黃連素在治療或預防流感病毒藥物中的應用的製作方法

2023-06-23 10:26:16 1

專利名稱：：黃連素在治療或預防流感病毒藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥
技術領域：
，更具體涉及黃連素在治療或預防流感病毒藥物中的應用。
背景技術：
：流感病毒是引起流行性感冒的病原，分為甲(influenzaAvirus)、乙(influenzaBvirus)、丙(influenzaCvirus)三型，其中以甲型流感對人類威脅最大。人流感病毒主要是HI、H2和H3亞型，而目前危害嚴重的高致病性禽流感病毒多為H5、H7和H9亞型，即H5m、H7N7、H9N2等，其中以H5m亞型病死率高。因此本發明主要以H5m、H3N2兩種A型流感病毒為研究對象對黃連素的抗病毒活性進行了探討。流感病毒屬正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，具有包膜的8個片段，共編碼11種蛋白質的單鏈負RNA病毒。與其他RNA病毒不同的是，流感病毒所有RNA(mRNA.cRNA.vRNA)的合成均在被感染細胞的核內完成。mRNA在核內合成後轉移到胞漿，合成病毒的結構和非結構蛋白；而後開始裝配流感病毒，完成後以出芽方式釋放出子代病毒顆粒，進一步侵入新的宿主細胞。在流感病毒的各個基因中，NP基因最為保守。NP具有型特異性，還是一種多功能蛋白質，除了形成病毒的核衣殼外，還可通過RNP來穩定vRNA，使之免受RNA酶作用。多年來研究認為，PBl是病毒RNA聚合酶的催化亞基，負責病毒RNA的複製以及轉錄；PB2是負責以一種稱為「Snatch」的方式奪取宿主mRNA的CAP帽子結構用於病毒mRNA轉錄。流感病毒能否在人體細胞內進行有效的複製，主要與病毒複製酶(PB1、PB2和PA)基因有關。目前，流感仍屬未能有效控制的急性上呼吸道傳染病。由於流感病毒的抗原變異能力強，加之個體免疫力的不同，疫苗的保護率並不高，且疫苗只對已知的流感病毒亞型有預防作用，而對於由抗原性漂移或抗原性轉換所產生的新型流感病毒無效。當前FDA批准用於防治流感的藥物有金剛烷胺(Amantadine)、金剛乙胺(Rimantadine)和扎那米韋(Zanamivir)，但分別存在易引起流感病毒耐藥株的出現和服用不方便的問題。中醫藥治療藥物包括清開靈口服液、雙黃連注射液、藿香正氣丸、參脈注射液等清熱解毒、增強人體免疫力的中成藥，這些藥物具有綜合療效好、毒副作用低等優勢。因此，抗流感病毒藥物的研究方興未艾。中草藥是天然寶庫，以其內在科學性和實踐的有效性，正日益受到世界各國醫藥學工作者的關注。中藥不僅具有耐藥性低、副作用和不良反應少等優點，而且還有抑制病毒複製、調節免疫功能、改善血液循環、解熱鎮痛、及抗菌消炎等綜合功效，其在防治流感病毒方面具有獨特的優勢和廣闊的發展前景。因此，近年來，國內外均開展了抗流感病毒中草藥的研究，取得了較好的結果。黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y.ChengetHsiao或雲連CoptisteetaWall.的乾燥根莖。具有清熱燥溼，瀉火解毒等功效。用於溼熱痞滿、嘔吐吞酸、瀉痢、黃疸、高熱神昏、心火亢盛、心煩不寐、血熱吐衄、目赤、牙痛、消渴、癰腫疔瘡；外治溼疹、溼瘡、耳道流膿。黃連素是一種重要的生物鹼，是我國應用很久的中藥。可從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取。它具有顯著的抑菌作用。近期文獻報導生物鹼類化合物具有抗流感病毒的功效，黃連素為黃連的主要有效成分，目前還未有其抗流感病毒作用的報導，因此本發明首次發現了黃連素具有良好的抗流感病毒活性，表明其具有很好的開發利用前景。
發明內容本發明的目的在於提供黃連素在治療或預防流感病毒藥物中的應用，從而為臨床上流感病毒性疾病的治療提供一種安全有效毒副作用小的天然藥物。為了實現上述任務，本發明採用以下技術方案黃連素在細胞和分子水平上對流感病毒的抑制作用，表明該藥物具有開發成抗流感病毒的有效藥物而應用於臨床。通過血凝效價試驗(HA)與Real-Time螢光定量PCR試驗，對前期篩選的有效藥物的給藥劑量及有效性做出分析。同時採用體外細胞模型——MDCK細胞，從直接殺病毒、抑制病毒的吸附與入侵、抑制病毒的複製、影響病毒出膜等方面研究藥物的抗病毒機制。研究結果表明黃連素在細胞水平上對流感病毒具有良好的抗病毒作用，表明該藥物可以作為臨床上潛在的抗病毒藥物進一步開發。本發明公開了一種黃連素在作為製備治療或預防流感病毒藥物中的應用，從細胞和分子層面對黃連素抗流感病毒作用進行了評價，為其進一步開發應用奠定了良好的基石出。由於黃連素具有一定的抗感染和炎症作用，同時在臨床上用於腸炎性疾病有很好的應用基礎，而病毒所引起的傳染性疾病發生過程中常伴隨有炎症反應，故該藥物在治療病毒性疾病的同時對病毒所引起的炎症等症狀均有較好的緩解和輔助治療作用。目前黃連素在臨床上主要以片劑用於腸炎性疾病，結合現代常用藥物製劑手段，可將其製成薄膜包衣片、膠囊劑、顆粒劑、分散劑，口服。在治療流感病毒感染及其併發症的藥物中可加入該藥成分或在治療過程中聯合用藥使用該藥。相對於目前的其他抗流感病毒藥物而言，本發明與現有技術相比具有以下優點和效果1、該藥物是一種純天然藥物，具有毒副作用小等優點。2、對甲、乙、丙型流感病毒均有效。3、既有治療作用，也有預防作用。4、可口服給藥，使用方便。5、為非核苷類化合物，兼有抗炎作用，故能提高治療過程中的耐受性，提高治療質量和給藥依從性，減輕治療痛苦。A、黃連素的獲得黃連素(化學名為鹽酸小檗鹼，C20H18ClNO4.2H20)，主要從毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y.ChengetHsiao或雲連CoptisteetaWall.的乾燥根莖中中分離獲得，採用《中藥植物化學》中生物鹼的提取分離純化手段和技術路線，其純度經HPLC檢測有98%以上。B、黃連素的功效研究簡述黃連素主要來源於藥用植物黃連，該植物是傳統中醫藥中一味很重要的清熱解毒良藥。黃連素在臨床中一直作為非處方藥用於治療腹瀉，但是現代藥理學研究證實黃連素具有顯著的抗心力衰竭、抗心律失常、降低膽固醇、抑制血管平滑肌增殖、改善胰島素抵抗、抗血小板、抗炎等作用，因而在心血管系統和神經系統疾病方面將可能有廣泛、重要的應用前景，日益受到重視。黃連素是一種重要的生物鹼，是我國應用很久的中藥。可從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取。它具有顯著的抑菌作用，常用來治療細菌性胃腸炎、痢疾等消化道疾病。臨床主要用於治療細菌性痢疾和腸胃炎，它無抗藥性和副作用。而關於其在流感病毒性疾病治療方面還未見報導和應用。故本發明是對其新藥用價值的發現，對流感病毒性疾病的治療提供了一種新的有效藥物。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果1、黃連素在較大濃度範圍內沒有細胞毒性。採用H5m來感染MDCK細胞或者A549等流感病毒易感染細胞，在病毒細胞進入細胞體內後，加入不同濃度的黃連素，檢查黃連素加入前後感染流感病毒細胞的OD值，計算細胞的存活率，表1黃連素對MDCK細胞毒性試驗結果濃度OD570(mean±SD)500ug/ml0.891±0.013100ug/ml0.974±0.03620ug/ml0.891±0.0344ug/ml0·859±0.0550.8ug/ml0.986±0.0510.16ug/ml0.814±0.038normal0.76233±0.063由表1可以看出黃連素在比較大的濃度範圍內對細胞沒有毒性，表明藥物的安全性較好。2、黃連素能夠提高細胞對病毒感染的預防作用採用血凝效價實驗(HA)檢測藥物對病毒的抑制率和藥物的作用模式，進行藥物的作用機制初步探討，從藥物對病毒的吸附和入侵、病毒在細胞體內的複製、藥物對病毒的殺傷作用、藥物影響細胞抗流感病毒感染等角度進行了作用特點的初步探討表2不同給藥方式對流感病毒複製的影響tableseeoriginaldocumentpage6結果顯示黃連素和病毒共同孵育之後加入到細胞之中的抑制病毒作用效果與病毒感染細胞後再加入藥物的作用結果類似，表明黃連素不能直接殺傷病毒，但是能夠抑制病毒的複製。藥物加入到細胞之後再將病毒加入到細胞之中的實驗結果顯示其抑制病毒的作用效果與其他給藥方式也沒有明顯差異性，說明藥物能夠提高細胞對病毒的抵抗作用，但是並不能阻止病毒的入侵。3、黃連素能夠抑制病毒感染所導致的炎症反應採用PGE2檢測試劑盒，分別在36、48h時收集病毒感染後的A549細胞上清液，按照試劑盒測定方法測定細胞上清中的PGE2含量。表3藥物對流感病毒感染A549細胞上清液中PGE2的影響tableseeoriginaldocumentpage6結果顯示病毒感染細胞48小時後炎症反應比較明顯，黃連素在使用48小時後明顯降低PGE2的含量，表明藥物能夠較低病毒感染過程中所導致的炎症反應，起到保護機體的功能。圖1藥物細胞毒性試驗，不同濃度藥物加入到細胞中培養24h後，採用MTT觀察藥物對細胞生長的影響。圖2黃連素在100μg/ml濃度時加入到MDCK細胞中培養24h後，電子顯微鏡下觀察細胞形態的變化。A沒有藥物處理組；B加入黃連素處理組。圖3不同濃度藥物加入到病毒感染細胞之後培養48h時，採用MTT測定細胞存活率情況。圖4血凝效價試驗(48h)不同濃度藥物對病毒增殖的抑制作用。圖5不同的藥物加入到感染病毒的MDCK細胞中，通過HA試驗來檢測不同時間點細胞上清中的病毒滴度。圖6採用噬斑法(plaquereduceassay)的方法檢測黃連素對流感病毒的抑制作用。(狗腎傳代單層細胞感染A型流感病毒，經過1小時吸附，除去細胞上清液，並加入2ml含藥培養基(藥物濃度為lOOug/ml)，培養24小時後，取細胞上清液，收集150ul細胞上清液加入到另一長滿單層MDCK細胞的6孔板中，在37°C作用1小時後，然後在感染的細胞中覆蓋含0.5%瓊脂的固體培養基。孵化後3天在37°C，10%福馬林膜固定，染色，結晶紫染色。藍染色表明細胞沒有受到病毒影響；未染色而出現空斑的結果表明細胞受到流感病毒的侵蝕。圖7.加入不同藥物的感染H5W的MDCK細胞，進行免疫螢光試驗。A.未感染病毒的陰性對照；B.感染病毒的細胞對照；C.為感染病毒後加入黃連素的實驗組；D.為感染病毒後加入金剛烷胺的實驗組。圖8採用real-timePCR檢測藥物對流感病毒複製過程病毒載量的影響。A.NP特異性片段mRNA(*p<0.05；**p<0.01)；B.NP特異性片段cRNA(*p<0.05；**p)；C.NP特異性片段vRNA(*p<0.05；**p<0.01)。圖9.1不同給藥方式時藥物對流感病毒的抑制作用。在藥物作用24小時收集細胞上清液，採用HA檢測病毒滴度。數據為平均值士標準差(每個濃度3個平行)。與模型組比較，*p<0.05(病毒滴度的差異超過2倍可視為有顯著性差異)，結果藥物並不能影響病毒的吸附與入侵。圖9.2不同給藥方式時藥物對流感病毒的抑制作用。在藥物作用36小時收集細胞上清液，採用HA檢測病毒滴度。數據為平均值士標準差(每個濃度3個平行)。與模型組比較，*p<0.05(病毒滴度的差異超過2倍可視為有顯著性差異)，結果藥物並不能影響病毒的吸附與入侵。圖9.3不同給藥方式時藥物對流感病毒的抑制作用。在藥物作用48小時後收集細胞上清液，採用HA檢測病毒滴度。數據為平均值士標準差(每個濃度3個平行)。與模型組比較，*p<0.05(病毒滴度的差異超過2倍可視為有顯著性差異)，結果藥物並不能影響病毒的吸附與入侵。圖10.1哺乳動物雙雜交試驗檢測測定NP和黃連素之間的相互作用實驗。在HeLa細胞中，分別轉染報告質粒pG5Luc和測試質粒pvP16核蛋白(NP)攜帶NP基因，然後在6h後分別添加藥物。NP和藥物相互作用的螢光素酶活性測定。質粒pVP16(VP16)為陰性對照和本底控制對照。數據為平均值士標準差(3個平行樣)。與陽性對照比較，*p<0.05；**p<0.01表示有顯著性差異。圖10.2哺乳動物雙雜交試驗檢測黃連素是否抑制NP與NP之間的相互作用。圖10.3動物雙雜交試驗檢測黃連素素是否抑制NP、PB2蛋白間的相互作用圖10.4乳動物雙雜交試驗檢測黃連圖11為一種族什圖是否抑制NP、PBl蛋白間的相互作用圖12為工藝流程圖。具體實施例方式一種黃連素在治療或預防流感病毒藥物中的應用，其應用過程是目前常採用的四甲基偶氮唑鹽(MTT)法，檢測藥物對流感病毒感染後MDCK細胞存活率的差異性進行藥物篩選。另外也有一些針對流感病毒複製的關鍵酶進行的藥物體外篩選，但是相比而言，採用細胞培養篩選的方法會更簡單，並可以系統探討藥物的有效濃度和治療指數，為後期機理研究提供更多基礎。工藝流程圖請見圖12。實施例1黃連素抗流感病毒活性的評價1、材料細胞、病毒和質粒MDCK細胞由中國科學院山東醫學微生物研究所提供，A549細胞、HeLa細胞、病毒H5m或H3N2購於中國典型微生物保藏中心；pVP-16-NP、pM-PBUpM_PB2、pVP_16_NP、pG5Luc質粒由武漢大學病毒學國家重點實驗室醫學病毒學研究課題組吳建國教授指導完成，pG5Luc為帶有綠色螢光GFP的報告基因載體，質粒pVP_16_NP、pM-PBUpM_PB2、pVP-16-NP分別是流感病毒的不同蛋白連接到載體pVP和pM上，相關詳細信息可見本實驗室已經發表的論文——Mukhtar，Μ.M.，Li，S.，Li，W.，Wan,Τ.，Mu,Y.，Wei，W.，Kang,L.,Rasool,S.Τ.,Xiao,Y.,Zhu,Y.,andWu,J.(2009).Single-chainintracellularantibodiesinhibitinfluenzavirusreplicationbydisruptinginteractionofproteinsinvolvedinviralreplicationandtranscription.IntJBiochemCellBiol41(3)，554-60.)2、工具酶LA-taq,LC_taq，M-MLVReverseTranscriptase,M-MLVRT5XBuffer,RNAexhibit購自寶生物(TaKara)公司；3、其他試劑DMEM粉劑購自Gibco公司；Sofast轉染試劑，購自上海太陽馬公司；測螢光儀^=TurnerBioSystemsTD-20/20-HiSi十(TurnerDesigns,Sunnyvale,CA)；TRIzol試劑購自Gibco公司；黃連素(Berberine)均為自製，HPLC檢測純度為98%以上。藥物毒性檢測試驗首先對不同藥物濃度對MDCK細胞毒性進行了評價。1、消化T25瓶中MDCK細胞，加適量細胞培養基，吹打細胞10_15次。2、將細胞鋪到96孔板中，放置於培養箱中，培養24h待用。3、將培養的MDCK細胞取出，倒去原有培養液，換用2%FBS的維持培養基稀釋的梯度藥物，培養24h待用。4、然後加入不同濃度的藥物，繼續培養48h後，棄培養液上清，於培養板加入5mg/mLMTT液50μL/孔(以不含血清的DMEM培養基配製成)，置C02培養箱中繼續培養。5、培養2_3h後，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMS0乙醇體積比為11)100μL，振蕩5-10分鐘。6、待結晶完全溶解，置酶標測定儀上，測定570nm(490nm)波長處的光密度OD值。formulaseeoriginaldocumentpage97、找出藥物對細胞的最大無毒濃度範圍。結果顯示藥物在0.16ug/ml——500ug/ml的範圍對該細胞沒有明顯細胞毒性(圖1.)，在顯微鏡下觀察細胞也沒有病變發生(圖2.)，因此說明藥物有比較安全的適用範圍。黃連素抗H5W病毒的篩選試驗A、HA檢測藥物是否具有抗流感病毒作用1、用胰酶將生長良好的MDCK細胞分散成單個細胞懸液，按1X105/mL濃度分加於48孔板，每孔0.2mL。2、置37°C、5%C02培養箱中培養24h。將培養的MDCK細胞取出，倒去原有培養液，換上無血清無抗性的培養基，加1M.0.I的病毒液，於37°C孵育1-2小時。3、倒出病毒液，換用換用2%FBS的維持培養基稀釋的梯度藥物。設空白對照、陽性對照、陰性對照。實驗組藥物有六個梯度。4、置37°C、5%CO2孵箱中培養，36h後收集各實驗孔病毒上清進行血凝實驗。5、選用96孔血凝實驗板，除第一孔外，每孔加入75μL的PBS。6、第一孔加入75μL待測病毒懸液，然後等比稀釋，至第12孔時棄去75μL。7、每孔加入雞紅細胞懸液75μL，輕彈實驗板，使紅細胞與病毒充分混合，室溫(20-25°C以下相同)靜置30min、45min、60min時，觀察血凝現象並記錄結果。8、以靜置45min時的血凝現象為最終結果。以出現「++」(即紅細胞在孔底形成一個環狀，四周有小凝集塊)的流感病毒最高稀釋度為血凝終點，該稀釋度的倒數即為流感病毒的血凝滴度。實驗同時設生理鹽水對照(排除血細胞自身的非特異性凝集)和病毒對照。9、處理試驗數據，得出試驗組各藥物抗病毒的最佳濃度。10、按上述試驗結果，取各藥物抗病毒的最佳濃度進行試驗。11、重複上述1-9的步驟，此時，只加入抗病毒藥物的最佳濃度(無需做梯度試驗)，分別於24h、36h、48h取上清做病毒的時間相關性試驗。在上述基礎上，考察了不同劑量的給藥是否對流感病毒表現出不同的作用，結果顯示黃連素作用於流感病毒時也沒有明顯的劑量依耐性關係(圖3.)，可能原因是藥物使用安全濃度範圍內，藥物已經在較低劑量時已經達到了較好的抑制病毒複製作用，而隨著藥物濃度的增加，其作用效果並不會發生明顯變化，也提示該藥物在治療時劑量可以適當調整。同時檢測了藥物處理病毒感染後的細胞上清液中的病毒滴度，結果同樣表明不同藥物的作用效果比較近似(圖4)，雖然沒有劑量依賴性關係，但也說明藥物的細胞毒性較低，藥物能夠在較低濃度和較大濃度範圍內發揮抗病毒作用。根據上述實驗結果，選用黃連素和金剛烷胺的細胞給藥濃度均為lOOug/ml，探討了不同作用時間後病毒感染細胞上清液中病毒滴度，以病毒稀釋倍數來計數，結果圖5所示，不同作用時間點實驗結果顯示病毒滴度隨著病毒感染時間的延長不斷增加，在48h達到最高值，而黃連素和陽性對照藥物金剛烷胺在24h時就表現出良好的抑制病毒效果，隨著作用時間的延長，其抑制病毒的作用也在增強，表明藥物能夠抑制病毒的複製，並能維持作用時間。B、噬斑法檢測黃連素是否具有抗流感病毒的作用實驗過程病毒感染細胞Ih後，然後分別加入不同藥物，在藥物作用24h後，分別收集細胞上清液150ul，加入到已經長滿單層細胞的六孔板，在病毒上清液吸附Ih之後，按照傳統噬斑法加入0.5%瓊脂糖，然後繼續培養72h，0.4%的甲醛固定後，採用結晶紫染色，觀察藥物作用後噬斑情況。結果顯示黃連素具有比較好的抗病毒複製作用，病毒感染的細胞中加入黃連素其細胞比較完整，幾乎看不到病毒蝕斑，其作用效果類似於陽性對照藥金剛烷胺(圖6)。C、免疫螢光試驗檢測病毒感染細胞1、免疫螢光染色操作1、固定液的準備用4%多聚甲醛作為固定液，或根據特定的一抗或樣品用有效成分為乙醇、甲醇或其它類型的固定液。2、洗滌液的準備10XTBS的配製稱取24.2gTris(Tris鹼)，80gNaCl；用鹽酸調節pH值至7.6，定容至一升。TBS配製把10XTBS按照19的比例用水稀釋至IX即為TBS。TBSTx的配製在TBS中加入TritonX-100使最終濃度為0.1%，混勻，即為TBSTx。3、封閉液的準備配製含5%BSA的TBSTx作為封閉液含5%BSA的TBSTx的配製在100毫升TBSTx中加入5克BSA，溶解並混勻，即為含5%BSA的TBSTx。4、一抗稀釋液的準備使用上述封閉液，即含5%BSA的TBSTx，作為一抗稀釋液。一抗的稀釋一抗為鼠抗人H5WHA單克隆抗體。按照一抗說明書中推薦的用於免疫螢光染色的稀釋比例用一抗稀釋液稀釋一抗。5、螢光標記二抗的稀釋把螢光標記的二抗，按照11000的比例用本試劑盒提供的免疫螢光染色二抗稀釋液進行稀釋。根據螢光的強弱，稀釋的比例可以適當提高或降低。在螢光顯微鏡下，其結果如圖7所示。陰性對照組在激發光下不產生螢光；在視野中病毒感染未加任何藥物處理對照組在綠色激發螢光下產生非常多的紅色螢光，表明細胞中表達的HA蛋白量很大，證明被流感病毒感染的MDCK細胞很多；加入藥物UA與多肽165的實驗組螢光結果與病毒感染對照組相似，說明這兩種藥物沒有明顯的抗病毒作用；加入藥物黃連素的實驗組細胞，被激發出的螢光少且螢光較弱，可見被感染H5W病毒、並表達HA蛋白的細胞較少，說明黃連素具有很顯著的抗病毒作用；陽性對照組金剛烷胺的螢光效果與黃連素相近。D、Real-TimeRT-PCR檢測黃連素對病毒複製的影響為了檢測藥物對病毒轉錄和複製的影響，通過實時螢光定量試驗檢測了A型流感病毒三種不同形式的病毒RNA(mRNA、cRNA、vRNA)。不同藥物加入感染H5W病毒的MDCK細胞，4小時後收樣提取RNA。用不同的引物將病毒的mRNA、cRNA、vRNA反轉錄成cDNA，再通過螢光定量試驗，檢測病毒mRNA、cRNA、vRNA的量。引物設計1、RT-PCR引物mRNA5，_ττττττττττττττττττ_3，NP-cRNA5』-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTGTCAT-3』NP-vRNA5』-CTCACCGAGTGACATCAACATCATG-3』2、Real-TimePCR引物NPsense5，-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3，antisense5』-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3』r-actin:sense5，-TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3，antisense5，-AAATGCAAACCGCTTCCAAC-3，病毒RNA的提取1、用6孔板培養MDCK細胞，加入病毒1.5h後分別加入最佳濃度的藥物，設空白對照、陽性對照與陰性對照；2、4h後每孔加入ImlTrizol勻漿；3、移入1.5ml新離心管；4、冰上孵育5分鐘；5、離心12，000rpm4°C5分鐘取上清液移入1.5ml新離心管；6、加0.2ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘；7、12，OOOrpm4°C離心10分鐘取上層液移入1.5ml新離心管；8、加0.5ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘；9、12，000rpm4°C離心5分鐘棄去上清液；10、加入Iml75%乙醇，震蕩；11、離心7，500rpm4°C5分鐘棄去上清液；12、室溫下使之變透明；13、加入DEPC處理水10μ1-35μ1溶解RNA(可保存在液氮或低溫冰箱)。RT-PCR反應體系第一步RNA抽提物2μ1，20mM引物各Ιμ，70°C10分鐘，立即放入冰浴。第二步5xPT-PCR緩衝液5μ1，RNAsin0.5μ1,25mMMgC121.5μ1,2.5mMdNTP2μ1,AMV逆轉錄酶Ιμ，無菌水Ιμ;37°C1.5小時，94°ClOmin。Real-TimePCR反應體系上下遊引物各IulIOxPCR緩衝液2.5μ1，25mMMgC121.5μ1,DNA模板Ιμ，SYBRgreenI1μ1,2.5mMdNTP2μ1,Taq酶1μ1,無菌水14μ1;反應條件1、95°C5分鐘，為第一個步1個循環；2、95°C30秒，55°C30秒，72°C1分鐘為第二步40個循環；3、72°C10分鐘。Real-TimePCR的結果表明相對於對照組，病毒NP特異片段的mRNA在金剛烷胺(P<0.01)、黃連素(ρ<0.01)與UA(ρ<0.05)的作用下顯著減少(圖8)。病毒NP特異性片段的cRNA能顯著的被黃連素(ρ<0.01)和金剛烷胺(ρ<0.01)所抑制，並且黃連素的作用效果要高於金剛烷胺；相對於對照組，多肽165(ρ<0.05)與對NP的cRNA的形成也有很強的抑制作用(圖8)。而病毒NP片段的vRNA只有在金剛烷胺(ρ<0.01)存在時，才會顯著降低；實施例2黃連素預防病毒感染、對流感病毒吸附入侵、複製的影響分別將鋪成單層的細胞進行不同的處理方式藥物預先加入到細胞中孵育Ih之後，換液，加入相應的流感病毒；藥物對流感病毒吸附入侵採用藥物加入到病毒中共同孵育lh，然後再加入到細胞中；藥物對流感病毒的複製影響，採用病毒先感染細胞Ih後，然後加入藥物。所有實驗中使用的藥物濃度均為lOOug/ml，病毒感染量為1M.0.I的病毒液。分別在24、36、48h時採集部分上清，採用HA測定藥物的抗病毒作用。結果如圖9所示，黃連素不影響病毒的吸附和入侵，但是對病毒的複製抑制作用比較明顯，同時藥物具有一定的預防作用，能夠提高細胞對病毒感染的抵抗作用。實施例3哺育動物雙雜交試驗探討藥物對複製過程中一些酶的影響1、細胞轉染質粒分別為pM-PBl、pM-PB2、pVP_16_NP、pG5Luc。本試驗組設陰性對照不加入任何質粒，陽性對照加入pM-PBl(或pM-PB2)、pVP_16_NP、pG5Luc三種質粒，實驗組加入pM-PBl(或pM-PB2)、pVP-16-NP、pG5Luc三種質粒與各種藥物。Sofast脂質體轉染以下轉染操作以24孔板為例。轉染全過程必須嚴格無菌操作。1.在轉染前一天將待轉染細胞接種於24孔板中，37°C培養。轉染前的細胞密度以40-60%為準。2.準備以下溶液①稀釋1.5μISofast試劑於30μ1無血清、無抗菌素的DMEM培養基。混勻後室溫靜置3分鐘。②稀釋0.6μg待轉染質粒DNA於30μ1無血清、無抗菌素的DMEM培養基。混勻後室溫靜置。3.混合①、②兩種溶液，室溫靜置20分鐘。4.棄掉培養板中的舊培養基，加入0.5ml無血清、無抗菌素的DMEM培養基。5.加入上述Sofast試劑-DNA混合物於24孔板。6.37°C溫育4-6小時後換10%血清和抗生素的DMEM培養基。7.24後換無血清DMEM培養基，37°C培養。8.48-72小時後檢測。2、螢光素酶活性測定1、取出螢光素酶底物和螢光素酶裂解液在室溫下平衡。2、用PBS漂洗細胞。此過程必須仔細，不要接觸貼壁細胞。最後儘可能將PBS吸出ο3、加入足夠的裂解緩衝液以覆蓋細胞。例如400μl/60mm培養皿，900μ1/lOOmm培養皿或96孔板每孔20μ1。晃動培養皿數次以保證裂解緩衝液完全覆蓋細胞。4、將細胞從培養皿刮下。將細胞及所有的液體轉移至一個離心管中。將離心管置於冰上。旋渦震蕩離心管5-10秒鐘，然後以12000g離心15秒鐘(室溫)，將上清液轉移至一個新的試管中。5、取約30μ1(所用裂解液總量為100μ1)與50μ1的平衡好的底物在一個1.5ml的Ep管中混合，然後立即在TurnerBioSystemsTD-20/20螢光光度計(TurnerDesigns，Sunnyvale,CA)上檢測樣品的螢光素酶的活性。黃連素(Berberine)不能抑制病毒的吸附入侵。所以通過哺乳動物雙雜交試驗，檢測黃連素是否通過抑制病毒的核蛋白(NP)與PB1、PB2之間的相互作用從而影響病毒的複製。試驗結果如圖10.1所示各實驗組藥物對NP、PB1蛋白間相互作用沒有很顯著的影響(圖10.2)；而黃連素能抑制NP、PB2蛋白間的相互作用，相對於陽性對照，抑制率達到50%(圖10.3)。本實驗結果表明，黃連素可能是通過降低NP、PB2的結合而抑制病毒的複製。黃連素對流感病毒感染所引起的炎症反應的影響作用採用PGE2檢測試劑盒，分別在36、48h時收集病毒感染後的A549細胞上清液，按照試劑盒測定方法測定細胞上清中的PGE2含量。結果如圖11所示，病毒感染細胞36小時時產生的PGE2沒有明顯變化，且含量很低，等病毒感染細胞48小時測定時，病毒感染未加任何藥物處理的細胞組PGE2含量最高，與正常細胞對照組和用藥組有顯著性差異(*p<0.05；**p<0.01)，黃連素和陽性對照藥金剛烷胺能夠顯著降低PGE2的分泌(與病毒感染組比較，*P<0.05；**p<0.01)。說明黃連素能夠顯著降低病毒感染過程中引起的一些炎症因子的分泌。權利要求一種黃連素在製備治療或預防流感病毒藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種黃連素在製備治療流感病毒藥物中的應用，本發明證實黃連素在體外對H5N1、H3N2等A型流感病毒感染的MDCK細胞和A549細胞均具有良好的抗流感病毒作用。同時黃連素對流感病毒具有一定的殺傷作用，能夠預防流感病毒的侵襲，並對流感病毒感染後的細胞具有較好的抑制作用，其作用效果與陽性對照藥金剛烷胺比較近似，另外黃連素對流感病毒引起的炎症反應也有較好的抑制作用，揭示該藥物有開發成抗流感病毒藥物的前景。文檔編號A61P31/16GK101829113SQ20091006316公開日2010年9月15日申請日期2009年7月14日優先權日2009年7月14日發明者吳建國,朱應,袁婷婷,陶君彥申請人:武漢大學