固定化微生物發酵丙酸的生產方法

2023-06-23 08:23:31 1

專利名稱：：固定化微生物發酵丙酸的生產方法
技術領域：
：本發明屬於微生物發酵工程
技術領域：
，特別涉及一種固定化微生物發酵生產丙酸的方法。技術背景丙酸(propiornicacid以下簡稱PA)及其鹽是理想的飼料抗真菌劑，在食品、醫藥、香料，除草劑以及可生物降解塑料等領域也具有重要用途。我國作為世界祠料生產大國，對丙酸的需求量很大，並且呈現逐年遞增的態勢。固定化細胞技術是20世紀70年代興起的一種生物技術。所謂固定化細胞技術是指用物理或化學的手段將游離細胞定位於限定的空間區域，並使其保持催化活性、反覆使用的方法。細胞被固定化後細胞密度高、反應速度快、耐毒害能力強、產物分離容易、能實現連續操作，可以大大提高生產能力等優勢。丙酸的生產方法分為化學合成法和微生物發酵法。現有公開的化學合成法包括①輕質烴氧化合成醋酸副產法，②乙烯碳基合成法(Reppe工藝)，③乙醇羰基化法，④丙烯酸加氫法，丙醛氧化法，化學合成法汙染重、成本高、操作條件苛刻，不符合全球環保意識不斷增強的潮流，因此，人們逐漸把注意力投向了微生物發酵法。從上世紀20年代起，人們開展了大量發酵法生產丙酸的研究，取得了不少進展，但是發酵法卻始終未能完全替代化學合成法。主要原因由於丙酸菌的生長會受到發酵終產物(丙酸、乙酸)的抑制，因此發酵液中丙酸濃度較低以及副產物乙酸的存在，增加了丙酸提取的難度;發酵法的總成本高於化學合成法。多年來，業界人士圍繞上述問題進行了大量研究工作。固定化細胞方法按照固定化載體與作用方式的不同，可分為吸附法、包埋法、共價結合法、交聯法。其中的吸附法又叫載體結合法，是依據帶電的微生物細胞和載體之間的靜電、表面張力和粘附力的作用，而使微生物細胞固定在載體表面和內部形成生物膜的方法，可分為物理吸附法和離子吸附法兩種。此法較為簡便，活力損失較小，但細胞與載體作用力小，易脫落。包埋法是將微生物細胞包埋在凝膠的微小空格內或埋於半透膜聚合物的超濾膜內。根據載體材料和方法的不同，包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種。凝膠包埋法是將細胞包埋在各種凝膠內部的微孔中而使細胞固定的方法；半透膜包埋法是將細胞包埋在由各種高分子聚合物製成的小球內而使細胞固定的方法。此法簡單，條件溫和，穩定性好，包埋細胞容量高。共價結合法是細胞表面上功能團和固相支持物表面的反應基團之間形成化學共價鍵連接，從而成為固定化細胞。此法的優點是細胞與載體結合緊密，不易脫落，但製備較難，且活力損失較大。交聯法是利用雙功能或多功能試劑，直接與細胞表面的反應基團(如胺基酸、羥基、硫基、咪唑基)發生反應，使其彼此交聯形成網狀結構的固定化細胞，其結合力是共價鍵。此法製備麻煩，活力損失較大，但細胞與載體結合較緊。固定化細胞技術的關鍵在於所採用的固定化載體材料的性能。理想的固定化載體應具有對微生物無毒性、傳質性能好、性質穩定、壽命長、價格低廉等特性。目前所採用的固定化載體材料主要包括有機高分子載體、無機載體和複合載體三類。有機高分子載體又可分為天然高分子載體(如瓊脂、海藻酸鈉、角叉菜膠等)和合成有機高分子凝膠載體(如聚丙烯醯胺、聚乙烯醇、光硬化樹脂等)。天然高分子凝膠載體一般對生物無毒性，傳質性能好，但強度低，厭氧下易被微生物分解，壽命短；合成高分子凝膠載體一般而言強度較大，但傳質性能較差，進行細胞固定時對細胞活性有影響。無機載體(如陶珠、活性炭、沙粒等)大多具有多孔結構，與微生物接觸時利用吸附和電荷效應把微生物固定。具有機械強度大、對微生物無毒性、不易生物分解、耐酸鹼、成本低等特性且製作簡單易行，只需把載體放入含有微生物一定濃度的溶液中浸泡一段時間即可。複合載體是由有機載體材料和無機載體材料結合而成，使兩類材料在許多性能上互補。固定化細胞方式在有機酸發酵中應用廣泛，用於生產丙氨酸，L(+)酒石酸等有機酸。首次獲得生產丙氨酸的細胞固定化工藝條為1.2%的聚乙烯亞胺和O.9y。的戊二醛分別處理20min和10min,在以CaC03為中和劑時，固定化細胞生產丙氨酸時比發酵過程產生更少的副產物，轉化液的色度降低了75.6%，而糖酸轉化率從60.5%提高到76.4%，丙氨酸產量也從58.2g/L提高到68g/L。固定化細胞的半衰期約670h。進行固定化細胞清潔生產丙氨酸的中試結果表明清潔生產不僅比化學合成法極大地減少了汙染物的排放(每噸產品減少廢水40t,廢渣4.5t，而且比發酵法生產中減少了酸鹼和溶劑的用量和廢水的產生(每噸產品至少減少廢水451).
發明內容本發明的目的在於採用吸附和包埋結合的固定化丙酸菌細胞發酵丙酸，解除產物反饋抑制，並提高菌體使用率，也用利於丙酸的提取，使發酵生產丙酸的水平達到較大提高。為實現上述目的本發明所採用的技術方案如下固定化微生物發酵丙酸的生產方法，其特徵在於包括以下步驟(l)菌種培養(2)固定化費氏丙酸菌(3)液體深層發酵(4)丙酸的提取工藝，其中(1)菌種培養以為生產菌種採用費氏丙酸菌/Vo//。i7/6ac"/7a/>^^/,^力//試管斜面菌種，搖瓶放大培養，種子罐擴大培養；(2)固定化費氏丙酸菌將放大培養菌種，無菌管道輸入到連續離心機離心收集菌體，然後加入種子罐原種子發酵液體積1/20-1/15體積的無菌水製成菌懸液，再加入菌懸液體積(升)1/8-1/6的玉米芯粉(公斤)或"加入菌懸液體積(升)重量(公斤)比l:8-1:6的玉米芯粉，，，攪拌吸附時間1-2h;加入4%-6%濃度無菌的海藻酸鈉溶液，加入體積為菌懸液體積的l.5-2.5倍，然後再加無菌3%-5%濃度的聚乙烯醇，加入體積為菌懸液體積的O.5-1.5倍，攪拌1-2h;無菌輸入滴注器連續滴入菌懸液體積5-10倍的2%-4%濃度的氯化釣溶液中，無菌常溫靜置2-3h，放出氯化鈣溶液，將固定化好的菌體無菌輸入倒液體發酵罐終。(3)液體深層發酵液體發酵培養基(g/L):蛋白腖2-4g，蔗糖5-15g，酵母膏2-4g，甘油5-15ml，磷酸銨2-6g，碳酸鉤4-8g，硝酸銨l-3g，乳酸鈉2-6ml，pH=7.2-7.4;控制罐內溫度30-35。C,罐壓0.01-0.02MPa，連續攪拌，發酵時間36-48h，丙酸含量達20-40g/L發酵液，然後將發酵液放出，進入提取工序，再於發酵罐中再補充無菌新發酵液，液體發酵液體積為固定化菌體體積的10-50倍；(4)丙酸提取工序發酵液經孔徑為1-2nm,膜過濾去處微生物菌體和大分子雜質，過濾操作壓力為O.02-0.03MPa，操作溫度25-30°C;濾液調節pH值到6.0-6.5，然後進行陰離子交換樹脂靜態吸附，濾液與陰離子樹脂體積重量比為10:1-15:1,攪拌速率為20-50轉/分鐘，吸附溫度25-30°C，吸附時間3.5-4.5小時；去除上清液，洗脫樹脂，洗脫液經超濾膜超濾濃縮，採用截留分子量為5000-6000道爾頓的超濾膜進行錯流過濾，超濾操作壓力為O.2-0.6MPa,溫度15-30°C，經結晶得到無色透明的晶體粉末，丙酸純度>95%丙酸產品。本發明所述的生產方法中斜面菌種培養是將丙酸桿菌使用相應培養基並加入15-25g瓊脂，在28-35。C條件下靜止培養20-48小時，放入4。C冰箱保存；其中搖瓶培養條件溫度25-40X:，轉速80-180轉/分鐘，時間19-30h;種子罐培養條件溫度25-40"C,通風量9-13m7h，罐壓0.02-0.09MPa，時間19-60小時。本發明所述的生產方法中玉米芯粉是經過40目篩粉碎合高溫滅菌製得。本發明所採用的陰離子交換樹脂為弱鹼性陰離子交換樹脂例如D301、D311、D330、D201等等。本發明所用菌種和菌種相應使用的培養基見下表tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8本發明採用吸附和包埋結合的固定化丙酸菌細胞發酵丙酸的生產發法的積極效果在於採用吸附-包埋聯合方法克服了丙酸菌生長受到發酵終產物(丙酸、乙酸)抑制的不利因素，提高了發酵液中丙酸的濃度，減低了副產物乙酸的存在，增加了丙酸提取的效率。同時採用本發明的固定化細胞清潔生產丙氨酸不僅比化學合成法極大地減少了汙染物的排放，而且減少了發酵法生產中酸鹼和溶劑的用量，減少了廢水的排放，更適應大規模的工業化生產。說明書附圖圖1為固定化微生物發酵丙酸的生產工藝流程圖。具體實施方式下面結合實施例及工藝流程圖進一步的說明本發明的實施方式。實施例l菌種及所用培養基表ltableseeoriginaldocumentpage8固定化丙酸菌發酵丙酸的生產方法，包括以下步驟(1)菌種培養(2)固定化費氏丙酸菌(3)液體深層發酵(4)丙酸的提取工藝(l)其中菌種培養工序以為生產菌種採用費氏丙酸菌戶ro/7/朋/6ac/er/a/Vew/e/re/c力/7試管斜面菌種，搖瓶放大培養，種子罐擴大培養方法。斜面菌種培養基本培養基(g/L):蛋白腖10，蔗糖20,酵母膏10，磷酸銨5(pH=7.2-7.4)。上述菌種使用相應培養基並加入15g瓊脂，在28。C條件下靜止培養20小時，放入4。C冰箱保存；其中搖瓶培養條件溫度25。C，轉速80轉/分鐘，時間19h;種子罐培養條件溫度25。C,通風量9mVh，罐壓O.02MPa,時間19小時。(2)固定化費氏丙酸菌工序由種子罐放大培養，無菌管道輸入到連續離心機離心收集菌體。然後加入種子罐原種子發酵液體積l/20體積的無菌水製成菌懸液，加入菌懸液體積(升)l/8的玉米芯粉(公斤)或"加入菌懸液體積(升)重量(公斤)比l:8的玉米芯粉"，玉米芯粉經過40目篩粉碎合高溫滅菌，然後進行攪拌吸附時間lh。吸附完成後加入4%濃度無菌的海藻酸鈉溶液，加入體積為菌懸液體積的L5倍，然後再加無菌3%的聚乙烯醇，加入體積為菌懸液體積的0.5倍，攪拌lh。無菌輸入滴注器連續滴入菌懸液體積S倍的2。/。濃度的氯化釣溶液中，無菌常溫靜置2h，然後放出氯化鉀溶液，將固定化好的菌體無菌輸入倒液體發酵罐。(3)液體發酵工序液體發酵培養基(g/L):蛋白腖2g，蔗糖5g，酵母膏2g，甘油5ml，磷酸銨2g，碳酸釣4g，硝酸銨lg，乳酸鈉2ml，pH=7.2。控制罐內溫度30。C，罐壓0.01MPa，連續攪拌，發酵時間36h，丙酸含量達20g/L發酵液，然後將發酵液放出，進入提取工序，再於發酵罐中在補充無菌新發酵液。液體發酵液體積為固定化菌體體積的10倍。(4)丙酸提取工序發酵液經膜過濾去處微生物菌體和大分子雜質，濾膜孔徑為l2fim,過濾操作壓力為0.02MPa，操作溫度25。C。濾液調節pH值到6.0，然後進行陰離子交換樹脂(D301或I)3U)靜態吸附，濾液與陰離於樹脂體積重量比為10:1，攪拌速率為20轉/分鐘，吸附溫度25。C，吸附時間3.5小時。去除上清液，洗脫樹脂，洗脫液經超濾膜超濾濃縮，採用截留分子量為50006000道爾頓的超濾膜進行錯流過濾，超濾操作壓力為O.2MPa，溫度15。C。經結晶得到丙酸產品。丙酸產品無色透明的晶體粉末，丙酸純度》95%(HPLC方法檢測)。實施例2菌種及所用培養基表ltableseeoriginaldocumentpage91費氏丙酸桿菌，"基本培養基(g/L):蛋白腖10,蔗糖20,酵母膏10,磷酸銨5/Veytfenre/.c力//(pH=7.2-7.4)(1)菌種培養工序以為生產菌種採用費氏丙酸菌戶r/朋/》""Wa/>e"de/7re/c//i試管斜面菌種—搖瓶》丈大培養—種子罐擴大培養方法。斜面菌種培養上述菌種使用相應培養基並加入25g瓊脂，在35。C條件下靜止培養48小時，放入4。C水箱保存；其中搖瓶培養條件溫度4(TC，轉速180轉/分鐘，時間30h;種子罐培養條件溫度40X:，通風量13m7h,罐壓O.09MPa,時間60小時。(2)固定化費氏丙酸菌工序由種子罐放大培養，無菌管道輸入到連續離心機離心收集菌體。然後加入種子罐原種子發酵液體積1/15體積的無菌水製成菌懸液，加入菌懸液體積(升)l/6的玉米芯粉(公斤)或"加入菌懸液體積(升)重量(公斤)比l:6的玉米芯粉，，，玉米芯粉經過40目篩粉碎合高溫滅菌，然後進行攪拌吸附時間2h。吸附完成後加入6%無菌海藻酸鈉溶液，加入體積為菌懸液體積的2.5倍，然後再加無菌5%濃度的聚乙烯醇，加入體積為菌懸液體積的1.5倍，攪拌2h。無菌輸入滴注器連續滴入菌懸液體積10倍的4%濃度的氯化鈣溶液中，無菌常溫靜置3h，然後放出氯化鈣溶液，將固定化好的菌體無菌輸入到液體發酵罐。(3)液體發酵工序液體發酵培養基(g/L):蛋白腖4g，蔗糖15g,酵母膏4g，甘油15ml,磷酸銨6g，碳酸鈣8g，硝酸銨3g,乳酸鈉6ml，pH-7.4。控制罐內溫度3S。C,罐壓O.02MPa，連續攪拌，發酵時間48h，丙酸含量達40g/L發酵液，然後將發酵液放出，進入提取工序，再於發酵罐中在補充無菌新發酵液。液體發酵液體積為固定化菌體體積的50倍。(4)丙酸提取工序發酵液經膜過濾去處微生物菌體和大分子雜質，濾膜孔徑為l2nm，過濾操作壓力為0.03MPa，操作溫度30。C。濾液調節pH值到6.5，然後進行陰離子交換樹脂(1)330或D201)靜態吸附，濾液與陰離子樹脂體積重量比為15:1，攪拌速率為50轉/分鐘，吸附溫度3(TC,吸附時間4.5小時。去除上清液，洗脫樹脂，洗脫液經超濾膜超濾濃縮，採用截留分子量為5000~6000道爾頓的超濾膜進行錯流過濾，超濾操作壓力為0.6MPa，溫度30。C。經結晶得到丙酸產品。丙酸產品無色透明的晶體粉末，丙酸純度》95°/。(HPLC方法檢測)。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非對本發明作任何形式改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明的技術方案範圍之內。權利要求1、一種固定化微生物發酵丙酸的生產方法，其特徵在於包括以下步驟菌種培養、固定化費氏丙酸菌、液體深層發酵、丙酸的提取工藝其中(1)菌種培養以為生產菌種採用費氏丙酸菌Propionibacteriafreudenreichii試管斜面菌種，搖瓶放大培養，種子罐擴大培養；(2)固定化費氏丙酸菌將放大得到的培養菌種，無菌管道輸入到連續離心機，離心收集菌體，然後加入種子罐原種子發酵液體積1/20-1/15體積的無菌水製成菌懸液，再加入菌懸液體積1/8-1/6公斤的玉米芯粉，攪拌吸附1-2h；加入4％-6％濃度無菌的海藻酸鈉溶液，加入體積為菌懸液體積的1.5-2.5倍，然後再加3％-5％濃度的聚乙烯醇，加入體積為菌懸液體積的0.5-1.5倍，攪拌1-2h；採用無菌輸入連續滴注器滴入菌懸液體積5-10倍的2％-4％濃度的氯化鈣溶液中，無菌常溫靜置2-3h，放出氯化鈣溶液，將固定化好的菌體無菌輸入倒液體發酵罐中。(3)液體深層發酵液體發酵培養基(g/L)蛋白腖2-4g，蔗糖5-15g，酵母膏2-4g，甘油5-15ml，磷酸銨2-6g，碳酸鈣4-8g，硝酸銨1-3g，乳酸鈉2-6ml，pH＝7.2-7.4；控制罐內溫度30-35℃，罐壓0.01-0.02MPa，連續攪拌，發酵時間36-48h，丙酸含量達20-40g/L發酵液，然後將發酵液放出，進入提取工序，再於發酵罐中再補充無菌新發酵液，液體發酵液體積為固定化菌體體積的10-50倍；(4)丙酸提取工序發酵液經孔徑為1-2μm膜過濾去處微生物菌體和大分子雜質，過濾操作壓力為0.02-0.03MPa，操作溫度25-30℃；濾液調節pH值到6.0-6.5，然後進行陰離子交換樹脂靜態吸附，濾液與陰離子樹脂體積重量比為10∶1-15∶1，攪拌速率為20-50轉/分鐘，吸附溫度25-30℃，吸附時間3.5-4.5小時；去除上清液，洗脫樹脂，洗脫液經超濾膜超濾濃縮，採用截留分子量為5000-6000道爾頓的超濾膜進行錯流過濾，超濾操作壓力為0.2-0.6MPa，溫度15-30℃，經結晶得到無色透明的晶體粉末，丙酸純度≥95％丙酸產品。2、如權利要求l所述的生產方法，其中的斜面菌種培養是將丙酸桿菌使用相應培養基並加入15-25g瓊脂，在28-351C條件下靜止培養20-48小時，放入4。C冰箱保存；其中搖瓶培養條件溫度25-40t:，轉速80-180轉/分鐘，時間19-30h;種子罐培養條件溫度25-4(TC，通風量9-13mVh，罐壓0.02-0.09MPa，時間19-60小時。3、如權利要求l所述的生產方法，其中的玉米芯粉是經過40目篩粉碎合高溫滅菌製得。4、如權利要求l所述的生產方法，其中的陰離子交換樹脂為大孔弱鹼性陰離子交換樹脂。全文摘要本發明公開了固定化微生物發酵丙酸的生產方法，它是採用費氏丙酸桿菌試管斜面菌種，搖瓶放大培養，種子罐擴大培養等步驟，離心收集菌體，製成菌懸液，加入玉米芯粉吸附，加入4％～6％海藻酸鈉溶液，再加3％～5％的聚乙烯醇，攪拌1～2h。隨後滴到2％～4％的氯化鈣溶液中固定化，發酵液經孔徑為1～2μm膜過濾、陰離子交換樹脂靜態吸附、洗脫樹脂、濃縮結晶得到純度≥95％丙酸產品。本發明採用吸附-包埋結合的固定化丙酸菌細胞發酵丙酸，解除了產物反饋抑制，提高了菌體使用率，有利於丙酸的提取，使發酵生產丙酸的水平得到較大提高，更適合丙酸的大規模工業化生產。文檔編號C12R1/01GK101130794SQ20071005862公開日2008年2月27日申請日期2007年8月9日優先權日2007年8月9日發明者丁友昉,王德培,高年發申請人:天津科技大學