一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑及其製備和檢測方法

2023-06-23 08:02:06 2

一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑及其製備和檢測方法
【專利摘要】本發明涉及1,5-脫水山梨醇檢測領域，具體涉及一種1,5-脫水山梨醇免疫檢測試劑及其製備和檢測方法，其特徵在於，包括：抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體、用於檢測抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體-1,5-脫水山梨醇複合物的指示試劑；所述抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體由1,5-脫水山梨醇免疫原免疫動物得到。本發明的有益之處在於：1,5-脫水山梨醇免疫原的免疫原性高，製備出的抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體特異性強、效價高；含有上述抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體的均相酶免疫檢測試劑可以方便、快速、準確地確定樣品中的1,5-脫水山梨醇含量，並且可以在全自動生化分析儀上同時測定多個樣品，實現1,5-脫水山梨醇的高通量快速化測定，準確度高，特異性強。
【專利說明】一種1 』 5-脫水山梨醇免疫檢測試劑及其製備和檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及1，5-脫水山梨醇檢測領域，具體涉及一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑及其製備和檢測方法。
【背景技術】
[0002]1,5-脫水山梨醇(I, 5-anhydro glue i to I, I，5-AG),結構式如式(III)所示:
[0003]
【權利要求】
1.一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特徵在於，包括:抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體、用於檢測抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體-1，5-脫水山梨醇複合物的指示試劑；所述抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體由1，5-脫水山梨醇免疫原免疫動物得到，所述1，5-脫水山梨醇免疫原的結構式如式(I)所示:
2.根據權利要求1所述的1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特徵在於，所述的R為-(CH2)4-COO-;所述的載體為血清蛋白、血藍蛋白或甲狀腺球蛋白。
3.根據權利要求1所述的1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特徵在於，所述指示試劑選自酶試劑，包括:酶標偶聯物和酶的底物；所述酶標偶聯物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物；所述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸。
4.根據權利要求3所述的1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特徵在於，所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與1，5-脫水山梨醇衍生物偶聯形成，所述1，5-脫水山梨醇衍生物的結構式如式(II)所示:
5.根據權利要求4所述的1，5_脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特徵在於，R為-(CH2)4-COO'
6.一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)權利要求4所述的1，5-脫水山梨醇衍生物的合成與純化，並進行結構鑑定； (2)1，5-脫水山梨醇免疫原的合成:使1，5-脫水山梨醇衍生物的-(CH2)n-COO-基團與具有免疫原性的蛋白質載體連接，η為I至20之間的整數； (3)用1，5-脫水山梨醇免疫原免疫動物，製備並純化抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體； (4)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯物的製備:製備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液，激活1，5-脫水山梨醇衍生物，使G6TOH與1，5-脫水山梨醇衍生物連接，純化連接產物； (5)I, 5-脫水山梨醇均相酶免疫檢測試劑的製備: 試劑A的製備:由抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體和均相酶底物混合而成； 試劑B的製備:由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯物與Tris緩衝液混合而成。
7.根據權利要求6所述的一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的製備方法，其特徵在於，所述的步驟(2)中，蛋白質載體為BSA, η=4,具體合成步驟如下: 1)將20mgBSA溶解於5ml0.2M，pH8.5的磷酸緩衝液PBS中，上述溶液置於燒杯A中； 2)將如下化學品加入到燒杯B中攪拌溶解:20mgl，5-脫水山梨醇衍生物，0.35ml 二甲基醯胺，0.35ml乙醇，0.7mll0mM pH5.0的磷酸鉀緩衝液，40mgl_乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺，5mg N-羥基硫代琥珀醯亞胺，於室溫下攪拌溶解，反應30分鐘； 3)將燒杯B中的溶液滴加至燒杯A中，得到混合溶液，在2~8°C下攪拌過夜；將上述攪拌後的混合溶液經過中性磷 酸鹽緩衝液透析純化，得到BSA-1，5-脫水山梨醇免疫原，儲存於-20°C。
8.根據權利要求6所述的一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的製備方法，其特徵在於，所述的步驟(4)具體過程為: O葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)溶液的製備: a.稱取15mg 規格為 100KU 的 G6PDH,室溫溶解於 12mL 含有 72.6mg (0.05M)Tris、8mgMgCl2 (3.3mM)和 IOOmgNaCl 的溶液中，該溶液 ρΗ=9.0 ； b.加入225mg還原態的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以及0.75mL卡必醇； c.逐滴加入2mL二甲基亞諷； 2)I, 5-脫水山梨醇衍生物的激活 a)在無水狀態下稱取IOmgl,5-脫水山梨醇衍生物，溶解於600 μ LDMF中； b)使上述溶液溫度降到-2~-8°C; c)加入3yL三丁胺； d)加入1.5μ L氯甲酸異丁酯； e)-2~-8°C攪拌30分鐘； 3)G6PDH與1，5-脫水山梨醇衍生物的連接 a)將上述激活的1，5-脫水山梨醇衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中； b)2-8°C攪拌過夜； 4)純化產物 通過G-25凝膠層析柱純化連接產物，獲得的最終產物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯物，於2-8°C下儲存。
9.根據權利要求6所述的一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的製備方法，其特徵在於，步驟(5)的具體過程如下: 試劑A的製備:將4.036g (11.25mM)氧化態的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸NAD、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸G6P用lL55mM、pH=8.0的Tris緩衝液溶解製成均相酶底物；將製備的抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗體與均相酶底物的體積比為 1:100 ~1:10000 ； 試劑B的製備:將製備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯物加到120mM、pH=8.2的Tris緩衝液中，上述偶聯物與Tris緩衝液的體積比為1:100 ~ 1:10000。
10.利用權利要求1至5任意一項所述的1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)將待測樣本與抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體接觸； 2)根據待測樣本中1，5-脫水山梨醇與抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體的結合情況，利用指示試劑判斷樣本中甘膽酸的含量；所述待測樣本為血清、血漿、唾液或尿液。
【文檔編號】G01N33/531GK103760366SQ201410047754
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月11日 優先權日:2014年2月11日
【發明者】虞留明, 成志鵬, 王英, 張曼, 顧國浩 申請人:蘇州博源醫療科技有限公司