一種多模態超聲造影劑及其製備方法與流程

2023-06-23 19:02:02

本發明涉及藥學領域，具體涉及一種多模態超聲造影劑及其製備方法。
背景技術：
：自1968年Gramiak和Shah首次報導通過注射鹽水產生小氣泡使右心室顯影增強以來，相繼出現了各具特色的超聲造影劑。目前所用的超聲造影劑均為內含不同氣體成分的微氣泡，其外殼材料多數為表面活性劑類、人血蛋白質類、脂類等。隨著高分子化學的發展，國內外學者用高分子材料與空氣或其他難溶性氣體製備出微泡超聲造影劑，在微泡均勻度、體內穩定性、體內外存留時間、抗壓力性能、聲衰減等方面都有一定的進步。如專利號為CN201010505467.3的一種具有多功能性的新型超聲造影劑及其製備方法。為含殼核結構納米粒的脂質乳劑，殼膜材料由卵磷脂、膽固醇及磁性納米材料組成，中心包裹液態氟碳，磁性納米顆粒鑲嵌於殼膜上，為網狀內皮系統特異性對比劑，不僅能增強超聲顯像，而且還能夠增強CT及MRI顯像，具有廣闊的應用前景。又如專利號為CN201310341783.5的一種新型造影劑及其成像方法，包含具有大量金屬毫微粒的基質微粒。大量金屬毫微粒封裝在非蛋白質的生物相容或生物可降解的基質微粒中或附著於非蛋白質的生物相容或生物可降解的基質微粒，可以耦合到靶向分子用於定向顯像。可以看出，造影劑的性能得到極大發展，其顯像效果也有一定提升，但是，在實際使用中，為了使造影劑的穿透性增強，造影劑的粒度被逐漸縮小，繼而造成了散射減弱，固有穩定性降低，使用中局限較大，並且造影劑的功能單一，在多項檢測中使用不同的造影劑會對機體帶來一定的負擔。隨著材料技術的進一步發展，納米級別的貴重金屬在吸光優越性被充分發掘，液態氟碳的多功效顯像作用也逐漸凸顯，順磁物質的馳豫顯像也有更深的研究，本發明結合納米材料的性質，通過不同材料的結合，研究出一種多模態超聲造影劑及其製備方法。技術實現要素：本發明針對當前造影劑功能單一、顯像效果差等問題，提供一種多模態超聲造影劑。本發明還提供製備所述造影劑的方法。為了達到上述技術效果，本發明提供如下技術方案：一種多模態超聲造影劑，其特徵在於，造影劑由三部分組成：作為殼膜的介孔二氧化矽，與靶位連接的配體透明質酸，殼膜內含有金納米棒、順磁性物質、液態氟碳。所述介孔二氧化矽表面修飾有氨基。所述順磁性物質為鐵、釓、錳中的一種或幾種。所述的液態氟碳為全氟己烷、全氟戊烷中的一種或兩種。所述金納米棒的製備方法為：a、由NaBH4還原HAuCl4製得十六烷基三甲基溴化銨包覆的納米金種子，將0.05-0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化銨與5-12mmol/L的HAuCl4按體積比28-32:1混合，加水至總體積的1.2-1.3倍，然後將冰浴後的NaBH4水溶液(0.01mol/L)加到上述混合溶液中，加入量為原溶液體積的6-7％，形成納米金種子(在2～5h內使用)；b、將0.5-0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化銨、0.01-0.03mol/L的HAuCl4、8-12mmol/L的AgNO3、0.3-0.6mol/L的H2SO4以及0.1-0.3mol/L的抗壞血酸按體積比125-130:6-7:1:2.5:1製成金納米棒的生長液；c、將步驟a製得的納米金種子加入生長液中，加入量為生長液體積的1/500-1/400，保持在28-35℃恆溫狀態反應即得，將合成的金納米棒進行離心清洗(每管40mL，轉速9000-9600r/min，25-30min)後可得所需金納米棒。所述二氧化矽表面修飾氨基的製備方法為：在製成的二氧化矽材料溶液中，加入3-氨基丙基-三乙氧基矽烷體積濃度為10％的甲醇溶液，加入量為原溶液體積的0.3-0.5％，反應4-5h後離心處理，獲得紅色沉澱，將紅色沉澱置於原二氧化矽溶液體積相等甲醇溶液中(含體積分數為0.5-1.5％的HCL)回流加熱0.8-2h，然後用熱甲醇反覆清洗沉澱物，即可得到修飾氨基的二氧化矽材料。上述多模態成像功能的超聲造影劑，其製備方法為：(1)製備金納米棒；(2)將金納米棒中加水稀釋到其生長液體積的15-20％，在攪拌條件下0.1mol/L的NaOH溶液，加入量為加入其體積的8-13％，得到混合溶液，然後，將3份20％正矽酸四乙酯試劑(用甲醇稀釋)每隔25-35min加入，每份佔混合溶液體積的0.2-0.5％，加入時輕輕攪拌，在26～28℃下反應8-12h即得，到介孔二氧化矽包覆的金納米棒；(3)將包裹金納米棒的二氧化矽修飾氨基；(4)吸附順磁性物質，將步驟(3)所得的產物按質量體積比5:2-3加入順磁性物質氯化物溶液，攪拌反應30min，離心分離取沉澱，在沉澱中加入含有表面活性劑的水溶液，超聲使沉澱分散，採用透析法除去游離三氯化釓，凍幹，得以透明質酸修飾的羧基化短單壁碳納米管為載體的釓類造影劑冰浴條件下應用超聲處理20-30min，離心濃縮即可；(5)吸附液態氟碳及透明質酸堵孔：a、取液態氟碳、雙蒸水、二氯甲烷按體積比1:1:15混合，按質量體積比8-12：5加入步驟(4)所得的產物，冰鹽水浴，聲振100-120W，0.5-2min備用；b、取a中步驟(4)所得的產物質量1.5-2倍的透明質酸在水中分散、過夜使之完全水合，隨後在含有EDC(2-3mg/mL)和NHS(1-3mg/mL)的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩衝液(pH＝6.0)中活化羧基，反應8min後，將溶液pH值調至8-8.5；c、在a溶液中混合步驟b所得的溶液，加入3-6％的聚乙烯醇，持續攪拌20h後通過離心分離，即得到所述多功能造影劑。本發明的有益效果：本發明發明造影劑生物相容性好，不會引起機體免疫反應，靶向功能精準，通過使用二氧化矽包裹金納米棒，增加液態氟碳和順磁性物質的吸附量，提高材料的聲阻抗特性，還增強了造影劑的機械強度，使其在多重環境中性質穩定，而且提高了材料的分散性和超聲性能，可以增強超聲顯像，並且，光吸收率高，增強光的散射，增強電磁場，在光聲、超聲、磁共振顯像上有良好的增強作用。附圖說明圖1是對造影劑透射電鏡觀察圖。圖2是造影后24h大鼠肝實質的影像密度圖。具體實施方式實施例1一種多模態超聲造影劑及其製備方法：(1)將7.5mL0.1mol/L的十六烷基三甲基溴化銨與250μL10mmol/LHAuCl4混合，加水至總體積為9.4mL。然後將0.6mL冰浴後的NaBH4水溶液(0.01mol/L)加到上述混合溶液中形成納米金種子(在2～5h內使用)。用100mL0.1mol/L十六烷基三甲基溴化銨，5mL0.01mol/LHAuCl4，0.8mL10mmol/LAgNO3，2mL0.5mol/LH2SO4以及800μL0.1mol/L抗壞血酸製成金納米棒的生長液。加入240μL上述納米金種子後開始反應，實驗過程保持在30℃恆溫狀態，將合成的金納米棒進行離心清洗(每管40mL，轉速9500r/min，25min)後，沉澱物極為金納米棒。(2)將(1)製得的金納米棒中加水稀釋到20mL。在攪拌條件下加入200μL0.1mol/LNaOH溶液，隨後，將3份60μL20％TEOS試劑(用甲醇稀釋)每隔30min加入，加入時輕輕攪拌，在26～28℃下反應10h，即得到介孔二氧化矽包覆的金納米棒；(3)在上述反應完成後加入含10μL3-氨基丙基-三乙氧基矽烷的甲醇溶液100μL，反應5h後離心處理，獲得紅色沉澱。將紅色沉澱置於20mL甲醇溶液中(含0.2mL的HCL)回流加熱1h，即可得到產物修飾氨基的納米粒子；(4)納米粒子吸附及透明質酸封孔a、取200ul液態氟碳、200ul雙蒸水，加入3ml二氯甲烷和30ml順磁性物質的氯化物的飽和溶液至溶解，加入4mg修飾氨基的納米粒子，冰鹽水浴，聲振100-120W，0.5-2min，攪拌20-24小時，通過離心、除去有機溶劑可得吸附液態氟碳、順磁性性物質的納米球；b、取6mg透明質酸在水中分散、過夜使之完全水合，隨後在含有EDC(2mg/mL)和NHS(2mg/mL)的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩衝液(pH＝6.0)中活化羧基，反應90min後，將溶液pH值調至8.3，加入5％的聚乙烯醇，再加入a中製備的產物，持續攪拌18-20h後通過離心分離，即得到所述多功能造影劑。實施例2一種多模態超聲造影劑及其製備方法：(1)將7.3mL0.05mol/L的十六烷基三甲基溴化銨與260μL8mmol/LHAuCl4混合，加水至總體積為9.8mL。然後將0.7mL冰浴後的NaBH4水溶液(0.01mol/L)加到上述混合溶液中形成納米金種子(在2～5h內使用)，用98mL0.1mol/L十六烷基三甲基溴化銨，6mL0.01mol/LHAuCl4，0.8mL10mmol/LAgNO3，2mL0.5mol/LH2SO4以及800μL0.1mol/L抗壞血酸製成金納米棒的生長液，加入240μL上述納米金種子後開始反應，實驗過程保持在30℃恆溫狀態，將合成的金納米棒進行離心清洗(每管40mL，轉速9500r/min，25min)後，沉澱物極為金納米棒；(2)將(1)製得的金納米棒中加水稀釋到18mL，在攪拌條件下加入195μL0.15mol/LNaOH溶液，隨後，將3份55μL20％TEOS試劑(用甲醇稀釋)每隔25min加入，加入時輕輕攪拌，在28℃下反應10h，即得到介孔二氧化矽包覆的金納米棒；(3)在上述反應完成後加入含9.5μL3-氨基丙基-三乙氧基矽烷的甲醇溶液95μL，反應4h後離心處理，獲得紅色沉澱。將紅色沉澱置於20mL甲醇溶液中(含0.4mL的HCL)回流加熱2h，即可得到產物修飾氨基的納米粒子；(4)納米粒子吸附及透明質酸封孔a、取190ul液態氟碳、190ul雙蒸水，加入3ml二氯甲烷和28ml順磁性物質的氯化物的飽和溶液至溶解，加入4mg修飾氨基的納米粒子，冰鹽水浴，聲振100-120W，0.5-2min，攪拌20-24小時，通過離心、除去有機溶劑可得吸附液態氟碳、順磁性性物質的納米球；b、取5mg透明質酸在水中分散、過夜使之完全水合，隨後在含有EDC(2mg/mL)和NHS(2mg/mL)的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩衝液(pH＝6.0)中活化羧基，反應90min後，將溶液pH值調至8.3，加入4％的聚乙烯醇，再加入a中製備的產物，持續攪拌19h後通過離心分離，即得到所述多功能造影劑。實施例3一種多模態超聲造影劑及其製備方法：(1)將8mL0.05mol/L的十六烷基三甲基溴化銨與260μL8mmol/LHAuCl4混合，加水至總體積為9.8mL。然後將0.7mL冰浴後的NaBH4水溶液(0.01mol/L)加到上述混合溶液中形成納米金種子(在2～5h內使用)，用98mL0.1mol/L十六烷基三甲基溴化銨，6mL0.01mol/LHAuCl4，0.8mL10mmol/LAgNO3，2mL0.5mol/LH2SO4以及800μL0.1mol/L抗壞血酸製成金納米棒的生長液，加入240μL上述納米金種子後開始反應，實驗過程保持在30℃恆溫狀態，將合成的金納米棒進行離心清洗(每管40mL，轉速9500r/min，25min)後，沉澱物極為金納米棒；(2)將(1)製得的金納米棒中加水稀釋到18mL，在攪拌條件下加入195μL0.15mol/LNaOH溶液，隨後，將3份55μL20％TEOS試劑(用甲醇稀釋)每隔25min加入，加入時輕輕攪拌，在28℃下反應10h，即得到介孔二氧化矽包覆的金納米棒；(3)在上述反應完成後加入含9.5μL3-氨基丙基-三乙氧基矽烷的甲醇溶液95μL，反應4h後離心處理，獲得紅色沉澱。將紅色沉澱置於20mL甲醇溶液中(含0.4mL的HCL)回流加熱2h，即可得到產物修飾氨基的納米粒子；(4)納米粒子吸附及透明質酸封孔a、取190ul液態氟碳、190ul雙蒸水，加入3ml二氯甲烷和28ml順磁性物質的氯化物的飽和溶液至溶解，加入4mg修飾氨基的納米粒子，冰鹽水浴，聲振100-120W，0.5-2min，攪拌20-24小時，通過離心、除去有機溶劑可得吸附液態氟碳、順磁性性物質的納米球；b、取5mg透明質酸在水中分散、過夜使之完全水合，隨後在含有EDC(2mg/mL)和NHS(2mg/mL)的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩衝液(pH＝6.0)中活化羧基，反應90min後，將溶液pH值調至8.3，加入4％的聚乙烯醇，再加入a中製備的產物，持續攪拌19h後通過離心分離，即得到所述多功能造影劑。試驗例1將本發明製作的造影劑進行理化性質的檢測。(1)在血球計數板上，用計數公式計算乳液中的納米粒濃度，用pH計檢測其pH值；(2)用掃描電鏡對本發明造影劑進行形態學觀察；(3)採用透射電鏡觀察本發明造影劑的結構；(4)用雷射測徑儀檢測造影劑的粒徑。檢測結果；通過血球計數板計算乳液中納米粒的濃度為3.586×1015個/ml，pH值為7.09，通過掃描電鏡對納米粒的形態學觀察：本發明呈球形，形狀均勻，分散度好；如下圖1，透射電鏡觀察本發明造影劑呈球形，構型緊湊，其粒徑大小為(265.1±85.36)nm。試驗例2本發明造影劑與常用超聲造影劑「聲諾維」的對比選BALB/c裸鼠18隻，3-6周齡，體重(21.3±2.4)g，用RPMI-1640不完全培養液稀釋SKOV3細胞，調整細胞濃度為2×107個/ml，用1ml注射器在裸鼠背部皮下注射200ul細胞懸液，形成皮丘。繼續飼養2-2周後，如果目測背部可見1-2cm包塊，超聲下測量腫瘤大小範圍1-2cm，即可判斷荷瘤成模。選取建模成功的裸鼠，隨機分為兩組，聲諾維組和本發明造影劑組。每隻動物注射體積為0.2ml，聲諾維組按說明書使用，本發明造影劑組所用造影劑濃度為3.53×1015個/ml。對比兩組造影劑的增強時間和增強強度。試驗結果如下：本發明超聲造影劑組聲諾維組開始增強時間(秒)6-125-11峰值強度+++++峰值出現時間(秒)15-4210-33增強持續時間(分)3-152-10平均增強強度2612由以上試驗看出，本發明超聲造影劑的穩定時間和循環半衰期得到明顯延長，確保了使用效果。實施例3本發明多模態超聲造影劑的體內CT顯影實驗實驗動物準備同實施例2。使用GELightSpeed16排螺旋CT機，分別於造影前及造影后24h採集大鼠腫瘤CT圖像。CT掃描條件：管電壓100kV，管電流170mA，層厚5mm。結果顯示造影后24h大鼠肝實質的影像密度明顯增加，見圖2。表明該多功能超聲造影劑能夠增強CT顯像。不同於傳統CT碘造影劑，體內清除快，本發明所述的造影劑體內穩定性高，循環時間長，24h後仍可見增強，有利於病變的動態監測。實施例4本發明多模態超聲造影劑的體內光聲顯影實驗試驗動物如實施例2，使用本發明造影劑在注射前後觀察腫瘤基波和諧波表現。於注射造影劑後20min採用雷射輻射腫瘤，輻射後立即觀察雷射輻射區域超聲基波及諧波顯像情況，機械指數為0.2。試驗結果注射本發明造影劑後，基波和諧波下超聲表現和注射造影劑前無明顯改變。採用雷射輻射(200mj，1min)後，基波下可見輻照區回聲明顯增強，在諧波模式下，輻射區域增強極為明顯。在此有必要指出的是，以上實施例僅限於對本發明的技術方案做進一步的闡述和說明，並不是對本發明的技術方案的進一步限制。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp