C21orf82在製備胰腺癌預後評估產品中的應用的製作方法
2023-06-23 09:12:41 2
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及分子標記物在製備胰腺癌預後評估產品中的應用。
背景技術：
：胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，在西方國家惡性腫瘤死亡率第四位,全球每年約250萬人死於胰腺癌。我國胰腺癌發病率逐年上升，近20年增長迅速。胰腺癌的治療主要為手術、化療和放療相結合的綜合治療，其五年生存率小於5％。由於胰腺的解剖學位置較深，腹部疼痛、體重減輕、黃疸等臨床特異性的症狀不易被發現，多數患者確診時已發生癌症轉移。胰腺癌發生肝轉移較早，早期診斷、根治性手術切除是胰腺癌患者獲得長期存活的唯一希望，但80％以上的患者就診時已經失去了根治性切除的機會。因此，提高胰腺癌的早期診斷率，抑制腫瘤的生長和轉移，提高藥物的治療效果，成為改善胰腺癌患者預後的關鍵因素。目前臨床上常用的胰腺癌腫瘤學標誌物是CA19-9。CA19-9單獨作為診斷胰腺癌的指標尚不精確，敏感性較低，並且在其他消化道腫瘤及良性疾病中也有升高，因此對胰腺癌早期診斷的價值有限。另外，一些基因腫瘤標誌物也用於臨床胰腺癌的早期診斷，但始終未能達到診斷的目的。因此，需要更迫切地尋找一些敏感性或特異性更好的標誌物用於胰腺癌的早期診斷、療效評估或轉移復發的監控。技術實現要素：為了實現胰腺癌的早期診斷，預後評估，復發監控，個體化治療，本發明的目的之一在於提供一種檢測胰腺癌的分子標記物。本發明的目的之二是在於提供所述分子標記物在製備胰腺癌預後評估產品中的應用。本發明的目的之三在於提供一種胰腺癌預後評估的試劑盒。為實現上述目的，本發明首先提供一種檢測胰腺癌的分子標記物，所述標記物為C21orf82，其核苷酸序列為SEQIDNO.1。進一步地，本發明提供了所述的分子標記物在製備胰腺癌預後評估產品中的應用。優選地，所述產品為晶片或試劑盒。優選地，所述晶片為基因晶片。優選的，所述基因晶片包括固相載體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應於C21orf82核苷酸的部分或全部序列。進一步地，本發明提供一種胰腺癌預後評估的試劑盒，所述試劑盒包括：(1)組織或血液樣品提取總RNA試劑；(2)反轉錄試劑；(3)定量PCR試劑。優選地，組織或血液樣品提取總RNA試劑包括TRizol、三氯甲烷、異丙醇、75％乙醇和無酶水；所述反轉錄試劑包括5xPrimerScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers和RNaseFreedH2O。優選地，所述定量PCR試劑包括特異性擴增C21orf82的引物序列。優選地，所述引物序列包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。優選地，所述的引物序列適用於SYBRGreen、TaqMan探針、雙雜交探針、複合探針的檢測。優選地，所述定量PCR試劑還包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBRGreen螢光染料。優選地，所述試劑盒含有陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為人正常的胰腺組織或細胞的總RNA或DNA；所述陰性對照為蒸餾水。進一步地，本發明提供了一種評估胰腺癌治療效果的方法，所述方法包括如下步驟：(1)獲取受試者的樣品；(2)檢測受試者樣品中C21orf82的表達水平；(3)將測得的C21orf82的表達水平與受試者的患病與否關聯起來判斷治療效果。判斷標準如下：治療後C21orf82表達水平與治療前相比，比值P≤1判斷為治療無效，1<P<1.5判斷為病情改善，1.5＜P判斷為治療顯著。優選地，所述受試者樣品包括胰腺癌組織樣品和血液樣品；所述受試者樣品為治療前的或治療後的樣品。優選地，所述治療包括施用手術幹涉，化療，放療，藥物治療或其組合。本發明的有益效果如下：本發明公開了一種與胰腺癌相關的lncRNAC21orf82，並且通過單因素Cox回歸分析了C21orf82為胰腺癌保護性因素。利用C21orf82檢測胰腺癌不僅能夠快速有效的做到早期檢測、預後評估，其精確度大大提高，而且為基因治療、藥物治療等臨床應用提供了治療靶點和重要依據。附圖說明圖1C21orf82表達水平對胰腺癌患者總生存期的影響。具體實施方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用的試劑可以商業購買得到。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常為本領域常規方法，如按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑製造廠家所建議的條件。本發明基於TCGA資料庫信息中160個胰腺癌患者的數據進行胰腺癌的生存分析篩選相關基因，篩選得到與生存時間相關C21orf82，通過單因素Cox回歸分析發現C21orf82為保護性因素。進一步通過定量PCR檢測胰腺癌患者C21orf82表達量，並分析與總生存時間的關係。本發明所述的基因是在本發明之前的已知基因，均來源於人類基因組。Genebank登錄號：C21orf82：GeneID:114036。C21orf82又名LINC00310(longintergenicnon-proteincodingRNA310，長鏈非編碼蛋白質的RNA310)，位於21號染色體上。在本發明中，「預後」是指癌症患者在通過手術、化療、藥物治療或其組合處理等抑制或緩解腫瘤生長後的過程或結果。預後可以是通過手術、化療、藥物治療或其組合處理抑制或緩解胰腺癌生長後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態。預後可以通過檢查標誌物來評估，所述的標記物為一個或多個基因。預後評估可以這樣進行：根據標誌物的有或無，或者升高或降低，確定患者的預後是良好還是不良，或者確定良好預後或不良預後的概率。本發明中，TNM分期是目前國際上最為通用的腫瘤分期系統。目前他已經成為臨床醫生和醫學科學工作者對於惡性腫瘤進行分期的標準方法。國際TNM分期系統各不相同，因此TNM分期中字母和數字的含義在不同腫瘤所代表的意思不同。TNM分期中T，N，M確定後就可以得出相應的總的分期，即I期，II期，III期，IV期等。I期的腫瘤通常是相對早期的腫瘤有著相對較好的預後。分期越高意味著惡性腫瘤程度越高。本發明參考胰腺癌AJCCTNM分期。如：胰腺癌AJCC2002年(第6版)TNM分期：原發腫瘤(T)TX原發腫瘤不能確定；T0未見原發腫瘤；Tis原位癌；T1腫瘤限於胰腺內，最大徑≤2cm；T2腫瘤限於胰腺內，最大徑＞2cm；T3腫瘤侵犯至胰腺外，未累及腹腔幹或腸繫膜上動脈；T4腫瘤累及腹幹軸或腸繫膜上動脈。區域淋巴結(N)Nx區域淋巴結不能確定；N0無區域淋巴結轉移；N1有區域淋巴結轉移。遠處轉移(M)Mx遠處轉移不能確定；M0無遠處轉移；M1有遠處轉移。臨床分期：0期TisN0M0；IA期T1N0M0，IB期T2N0M0；IIA期T3N0M0，IIB期T1N1M0，T2N1M0，T3N1M0；Ⅲ期T4任何NM0；Ⅳ期任何T任何NM1。實施例1基於TCGA資料庫信息進行胰腺癌的生存分析篩選相關基因1、臨床信息篩選檢索TCGA資料庫中的胰腺癌患者臨床信息，截至2015年12月10日，TCGA資料庫中總共記載了185例胰腺癌臨床病例。對這些數據進行篩選，共有160例患者納入研究。篩選時排除具有其他惡性腫瘤病史、曾接受過放療或化療的患者，同時納入研究的患者需含臨床信息和mRNA數據。2、生存期研究樣本統計160例胰腺癌患者生存時間的統計結果如下表所示:表1160例胰腺癌患者生存時間統計生存期時間t(年)期初進入研究人數期內死亡人數期內失訪人數t<116027741≤t<25922152≤t<3221023≤t<410224≤t<56015≤t5413、mRNA表達數據生存分析研究方案(1)對胰腺癌高通量mRNA轉錄組數據檢索、數據下載及樣本挑選和歸類。由下載的轉錄組數據通過生物信息學分析篩選得出與胰腺癌生存時間相關的mRNA。(2)用Cytoscape軟體構建由mRNAs組成的生物信息網絡，通過DAVID對生物信息網絡中與胰腺癌生存時間相關的mRNA進行GO分析和Pathway分析。4、胰腺癌mRNA表達數據的生存分析結果將胰腺癌組織的轉錄組數據下載後，去除readcount＝0小於20％的mRNA後用做下一步分析，包括17100個mRNA。提取mRNA基因表達量和胰腺癌TCGA資料庫生存時間數據，採用survival包的coxph函數完成，經單因素Cox回歸分析，篩選得到單因素Cox回歸中p值<0.05的mRNA有580個，包括328個風險性mRNA和252個保護性mRNA。Coef值是回歸係數，HR＞1為風險性因素，HR＜1為保護性因素。為了更好的研究與生存時間相關的mRNA的功能，我們通過GORILLA和GeneCodis軟體對胰腺癌生存時間相關的mRNA進行GO功能富集和KEGG通路富集，篩選標準皆為FDR<0.05。其中C21orf82的p值為0.002901，HR<1為胰腺癌保護性lncRNA。實施例2胰腺癌組織中C21orf82與胰腺癌臨床病理特點及預後相關性1、受試者病理組織標本來自中國醫學科學院北京協和醫院。樣本納入和排除標準如下：(1)入選標準：接受外科手術切除病例，術後病理診斷為胰腺癌；(2)排除標準：病例資料不完整，無病理學以及隨訪資料；腫瘤未切除、或僅行腫瘤的穿刺活檢術，未獲得完整組織學標本。本實施例納入55例胰腺癌患者，其中男性患者34例，女性患者21例，年齡65歲20人；低、中分化32例，高分化23例；腫瘤TNM分期1～2期為41例，3～4期為14例。參與本研究的患者手術前均未接受化、放療以及免疫治療。本研究通過北京協和醫院理論委員會審核。2、方法2.1對組織樣本進行總RNA提取依據編號分別對55例胰腺癌組織及18例癌旁組織進行總RNA提取，採用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進行樣本RNA提取，實驗操作按產品說明書進行，具體操作如下：收集樣本後凍存於液氮，取出後把組織放入已預冷的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀後：①加入Trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘後吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質。移入新管，加入等體積的-20℃預冷異丙醇，充分顛倒混勻，置於冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘後小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉澱(4℃保存)，洗漆沉澱物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾乾沉澱，加入DEPC處理過的水溶解沉澱；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存於-80℃。RNA質量判定標準：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時後的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。2.2RNA樣品的質量分析RNA提取後瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結果可以初步判定提取的RNA樣品質量合格與否。進而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。2.3逆轉錄合成cDNA採用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進行cDNA反轉錄，實驗操作按產品說明書進行，具體操作如下：使用逆轉錄試劑盒，用逆轉錄緩衝液對lμg總RNA進行逆反錄合成cDNA。採用25μL反應體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.4Real-TimePCR2.4.1儀器及分析方法用ABI7500型螢光定量PCR儀，採用2-ΔΔCt法進行數據相對定量分析。採用在線軟體設計引物，基因序列參照NCBI：NR_027266.1(C21orf82)，內參選GAPDH，引物設計後由invitrogen公司合成。具體引物序列如表2所示：表2引物序列操作過程如下：表3RealTime反應體系組分加入量2×mix10μL上遊引物(10uM)0.5μL下遊引物(10uM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL(一)反應體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)進行擴增，實驗操作按產品說明書進行。擴增程序為：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40個循環。(二)引物篩選將各樣本cDNA混合後，以此為模板進行5倍梯度稀釋，稀釋後樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增，同時在60-95℃進行融解曲線分析，根據擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋後取2μL作模板，分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。2.4.2數據統計分析收集臨床病理資料和表達結果，進行統計分析。採用統計學軟體SPSS19.0，統計學顯著差異定義為<0.05。胰腺癌組織中C21orf82表達水平與臨床病理參數的相關性採用卡方或者Fisher’s精確檢驗法。用Kaplan-meier方法進行生存時間分析，擬合總生存時間曲線，應用Long-rank檢驗比較不同組間的生存曲線差異；應用Cox比例風險回歸模型分析預後因素。以p<0.05為有統計學意義。3、實驗結果(1)C21orf82在胰腺癌組織表達情況實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應管的擴增效率相近，極限平而無上揚現在，曲線指數期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產物溶解曲線都是單峰，說明擴增產物只有一條，為特異性擴增；根據qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較C21orf82在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達水平。結果顯示：qRT-PCR擴增結果穩定，其中C21orf82在胰腺癌患組織中的表達水平低於癌旁組織，差異具有統計學意義(p<0.01)。(2)人胰腺癌組織中C21orf82表達水平與臨床特徵的關係根據上述標準劃分胰腺癌組織中C21orf82表達水平的高低，採用統計學軟體SPSS19.0，統計學顯著性差異定義為P<0.05。對胰腺癌組織中C21orf82的表達水平與胰腺癌病例的臨床病理參數進行分析，詳情見表4。結果發現胰腺癌組織C21orf82的表達與淋巴結轉移相關(p<0.05)。表4胰腺癌組織C21orf82表達水平與臨床指標的相關性1依據WHO分級；2依據TNM分期；*p<0.05。(3)C21orf82表達水平與胰腺癌患者的總體生存預後關係應用Kaplan-Meier方法進行生存檢測胰腺癌組織中C21orf82表達水平高低對患者總生存時間的影響。根據C21orf82表達量將患者分成兩組，C21orf82高表達組定義為高表達C21orf82的前40％的患者(22例)，剩餘60％患者定義為C21orf82的低表達組(33例)。結果如圖1所示，C21orf82低表達患者的總生存期(中位生存時間27個月)短於C21orf82高表達的患者(中位生存時間45個月)，C21orf82高表達患者具有更久的生存期，p<0.01，差異具有統計學意義。提示胰腺癌組織中C21orf82異常表達與患者的預後有關。對C21orf82表達水平和臨床病理特徵對患者總體生存期的影響進行單因素和多因素分析(Cox回歸模型)，結果表明C21orf82表達水平是影響胰腺癌患者預後的獨立保護因素(p<0.01)。實施例3試劑盒製備本實施例提供了用於胰腺癌療效評估的試劑盒，該試劑盒包括(1)RNA提取試劑包括TRizol、三氯甲烷、異丙醇、75％乙醇和無酶水；(2)反轉錄試劑包括5xPrimerScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers和RNaseFreedH2O；(3)定量PCR試劑包括特異擴增C21orf82的引物序列如表2所示。和特異擴增管家基因(GAPDH)的引物對如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系，如PCR緩衝液、SYBRGreen螢光染料、dNTPs。所述PCR緩衝液的成分為25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4；還包括胰腺正常組織cDNA：作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個反應體系使用與檢測樣本cDNA相同量。反轉錄體系如表5所示。反應程序為：37℃孵育15min，85℃滅活5s。表5反轉錄體系組分加入量5xPrimerScriptBuffer2μLPrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μLOligodTPrimer(50μM)0.5μLRandom6mers(100μM)0.5μLTotalRNA1ulRNaseFreedH2O至10μL定量PCR反應體系如表6所示。反應程序為：95℃預變性5min，(95℃變性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個循環，72℃延伸15min。表6定量PCR反應體系實施例4C21orf82檢測用於胰腺癌療效評估2010年10月至2015年12月從北京協和醫院收集10例胰腺癌患者治療前和治療後的血液樣品，利用實施例3所述的試劑盒分檢測C21orf82表達含量，根據以下公式計算P值：P＝治療後/治療前，P≤1判斷為治療無效，1<P≤1.5判斷為病情改善，1.5＜P判斷為治療顯著，將P值判斷結果與這10名患者的臨床評價結果進行比較，考察C21orf82檢測用於胰腺癌療效評估的效果。結果如下：由表7可知，試劑盒用於胰腺癌療效評估的結果與臨床評價結果的符合率達100％。表7C21orf82檢測用於胰腺癌療效評估患者編號P值P值判斷結果臨床評價結果11.45病情改善病情改善20.49治療無效果治療無效果31.21病情改善病情改善40.45治療無效果治療無效果51.69療效顯著療效顯著60.54治療無效果治療無效果71.36病情改善病情改善80.98治療無效果治療無效果91.15病情改善病情改善100.78治療無效果治療無效果雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。序列表北京致成生物醫學科技有限公司C21orf82在製備胰腺癌預後評估產品中的應用p16yxa745PatentInversion3.511269DNA人工序列1gcagattcttggcagacctctgttgtttttctagagttgtaggcaagtagttggacaaaa60agcaagaagctgatcgatgttgctggctttggattctttgtgaacaaatgagacaagccc120cttttgtctaaaatagtgatgtacattaaatgcaaagggcaaatggaaccattgaaaagt180actttttgcatccaaaacagccaacgctttggtgcctgctatgtgtcagacactgattct240tctgtcatccttattctactgatgaggcaactgaggcagcttcagagagttcgagtaacc300tgcggatcacacaactaggaagtaagagagctggaacttgacgttgggctgttgacctcc360agaaatggtgttttttccagtactcagtgctgcctctgactccattgtgatggttgattt420tatgtgtcaacttgactgggcccaggggtacccagatatttggtcaaacattattctggg480tgtttctgtgagggcgttttgggtgagattaacatttaaattggtagactgagtaaagca540gatggccctctatgatatggccaggcctcatccaatccattgaaagcctgaatggaacaa600aaaggccaaccctccctcagtaggaggaaatttcgtctgcttgactgcattcaaactagg660acgtcaactttttcctgcctttggacttgaatagaaacatcagctcttcctagatcttca720acctgccaggcttcagattgaagtttataccatcagctctcttggttcttgggcctttgg780acccagactgtaagtgcaccatccgttctcttgggtcttgcttgctgactcaccctgcag840atttggggacttatcagcctctaattctgtgagccaattccttctaatatatctctctat900acgcatcctgtctcactggaagaaccctgatacggttaggctttgtgtcctcattcaaat960ctcatcttgaattgtaaatcccataatccccataatccccatgtgtcaggggagggatca1020ggtggaggtaattgcatcatgggagcagtttcccctgtgctcttctcacgatagtgaaag1080agttctcacaagatctgatggttttataaggggctcttccccctttgctctgcacttccc1140cttcctgctgccttgtggccttgtgaagaaggtgtcttgcttcccctttgccctcctcca1200tgattgtaagtttcctgaggcctccccagtcatgcagaactgtgagtcaattaaacctct1260gtcctttat1269221DNA人工序列2gatcgatgttgctggctttgg21320DNA人工序列3acagcccaacgtcaagttcc20421DNA人工序列4ggagcgagatccctccaaaat21523DNA人工序列5ggctgttgtcatacttctcatgg23當前第1頁1 2 3