的衍生物。
3.根據權利要求1或2所述的測定單胺氧化酶活性的方法，其特徵在於待測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500，反應溫度控制在20℃～50℃，反應時間控制在2～30分鐘，檢測時設定副波長在405nm以上。
4.一種單胺氧化酶診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩衝液 40～200mmol/l，胺類化合物 0.5～20mmol/l，2-酮戊二酸酯0.5～50mmol/l，還原型輔酶 0.15～0.3mmol/l，穀氨酸脫氫酶10000～500000U/l，穩定劑/試劑總體積 10～80％。
5.根據權利要求4所述的單胺氧化酶診斷試劑盒，其特徵在於所述胺類化合物是以下物質之一，苄胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質的衍生物。
6.根據權利要求4或5所述的單胺氧化酶診斷試劑盒，其特徵在於所述緩衝液的PH範圍是6.0～11.0。
7.根據權利要求6所述的單胺氧化酶診斷試劑盒，其特徵在於所述緩衝液是「三羥甲基氨基甲烷～鹽酸緩衝液」、「三乙醇胺緩衝液」、「2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩衝液」、「咪唑～鹽酸緩衝液」、「雙甘氨肽緩衝液」、「檸檬酸～檸檬酸鈉緩衝液」、「巴比妥鈉～鹽酸緩衝液」、「碳酸鈉～碳酸氫鈉緩衝液」、「硼酸～硼砂緩衝液」、「甘氨酸～氫氧化鈉緩衝液」、「硼砂～氫氧化鈉緩衝液」、「磷酸緩衝液」或者「磷酸鹽緩衝液」中的至少一種。
8.根據權利要求4或5所述的單胺氧化酶診斷試劑盒，其特徵在於所述穩定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、穀氨酸鹽、還原型穀胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。
9.根據權利要求4或5所述的單胺氧化酶診斷試劑盒，其特徵在於所述氧化型輔酶是——氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+、氧化型硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD+或者氧化型硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP+；所述還原型輔酶是——還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸NADH、還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、還原型硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者還原型硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。
10.權利要求4～9中任意一種單胺氧化酶診斷試劑盒，其特徵在於所述試劑配成單劑、雙劑或者三劑。
全文摘要
本發明涉及單胺氧化酶活性的測定方法及其診斷試劑盒。利用單胺氧化酶水解苄胺、對苯甲胺－β－偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β－苯乙基胺、酪胺等胺類化合物產生氨，再偶聯穀氨酸脫氫酶反應，將還原型輔酶反應成氧化型輔酶，通過測定主波長340nm處吸光度的下降速度定量反映出樣品中單胺氧化酶的活性大小。該方法特異性高，不受內、外源物質的汙染，測試結果精確、準確性好。將診斷試劑盒製成雙劑或三劑可減少各成分的交叉影響，保持試劑的穩定性，便於長期儲存。該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便於行業內推廣應用。
文檔編號C12Q1/32GK1789428SQ20041006619
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月13日 優先權日2004年12月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司