乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器及其製法的製作方法

2023-06-20 15:12:56 1

專利名稱：乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器及其製法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測周圍神經束性質的傳感器及其製法，特別是乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器及其製法。
背景技術：
在現有技術中，對神經束性質進行判斷的方式主要有以下幾種1.解剖方式對神經幹內的神經束的定位圖譜進行研究，很多學者已將周圍神經(如正中神經、橈神經、尺橈神經幹、坐骨神經乾等)分別進行了分析，觀察了神經幹的位置、形態、束數，測量其大小，繪製了神經斷面的神經束局部定位圖，但在臨床中，往往因神經損傷後兩斷端易發生扭曲，改變了原有的正常解剖位置，故臨床應用受到限制。
2.電刺激法通過電刺激神經束所產生的反應來鑑別，若電刺激出現肌肉收縮則為運動束，而感覺束則無反應。但此法需保持病人清醒，且限於新鮮損傷，個體差異大，而且刺激引起肌肉收縮是神經傳導結果還是電流擴散所致，不能區分。故臨床應用價值不大。
3.放射生物化學法用放射性同位素標記酶的底物，再根據酶反應所產生的放射性產物來測定酶的活性，推測神經束的性質，但此法涉及同位素技術，設備要求高，且放射物質對患者及術者都有損害，故實用性不大。
4.酶組織化學法根據運動束與感覺束中某些生物活性物質的含量差別，作為鑑別運動束與感覺束的標準，如運動束神經纖維中乙醯膽鹼酯酶活性遠高於感覺束，因此以乙醯膽鹼酯酶活性為標準鑑別運動束與感覺束的方法得到廣泛認可。目前檢測乙醯膽鹼酯酶主要為酶組織化學染色法，根據反應形成亞鐵氰化銅(一種棕色沉澱)出現於酶活性部位，運動纖維呈強陽性，感覺纖維大部分呈陰性，少部分呈弱陽性的原理，對神經束性質進行判定。但此法存在問題是(1)染色時間長(約50分鐘)，過程複雜；(2)需切取兩斷端神經片斷，不能進行原位染色。故臨床應用也受到一定限制。
5.免疫組化法利用特異性抗原抗體反應，觀察研究組織細胞特定抗原(或抗體)的定位和定量技術，發現了感覺神經元的特異蛋白，並以該蛋白作為抗原製備了單克隆抗體，通過免疫染色來鑑別感覺纖維，其特點是特異性高，對人體無毒，染色時間較以往方法縮短，需25至30分鐘。但這種方法現階段仍需要切取組織片段，且存在染色特異性與時間問題，時間過短染色不深，過長則其它組織亦染上色，臨床醫生難以控制，且操作比較複雜，實用性不夠。
6.化學傳感器針對以往方法的不足，本申請人自98年起，進行了新的探索，與同濟醫大生物醫學工程教研室合作，將生物傳感技術應用到周圍神經運動束與感覺束的鑑別，利用生物傳感器靈敏、快速、準確、特異性強的特點，製成了可以檢測乙醯膽鹼酯酶活性的化學生物傳感器。該傳感器可以檢測每根神經束上乙醯膽鹼酯酶的活性，原理是傳感針上固定的乙醯膽鹼與乙醯膽鹼酯酶起反應，反應過程中有電位和pH改變，傳感針通過記錄電位與pH值變化，反映出乙醯膽鹼酯酶的活性高低，活性高的神經束為運動束，反之則為感覺束。整個反應過程為數十秒至3分鐘，較以往方法大大縮短了時間，使用方便，並可單根神經束原位檢測，成功實現了原位檢測，滿足了臨床要求並減少了誤差及幹擾。通過動物實驗取得了較好的效果。但此方法存在的問題是傳感針每檢測一束後須更換，不能重複使用，每檢測一根神經束仍需幾分鐘，時間還稍嫌長。故此傳感器仍需改進才能適用於臨床。
2、技術方案為實現上述目的，本發明所述的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器，它包括光纖和傳感膜，傳感膜是由具有生物相容性的高分子膜、膽鹼氧化酶和氧指示劑組合而成的複合膜，傳感膜固定在光纖的光纖頭表面。所述的光纖為「Y」型。所述的高分子膜為美國杜邦公司生產的全氟磺酸質子交換膜(Nafion)、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚乙稀醇.(PVA)或聚氯乙稀(PVC)。所述的氧指示劑是三聯吡啶釕(Tris(2，2』-bipyridyl)ruthenium(II)Chioride Hexahydrate)或鄰菲咯啉釕(Ru(4，7-diphenyl-1，10-phen)3cl2)。
本發明所述的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器的製法，其特徵在於將所述的由高分子膜、膽鹼氧化酶和氧指示劑組合而成的傳感膜通過共價結合或物理吸附方式固定到光纖的光纖頭表面。所述的傳感膜有三種製作方法，其一是由吸附有氧指示劑的高分子膜、膽鹼氧化酶和高分子膜複合而成；其二是由吸附有氧指示劑的高分子膜和固定有膽鹼氧化酶的高分子膜複合而成；其三是將氧指示劑、膽鹼氧化酶混合在高分子材料的溶液中，凝固後形成的單層膜。
本發明的工作原理是在神經束內和傳感膜內存在下列化學反應(c)其中(a)為神經束內存在的化學反應，(b)、(c)為傳感頭膜內的反應。
通過反應(c)中氧氣的生成量，換算成乙醯膽鹼酯酶的活性。
傳感膜主要由具有生物相容性的高分子膜，膽鹼氧化酶和氧指示劑三部分組成，其中高分子材料要求對人體無毒無害，能有效地通透膽鹼，在一定程度上阻止體液中影響檢測結果的分子透過，可選用Nafion膜，PDMS，PVA，PVC等。膽鹼氧化酶可以直接與高分子材料混合後凝固成膜，也可先與鏈狀有機分子材料共價結合後如聚六乙二醇(PEG-NHS)，再與高分子材料混合後凝固成膜，這能減少酶的洩漏，延長傳感膜的壽命，提高檢測結果的可重複性。氧指示劑通常採用釕的化合物如Tris(2，2』-bipyridyl)ruthenium(II)chlorideHexahydrate；Ru(4，7-diphenyl-1，10-phen)3Cl2等，這類螢光染料對氧含量十分敏感，其螢光壽命也隨氧含量變化而變化，因此不僅可以通過螢光強度變化來測量氧含量變化，還可通過測量螢光壽命、散光、染料濃度等制約強度，測量準確性的因素影響在各種環境下準確的變化。
生物相容性高分子膜、膽鹼氧化酶、氧指示劑可通過以下三種方法組合成傳感膜方法一採用三層結構，分別為修飾了氧指示劑的高分子膜，膽鹼氧化酶和高分子膜保護層。
方法二採用二層結構，分別為修飾了氧指示劑的高分子膜和固定了膽鹼氧化酶(Cho)的高分子膜。
方法三將氧指示劑、膽鹼氧化酶混合在高分子材料溶液中，凝固後形成單層膜。
光纖採用直徑1mm左右Y型分叉光纖。
3、有益效果本發明與現有技術相比，其顯著優點是傳感器應用了當今在通訊、電子、醫療、環境檢測等領域廣泛應用的光纖傳感技術。目前臨床中光纖傳感器可對體液中電解質血氣進行檢測，已廣泛運用在ICU病房監視器中。現代光纖傳感器還可進行單分子檢測，並可實現表面成像。利用光導纖維數據容量大，靈敏度高達10-12mol/L，失真率低、體積小等特點，將乙醯膽鹼酯酶信息經計算機分析處理並模擬神經束斷面成像作為可視化反饋，以期達到在不切取神經斷端的前提下，活體、原位、快速(整個進程數秒內完成)、直觀、準確地鑑定神經斷端兩側神經束的性質，無需染色，方便快捷，操作簡單，對人體無毒無創，實現機械化，集成化和智能化。
該種活體原位鑑別周圍神經束性質的光纖生物傳感器，將為周圍神經損傷後的顯微外科修復，提供一種簡便而迅速的方法，大大提高周圍神經損傷修復後的功能恢復率，並將在臨床應用中廣泛推廣。
圖2是傳感膜第一種結構示意圖。
圖3是傳感膜第二種結構示意圖。
圖4是傳感膜第三種結構示意圖。
圖5是本發明工作原理示意圖。
實施例2Y型光纖1的直徑仍為1mm，傳感膜2為二層結構。膽鹼氧化酶膜和氧指示劑膜。氧指示劑膜是將5mm(bpy)32+的1.25wt％Nafion乙醇溶液滴至光纖端面，室溫乾燥後製得。膽鹼氧化酶溶液是將Nafion溶液用90％乙醇釋至1％終濃度，將3mg膽鹼氧化酶(10單元/mg)加入50ul％Nafion溶液。製得的膽鹼氧化酶液滴至光纖表面乾燥後製得傳感膜。
實施例3Y型光纖1為直徑為1mm，傳感膜2為單層結構。將氧指示劑C、膽鹼氧化酶b和PDMS高分子材料a的溶液混合，經冷凝後形成單層膜。將上述單層的傳感膜2通過吸附方式固定到Y型光纖1的光纖頭表面。
按照實施例1至實施例3製得的乙醯膽鹼酯酶光纖傳感器，結合光源3、檢測器4、計算機5和圖像顯示器6(如圖5)，即可對神經幹7的神經束性質進行快速、直觀、準確地測定。光源可用雷射、發光二極體、汞燈等。使用汞燈等光譜較寬的光源時，使用相應的濾色片獲得所需波長的激發光，光源的波長選擇參考所用的氧指示劑的激發波長。如使用Tris(2，2』-bipy ridyl)ruthenium(II)chloride Hexahydrate，用480nm左右的光源，經幹涉濾色片(中心波長470nm，半峰寬30nm)後，由透鏡(f＝5mm)耦合入直徑為1mm的Y型光纖1，經光纖傳輸至傳感膜2，激發後的螢光由Y型光纖1的另一臂傳至檢測器，該檢測器用海洋公司(Dcean Ofics Inc)S2000型光纖光譜儀。將乙醯膽鹼酯酶信息經計算機分析處理並模擬神經束斷面成像後通過顯示器進行可視化反饋。
檢測過程中，將膽鹼用20mm Tris緩衝液(PH＝8.0)稀釋至不同濃度。
權利要求
1.一種用於鑑別周圍神經纖維性質的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器，其特徵在於它包括光纖(1)和傳感膜(2)，傳感膜(2)是由具有生物相容性的高分子膜(a)、膽鹼氧化酶(b)和氧指示劑(c)組合而成的複合膜，傳感膜(2)固定在光纖(1)的光纖頭表面。
2.根據權利要求1所述的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器，其特徵在於所述的光纖(1)為「Y」型。
3.根據權利要求1所述的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器，其特徵在於所述的高分子膜(a)為全氟磺酸質子交換膜(Nafion)、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚乙稀醇(PVA)或聚氯乙稀(PVC)。
4.根據權利要求1所述的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器，其特徵在於所述的氧指示劑(c)是三聯吡啶釕(Tris(2，2』-bipyridyl)ruthenium(II)ChlorideHexahydrate)或鄰菲咯啉釕(Ru(4，7-diphenyl-1，10-phen)3cl2)。
5.根據權利要求1所述的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器的製法，其特徵在於將所述的由高分子膜(a)、膽鹼氧化酶(b)和氧指示劑(c)組合而成的傳感膜(2)通過共價結合或物理吸附方式固定到光纖(1)的光纖頭表面。
6.根據權利要求5所述的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器的製法，其特徵在於所述的傳感膜(2)是由吸附有氧指示劑(c)的高分子膜、膽鹼氧化酶(b)和高分子膜(a)複合而成。
7.根據權利要求5所述的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器的製法，其特徵在於所述的傳感膜(2)是由吸附有氧指示劑(c)的高分子膜和固定有膽鹼氧化酶(b)的高分子膜(a)複合而成。
8.根據權利要求5所述的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器的製法，其特徵在於所述的傳感膜(2)是將氧指示劑(c)、膽鹼氧化酶(b)混合在高分子材料(a)的溶液中，凝固後形成的單層膜。
全文摘要
本發明公開了一種用於鑑別周圍神經纖維性質的乙醯膽鹼酯酶光纖生物傳感器,其特點是它包括光纖和傳感膜,傳感膜固定到光纖頭表面。本發明的製法是將傳感膜通過共價結合或物理吸附的方式固定到光纖頭表面,而傳感膜的製法有三種,其一是由吸附有氧指示劑的高分子膜、膽鹼氧化酶和高分子膜複合而成;其二是由吸附有氧指示劑的高分子膜和固定有膽鹼氧化酶的高分子膜複合而成;其三是由將氧指示劑、膽鹼氧化酶混合在高分子膜的溶液中後凝固所形成的單層膜。本實用新型的優點是在不切取神經斷端的前提下,活體、原位、快速、直觀、準確地鑑定出神經斷端兩側神經束的性質,無需染色,方便快捷,操作簡單,對人體無毒無創,實現機械化,集成化和智能化。
文檔編號C12Q1/44GK1363687SQ02112510
公開日2002年8月14日 申請日期2002年1月9日 優先權日2002年1月9日
發明者曹曉建, 陸祖宏, 王宏, 柴雪挺, 賈可 申請人:南京醫科大學