抑制病毒複製的方法

2023-06-23 17:05:36 3

專利名稱：抑制病毒複製的方法
技術領域：
本發明涉及能有效抑制利用內部核糖體進入位點(IRES)起動翻譯的傳染性病毒的複製、和/或能抑制在病毒生命周期任何階段利用La蛋白質的病毒的肽。這些肽能與La蛋白質競爭並抑制產毒性病毒生命周期對所需La蛋白質的多種生化和生理功能的利用。更具體說本發明包括在這種抑制中具優異性能的非天然產生的肽。
背景技術：
納入本文作為參考文獻的PCT出版物WO96/11211描述了抑制信使RNA在內部核糖體進入位點(IRES)翻譯的方法，依據的是能結合這種翻譯所需蛋白質的一種寡核苷酸。如該PCT出版物所述，命名為「I-RNA」的此寡核苷酸是根據對表現出所需抑制性能的酵母菌60個核苷酸的RNA的鑑定。然而如本文進一步所述，該I-RNA也可採取此酵母RNA相關部分的各種模擬形式，如脊髓灰質炎病毒186-220核苷酸序列或脊髓灰質炎病毒578-618核苷酸序列和其它各種序列。此抑制性寡核苷酸(I-RNA)的重要性在於核苷酸序列本身和其結合內源蛋白質的能力。I-RNA結合的內源蛋白質命名為人La自身抗原，它能結合抑制性寡核苷酸從而防止抗原所需的與mRNA結合併抑制IRES與核糖體互相作用。如同樣納入本文參考文獻的PCT出版物WO99/61613所述，此蛋白質的跨越野生型La自身抗原位置11-28的18個-胺基酸部分顯示能抑制病毒複製。完整的La自身抗原的胺基酸序列先前已由Chambers，J.C.，等，J.Biol.Chem.(1988)25318043-18061描述，也納入本文參考文獻。La自身抗原(LAP)的18個-胺基酸結合區域和前述寡核苷酸抑制病毒RNA翻譯的機制在上面所引用的WO99/61613中有所描述。
如前所述，一些病毒包括小核糖核酸病毒、C肝病毒和其它病毒利用IRES機制來起動翻譯。由於上述寡核苷酸和LAP抑制此種翻譯，它們也抑制病毒複製和其它病毒必需的功能。如這些出版物所證明，LAP能方便的進入細胞，並位於能影響此種抑制的位置上。
現已發現一個相關肽家族但不包括LAP，在抑制IRES起動翻譯並從而抑制病毒複製中具有用途。這些肽因此可用於治療病毒感染和研究病毒感染的機制。
發明公開的內容本發明針涉及可用作抗病毒製劑和作為闡明病毒感染機制研究工具的一個肽家族。這些肽能抑制IRES-起動RNA翻譯。
因此本發明一方面的內容所針對的肽公式為A1n A2n A3n A4A5A6A7A8A9A10A11A12A13A14A15A16A17A18(1)和其醯化和/或醯胺化形式，其中各個n獨立為0或1；A1、A2和A3各自獨立為任何胺基酸；A4、A12和A17獨立為酸性胺基酸；A13、A14、A15和A18獨立為芳族胺基酸；A5、A7、A8、A11和A16代表任何胺基酸；A6、A9和A10獨立代表鹼性胺基酸或極性中性胺基酸；其中各所述胺基酸可以是L型、外消旋形式或D型，條件是所述肽不包括LAP且不包括LAP同源物，由於它們出現在其它種屬中，除非以分離和純化形式。
優選胺基酸A5、A7、A8、A11和A16獨立為中性、非芳族胺基酸，更優選為疏水性中性、非芳族胺基酸。
優選A1、A2和A3為中性，優選非芳族胺基酸，優選疏水性。
在其它方面，本發明涉及抑制IRES起動的翻譯和/或其它病毒功能的方法，這是通過將本發明的肽提供給無細胞系統或感染了利用IRES起動翻譯的病毒的活細胞。本發明還涉及使用發明的肽或者其藥學或獸醫學組合物抑制病毒複製和治療病毒感染的方法，且本發明也涉及這些藥學或獸醫學組合物。植物病毒感染也可用本發明的肽來抑制且這些肽和編碼它們的核苷酸序列因此也可用於農業和園藝學。這些肽可這樣提供或原位從核苷酸序列產生。
利用IRES介導的譯從而成為本發明肽合適靶子的病毒包括但不限於脊髓灰質炎病毒、鼻病毒、腦心肌炎病毒、口蹄疫病毒、C肝病毒(HCV)、經典的(classic)豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒、弗羅得鼠白血病病毒、莫洛尼鼠白血病病毒、羅斯肉瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV包括HIV-1和HIV-2)、Plautia stali腸病毒、Rhopalosiphum padi病毒、cricket麻痺病毒、Kaposi肉瘤-相關皰疹病毒、A肝病毒(HAV)、B肝病毒(HBV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、流感病毒HAV、艾可病毒、柯薩奇病毒、狗霍亂病毒、豬瘟病毒、豬水泡病毒、Pesti病毒和Poty病毒。
這些肽和編碼它們的多核苷酸可與其它抗病毒製劑組合提供。具體說本發明的肽或它們的編碼核苷酸序列與WO96/11211中所述I-RNA的組合是特別有用的。然而其它抗病毒製劑可和本發明的肽或與I-RNA組合的本發明的肽一起施用。
另一方面，本發明涉及能與本發明肽起特異性免疫反應的抗體。這些抗體包括它們的免疫反應片段，可用於純化本發明的抑制蛋白質和評估其在各種藥學、獸醫和農業組合物中的水平。
此外，本發明的肽具有優先與一些組織，具體的肝臟相結合的特性。因此，這些肽可作為其它化合物和組合物的特殊輸送系統，通過使本發明的肽與需要特殊輸送的物質相融合或結合。
實施本發明的模式本發明的肽具有上面列出的公式(1)，其中各胺基酸特徵如上所確定。如所指出的，位置1、2和3中3個胺基酸殘基之一可獨立存在或缺失。這些胺基酸最優選是疏水性的，但一般任何中性胺基酸可替代且這些位置的胺基酸對於活性確實不重要，因此可使用任何胺基酸。優選的是A1、A2和A3從該肽中缺失。
除了一個例外(A14在一些實施方案中出可是中性/極性的)，該肽需要在A4、A12和A17具有酸性胺基酸並在A13、A14、A15和A18具有芳族胺基酸。其餘位置不大關鍵。
常規胺基酸分類是根據它們的總體特性從而可進行保守替換而不改變分子的性質。最簡單的分類是酸性和鹼性胺基酸。酸性胺基酸在生理pH下具有負電荷且在天然產生的胺基酸中由穀氨酸(glu或E)和天冬氨酸(asp或D)為代表。
類似的，鹼性胺基酸在生理pH下其有正電荷且在天然產生的胺基酸中由賴氨酸(lys或K)、精氨酸(arg或R)或更小程度上的組氨酸(his或H)為代表。其餘胺基酸是中性的，但這些中性胺基酸可進一步分成亞類。具體講含芳族體系的胺基酸可置於「芳族」胺基酸分類中且在天然產生的胺基酸中由色氨酸(trp或W)、苯丙氨酸(phe或F)和酪氨酸(tyr或Y)為代表。
中性胺基酸的另一亞類是極性胺基酸，在天然胺基酸中由穀氨醯胺(gln或Q)和天冬醯胺(asn或N)為代表。有時絲氨酸(ser或S)和蘇氨酸(thr或T)由於存在OH也歸於此類中。
中性胺基酸的又一亞類是明顯為疏水性的胺基酸。在天然產生的胺基酸中，這些胺基酸包括纈氨酸(val或V)、亮氨酸(leu或L)、甲硫氨酸(met或M)和異亮氨酸(ile或I)。有時包括在此類中的有半胱氨酸(cys或C)和丙氨酸(ala或A)甚至甘氨酸(gly或G)。然而由於這些胺基酸的小尺寸，它們不象異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸歸類為疏水胺基酸。
唯一的剩餘基因-編碼胺基酸脯氨酸(pro或P)很難分類，但顯然是中性的。
因為本發明肽可以合成以及從核苷酸序列翻譯，沒有必要限制這些胺基酸殘基為由基因編碼的那些殘基。因此這些肽可包括非天然胺基酸如β-丙氨酸(β-ala)、3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(2，3-diap)、4-氨基丁酸(4-aba)、α-氨基異丁酸(aib)、肌氨酸(sar)、鳥氨酸(orn)、瓜氨酸(cit)、t-丁基丙氨酸(t-bua)和其它。這些胺基酸可它們的結構分類酸性或鹼性。中性形成的可分類為中性/極性或中性/疏水或中性/芳族。其它分類是中性/小胺基酸，其指含4個或更少碳的胺基酸。
另外，因為這些肽可合成產生，故天然肽聯接可由(電子)等排性(isosteric)聯接取代，如CH2H、CH2NS、CH2CH2、CH＝CH(順式和反式)、COCH2、CH(OH)CH2、CH2SO作為代表例子。用這些同位取代合成肽-類似分子的方法是本領域熟知的。
類似的，由於已有合成本發明化合物的合成方法，可採用天然產生和非天然產生的D型胺基酸以及它們的外消旋混合物。尤其優選的公式(1)化合物的實施方案包括所有殘基為D構型的胺基酸。這種化合物可耐受生物降解並因此特別有效。
公式(1)化合物所述的肽類明確排除了由La抗原結合區域(LAP)為代表的肽，這是本領域已知的。此肽在表1中標註為LAP公式。表1也列出排布了號碼的天然LAP的具體mutein。同樣也顯示了人LAP同源物中的LAP胺基酸序列。優選這些同源物也從權利要求的肽類中排除，除非這些肽以純化或分離形式提供或以獸醫、藥學或農業/園藝學組合物提供。
如本文所用，「分離的」指一種狀態，其中該「分離」物質取自其天然環境中。當分離時它可能是純化或不純化的，但至少與它天然相關的一些成分已被去除或被取代。
表1肽 序列LAP AALEAKICHQIEYYFGDF702 AALEAQICQQIEYYFGDF701 AALQAKICHQIQYYFGQF761 QQQEAKICHQIEYYFGDF762 QQQEQKQCHQIEYYFGDF703 AALEAKICHQIEQQQGDQ771 AALEAKICHQIEYYQGDQ772 AALEAKICHQIEQQFGDF631 AALEAKICHQIEYYFGDQ632 AALEAKICHQIEYYQGDF741 AALEAKICHQIEQYFGDF633 AALEAKICHQIEYQFGDF小鼠 ALEAKICHQIEYYFGDF牛 AALEAKICHQIEYYFGDF非洲爪蟾(XENOPUS)LDLDTKICEQIEYYFGDF大鼠 AALEAKICHQIEEYYFGDF線蟲(C.ELEGANS) DDADQRIIKQLEYYFGNI蚊子 VSKLEASTIRQUYYFGDA果蠅(DROSOPHLIA) QERAIIRQVEYYFGDF在公式(1)所述本發明化合物中，A4、A12和A17必須為酸性胺基酸。這些胺基酸的優選實施方案是天冬氨酸和穀氨酸；較佳的A4和A12為穀氨酸且A17為天冬氨酸。優選的是任選純化形式D或L存在於這些位置。
A13、A14、A15和A18必須為芳族胺基酸，除了A14可以是中性/極性。優選的芳族胺基酸為苯丙氨酸和酪氨酸。較佳的A13和A14為酪氨酸且A15和A18為苯丙氨酸。然而這些殘基可重排如A13和/或A14是苯丙氨酸且A15和/或A18是酪氨酸，或所有這些殘基可以是酪氨酸或所有都是苯丙氨酸。
公式(1)化合物中其餘胺基酸較上述胺基酸不太關鍵。然而具體說，A6和/或A9的殘基優選為鹼性胺基酸或中性極性胺基酸。中性極性胺基酸優選在A10，但也可替換為鹼性胺基酸。儘管不太優選，任何這些位置可由天冬醯胺取代。雖然在發明範圍內但甚至更不優選的是這些位置由甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸或絲氨酸取代。
A7和A3存在時優選疏水胺基酸，最優選的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸，最優選亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸。如果存在，A1和A2以及A5優選為疏水小胺基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸或甘氨酸，優選丙氨酸。A16優選甘氨酸，但也可是小胺基酸如丙氨酸或絲氨酸或蘇氨酸。A8優選半胱氨酸但也可替換為類似胺基酸，如絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
公式(1)化合物尤其優選的實施方案是肽702、肽761和肽633。
肽701也優選。
如上所述，本發明的肽可採用標準合成技術製備，液相或固相為基礎的技術是本領域熟知的，或者如果包括基因-編碼胺基酸的L-異構體，可重組獲得。重組產生這些肽可採用合成性多核苷酸，其可用購買儀器方便地合成。編碼區域可任選地添加能影響分泌的前導序列，隨後在宿主細胞中表達，為此目的或事先可操作性連接於能影響表達的控制序列或使用內源性控制序列。此肽可在多種細胞中產生，包括原核和真核細胞如酵母和哺乳動物細胞。如果需要，此肽可在動物或植物中轉基因產生。
產生本發明肽，可提供的形式為N-末端醯化例如乙醯化，和/或C-末端醯胺化如作為氨甲醯或作為通過羧酸殘基與烴基或二烴基胺反應獲得的醯胺。這種烴基或二烴基胺優選具有6個碳或更少碳。
除了衍生N或C末端或在此肽的側鏈上衍生其它反應基團，此肽本身的醯胺鍵可由(電子)等排物(isostere)如CH2NH或CH2O、CH2CO等替換。合成這種假-肽的方法也是本領域熟知的。
本發明的肽也可作為它們的藥學上可接受鹽提供或可脂化或糖基化。
本發明的肽包括其醯化和/或醯胺化形式，可製成藥學或獸醫學組合物用於抗病毒治療。這種肽的合適組合物可在雷明頓藥物科學(Remington’sPharmaceutical Sciences)，最新版，Mack出版公司，Easton，PA中找到，納入本文參考文獻。可將此化合物配製成用於口服、透皮、透黏膜或其它進入途徑或者可注射。標準的組合物是本領域已知的包括片劑、膠囊、溶液、粉末、糖漿、洗液等。這種製劑中包含的賦形劑可包括多種運載體，包括脂質體和表面活性劑。給予肽的合適製劑和途徑是普通開業醫師所知道的。一種具體的有利製劑包括特此肽與靶因子或某因子如tat蛋白質(該蛋白質能促進相偶聯的蛋白質進入細胞)相偶聯。劑量水平隨著患者的情況、病毒感染的嚴重性和主治醫師的判斷而變化。根據具體情況優化製劑和劑量在醫師或獸醫的普通技術範圍內。
在許多可能採用本發明肽的藥學/獸醫學組合物中，可含有各種以聚合物為基礎的緩-釋系統，此聚合物可以或不降解從而以規則速度釋放出活性成分或其它基質以提供此肽的恆定供應。
對於農業應用，採用的製劑應適於提供此肽給受影響或可能受影響的植物。這種組合物可包括土壤處理組合物、噴射或可採用對單株植物的更精確施用。
除了採用本發明化合物來治療動物或植物中的病毒感染外，這些肽可用於研究實驗室中病毒感染和複製的機制。因此，它們對病毒mRNA的各種修飾形式的效果，例如可在無細胞系統或細胞培養物中進行評估。在這些方面中使用這類肽的方法是熟知的。
在上面所有方面中，用於治療的製劑也可採用編碼核酸給藥，作為裸露DNA或包括在表達系統中給予。構建用於各種宿主細胞的表達系統是本領域熟知的；已開發了在表達中行使重要功能的適當啟動子、增強子、終止信號等，它們適用於各種哺乳動物細胞、鳥類細胞、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞等。啟動子可以是組成型或誘導型。因此，設計了表達系統用於待治療的對象。例如對於哺乳動物對象，適合的啟動子包括metalathionin啟動子、各種病毒衍生的啟動子如SV40啟動子等。該表達系統可包括對於哺乳動物對象給藥特別方便的病毒載體，。特別優選的實施方案包括病毒載體如腺病毒載體、或其他病毒載體如逆轉錄病毒載體，這些是本領域已知的。可使載體有條件地複製從而僅在感染病毒的細胞中載體自身複製並產生蛋白質。
可設計出在對病毒感染的反應中或在對其它外部化學或物理信號的反應中能複製和表達的載體。該載體也可含同源序列用於將適當的表達系統整合到宿主細胞基因組中或者可另外設計當細胞分裂時能複製和傳遞給子代細胞的載體入。許多合適的載體在本領域已知的，包括例如採用於轉導CD34(+)細胞的自身-失活慢病毒載體和腺病毒載體與野生型腺病毒的混合物。
如上所述，此肽可與其它抗病毒製劑組合給藥，包括PCT出版物WO96/11211的描述的I-RNA。「I-RNA」指任何能模擬本文所述內源性酵母抑制性RNA的抑制效應的核苷酸序列。許多包括這類模擬物的核苷酸序列描述於PCT出版物中。應該強調的是I-RNA抑制效應是該核苷酸序列本身的一種功能；因此I-RNA可作為RNA、DNA或替換核酸骨架(如本領域熟知的肽核酸)給藥。「I-RNA」因此包括與任何支持骨架偶聯的核苷酸序列。確實，形成該核苷酸序列的鹼基不需要是天然產生的A、T(U)、G、C，而且也可包括這些鹼基的能保持天然核苷酸必須的互補特性的修飾形式。
可製成本發明方法中所用的一些結合組合物以控制病毒感染。這些包括將本發明的肽和上述的I-RNA相結合。本發明肽的表達系統與I-RNA的組合，本發明肽或其表達系統與不同的抗病毒製劑如無環鳥苷、反義抗病毒序列或其表達系統、靶向病毒RNA或其表達系統的核酶、或任何其它抗病毒製劑或組合的抗病毒劑的組合。這些抗病毒製劑也可用於與I-RNA和本發明的肽組合。
另一方面，本發明涉及能與本發明肽發生特異免疫反應的抗體。如上所指出，這些抗體可用於評估製劑中該肽的濃度以及監測本發明肽給藥後的水平。如本文所定義，「抗體」或「免疫球蛋白」包括諸如Fab、Fab』等能保持完整抗體免疫特異性的片段，也包括這些抗體的重組形式，包括單鏈形式如Fv形式。產生針對本發明肽的抗體的方法是本領域熟知的；免疫特異性可通過與本發明蛋白質的結合試驗的結果來確定，與類似但不同的肽的結合試驗的結果相比較。10倍的結合差異，優選100倍，更優選1000倍的結合差異是這種特異性的指徵。
本發明的免疫特異性抗體可以是多克隆或單克隆抗體和重組的或免疫產生的抗體。它們可使用本領域熟知的方法修飾成為種屬-特異性。因此，如果需要，例如這些抗體可人源化。
可將上述本發明肽的特異性免疫球蛋白偶聯於固體支持物並用於純化本發明的肽。
雖然本發明的肽似乎能回到某些組織，具體是肝臟，但可通過將它們偶聯於其它蛋白質或對具體器官或組織有特異性的其它組合物而自身靶向到所需部位。因此，可將這些肽偶聯於能結合所需靶受體的配體或偶聯於能與細胞表面蛋白質或腫瘤相關抗原反應的化合物。
然而，由於本發明肽確實能回到肝臟組織，故它們自身可用作輸送系統以運輸其它化合物到這些部位。因此，發明的另一方面是採用本發明的肽作為其它化合物的輸送系統。
實施例以下實施例旨在闡明而不是限制本發明。
製備A製備試驗肽採用Stratagene的QuickChangeTM定點誘變試劑盒(#200518)，將胺基酸變化引入La的野生型cDNA克隆中(Dr.Jack Keene，Duke University，North Carolina友情提供)(Chambers，J.C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)822115-2119)。該重組蛋白質通過0.4mM IPTG誘導4小時在大腸桿菌(BL21(DE3)pLysS)中表達。用超聲波裂解細胞4℃離心裂解物(12,000Xg)30分鐘。上清液用硫酸鏈黴素(3％終濃度)處理並如上離心。以緩衝液A(25mM Tris pH8.0，100mM NaCl)4℃透析上清液過夜並隨後裝到緩衝液A平衡的DEAE Sephacel柱上。收集流穿液並用FPLC通過肝素瓊脂糖柱和0到1M NaCl梯度分離。合併含有純化La或La突變體的組分並以緩衝液A透析。
對於測試此肽進入細胞能力的實驗，用Molecular Probe的FluoReporter FITC蛋白質標記試劑盒(F-6434)根據廠商說明並作少量修改以FITC-標記這些肽。所有肽由Biosynthesis(http//www.biosyn.com)合成並純化至＞95％均一將這些。肽以5mg/ml溶解於100mM Tris-HCl，pH8.0中並用無核酸酶的水稀釋至1mg/ml，用於隨後的翻譯試驗。對於FITC-標記，將肽溶解在PBS，pH8.0中。
實施例1各種肽對體外翻譯的作用在這些實驗中，p2CAT(Coward，P.等，J.Virol(1992)66286-285)質粒DNA用BamHI線性化並用SP6 RNA聚合酶體外轉錄。轉錄的mRNA用酚氯仿抽提和乙醇沉澱來純化。將脊髓灰質炎病毒5』UTR的一個克隆，PV 5』UTR(Das，S.，等，J.Virol(1994)687200-7211)用HindIII線性化並用T7 RNA聚合酶在存在α-32PUTP(3000Ci/mmole)時轉錄。放射性同位素標記的RNA用Quick Spin RNA柱(Roche)純化。
將海拉細胞單層培養在添加了10％胚胎牛血清的基本必須培養基中。如上所述製備海拉細胞裂解物(Coward，等，同前；Rose，J.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)752732-2736)。用海拉細胞提取物體外翻譯p2CAT基本上如別處所述進行(Rose，等，同前)。當存在25μCi35S甲硫氨酸和40U RNAsin(Promega)時在25μl反應混合物中的80μg海拉細胞提取物中翻譯微克的體外轉錄的p2CATRNA。每次反應加入20、40和60μM濃度的肽。作為陰性對照，也測試了3μl稀釋(1∶5)的100mM Tris-HCl，pH8.0.。
表1顯示了這些肽的結果如下肽702在40和60μM濃度時有效抑制了CAT報導蛋白質的翻譯，其中A6的賴氨酸和A9的組氨酸被中性極性胺基酸穀氨醯胺取代；然而肽701在這些濃度時喪失抑制翻譯的能力，其中A4、A12和A17的酸性殘基都被中性極性胺基酸穀氨醯胺取代。
肽761其A1、A2和A3被極性中性胺基酸穀氨醯胺取代，在60μM時為抑制性，40μM時為輕度抑制性。然而除了在A1-A3取代外當A5的丙氨酸和A7的異亮氨酸由穀氨醯胺取代時，此肽失去抑制翻譯的能力。
在類似的實驗中，採用肽703、771和772，其位置A13或更遠位置的一個或多個芳族胺基酸由穀氨醯胺取代也失去抑制活性。在這些實施方案中，A13、A14、A15和A18的芳族殘基至少兩個這樣被取代。
如果僅進行一個取代，如肽631、632、741和633中那樣抑制翻譯的能力再次減小。然而，肽633和631在更高濃度水平仍能抑制；肽631在40和60μM濃度抑制時，肽633在60μM時能抑制。肽631中，僅A18由穀氨醯胺取代；肽633中僅A14這樣被取代。
因此，雖然A13、A14、A15和A18通常必須是芳族胺基酸殘基，包括在本發明範圍內的實施方案中A14或A18由中性胺基酸取代，優選不是小的中性胺基酸。
實施例2本身結合mRNA的能力對於此分析，將32P-標記的PV 5』UTR RNA(1×106cpm)探針與重組野生型La或其突變體30℃培養10分鐘。結合後，如(Banerjee，R.，等)描述反應完成「RNA病毒的體外複製」(In-vitro Replication of RNA Viruses)，第158-164頁，A.Cann(編輯)，RNA病毒一種實踐方法(2000)(RNA VirusesA PracticalApproach)Oxford University Press，New York。
將標記的PV 5』UTR RNA通過UV交聯於500ng、1μg或1.5μg野生型La抗原或兩種肽771或772。RNase消化後，將該蛋白質核苷酸複合物在SDS聚丙烯醯胺上分析。結果顯示對兩種肽的結合顯著降低。
在類似的實驗中，肽741獲得相似結果，其A13從酪氨酸變成穀氨醯胺。當A25從苯丙氨酸變成穀氨醯胺和當A24的酪氨酸變成穀氨醯胺時觀察到結合僅輕微降低。
實施例3細胞進入和保持對於這些實驗，使用FITC-標記的肽。肽標記見上面的製備a所述。標記後肽用Quick Spin RNA柱(Roche)純化。將載玻片室(slide chamber)中培育的海拉或Huh-7細胞用5μM的各種肽培養過夜。(肝細胞癌細胞(Huh-7)培育在添加10％胚胎牛血清的RPMI培養基(GIBCO/BRL))中。細胞膜隨後用1∶200稀釋的DiIC18(Molecular Probes)以1mg/ml工作濃度染色20分鐘然後用PBS洗3次。細胞用25μl Gelvatol分層並覆蓋蓋玻片。在Leitz共焦雷射掃描顯微鏡系統中用100X油浸鏡頭分析細胞。
一般，結果顯示肽進入和保持在細胞中的能力與它們抑制翻譯的活性相平行。各種測試肽的結果總結於表2。
表2

權利要求
1.一種以下公式的化合物A1n A2n A3n A4A5A6A7A8A9A10A11A12A13A14A15A16A17A18(1)及其醯化和/或醯胺化形式，其特徵在於，各個n獨立為0或1；A1、A2和A3各自獨立為任何胺基酸；A4、A12和A17獨立為酸性胺基酸；A13、A14、A15和A18獨立為芳族胺基酸；A5、A7、A8、A11和A16代表任何胺基酸；A6、A9和A10獨立代表鹼性胺基酸或極性中性胺基酸；其中各所述胺基酸可以是L型、外消旋形式或D型，條件是當所有胺基酸是L型時公式(1)的化合物不是AALEAKICHQIEYYFGDF；當所有胺基酸是L型且公式(1)是序列ALEAKICHQIEYYFGDF、AALEAKICHQIEYYFGDF、LDLDTKICEQIEYYFGDF、AALEAKICHQIEEYYFGDF、DDADQRIIKQLEYYF GNI、VSKLEASTIRQEYYFGDA或QERAIIRQVEYYFGDF時，公式(1)的化合物必須是分離形式。
2.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，其中所有胺基酸是基因編碼的。
3.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，其中所有Ai亞基之間的連接鍵是醯胺鍵。
4.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，其中所有Ai是D型。
5.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，其中所有Ai是L型。
6.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，其中各A4、A12和A17各自獨立為天冬氨酸或穀氨酸。
7.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，其中A13、A14、A15和A18各自獨立為苯丙氨酸或酪氨酸。
8.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，其中A8是半胱氨酸。
9.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，其中A6、A9和A10各自獨立為賴氨酸、組氨酸、精氨酸、穀氨醯胺或天冬醯胺。
10.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，所述化合物選自AALEAQICQQIEYYFGDF、AALQAKICHQIQYYFGQF、QQQEAKICHQIEYYF GDF和AALEAKICHQIEYQFGDF。
11.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，所述化合物為分離或純化形式並選自ALEAKICHQIEYYFGDF、AALEAKICHQIEYYFGDF、LDLDTKICEQIEYY FGDF、AALEAKICHQIEEYYFGDF、DDADQRIIKQLEYYFGNI、VSKLEASTIRQ EYYFGDA和QERAIIRQVEYYFGDF。
12.一種藥學、獸醫或農業/園藝學組合物，其特徵在於，所述組合物包括權利要求1所述的化合物和適當的賦形劑。
13.一種核酸分子，其特徵在於，所述核酸分子包括編碼權利要求2所述化合物的核苷酸序列。
14.一種重組表達系統，其特徵在於，所述表達系統包括包括編碼權利要求2所述化合物的核苷酸序列，該核苷酸序列操作性連接於有效控制其表達的序列。
15.一種重組宿主細胞，其特徵在於，所述細胞被修飾而含有權利要求14所述的表達系統。
16.如權利要求15所述的重組宿主細胞，其特徵在於，其中表達系統整合到所述宿主細胞基因組中。
17.一種產生權利要求2所述化合物的方法，其特徵在於，所述方法包括影響權利要求14所述表達系統表達所述化合物。
18.如權利要求14所述的表達系統，其特徵在於，所述表達系統包括在一病毒載體中。
19.如權利要求18所述的病毒載體，其特徵在於，所述載體是腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。
20.一種治療植物或動物對象中病毒感染的方法，其特徵在於，所述方法包括給予所述對象抗病毒有效量的權利要求1所述化合物。
21.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括給予至少一種其它的抗病毒製劑。
22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述化合物的施用和所述至少一種其它的抗病毒製劑的給藥基本上同時進行。
23.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，權利要求1所述化合物和所述至少一種抗病毒製劑的所述給藥是依次的。
24.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述其它的抗病毒化合物是I-RNA。
25.一種治療植物或動物對象中病毒感染的方法，其特徵在於，所述方法包括給予所述對象抗病毒有效量的編碼權利要求2化合物的核苷酸序列。
26.如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述核苷酸序列包含在與所述對象細胞相容的表達系統中。
27.如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括給予至少一種其它的抗病毒製劑。
28.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述化合物和所述至少一種其它的抗病毒製劑的給藥基本上同時進行。
29.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，權利要求1所述化合物和所述至少一種抗病毒化合物的所述給藥是依次的。
30.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述其它的抗病毒化合物是I-RNA。
31.一種選擇性輸送化合物給肝臟的方法，其特徵在於，所述方法包括給予對象肝臟偶聯於權利要求1所述化合物的所需化合物。
32.能與權利要求1所述化合物發生特異性免疫反應的抗體。
33.如權利要求32所述的抗體，其特徵在於，所述抗體是免疫特異性片斷。
34.如權利要求33所述的抗體，其特徵在於，所述抗體是單克隆抗體。
35.一種純化權利要求1所述化合物的方法，其特徵在於，所述方法包括使含所述化合物的樣品與對其有特異免疫反應的抗體相接觸，所述抗體偶聯於一固體支持物上。
全文摘要
描述了具有酸性和芳族胺基酸特定模式的肽，這些肽能抑制病毒感染。這些肽包含15－18個胺基酸並可與其它的抗病毒製劑組合和/或以編碼它們的核苷酸序列形式給藥。
文檔編號C12N15/09GK1636016SQ02812042
公開日2005年7月6日 申請日期2002年4月12日 優先權日2001年4月16日
發明者A·達斯谷普塔, S·達斯, N·拜德亞 申請人:加利福尼亞大學董事會