鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌oxa-23突變基因的螢光定量pcr試劑盒的製作方法

2023-06-20 07:49:11

專利名稱：鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌oxa-23 突變基因的螢光定量pcr 試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及耐藥基因的檢測試劑盒及方法。具體而言，本發明根據新篩選的 0XA-23基因突變的鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌菌株，設計了檢測0XA-23突變的鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌的螢光定量PCR試劑盒，本發明也涉及其檢測方法。
背景技術：
不動桿菌是ー類非發酵、嚴格需氧的革蘭陰性桿菌，普遍存在於自然界中。不動桿菌屬至少可分為32個基因種型，其中鮑曼不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌、不動桿菌基因種型3 及13TU通過常規表型鑑定難以區分，合稱為鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌複合體。鮑曼不動桿菌為不動桿菌屬中最常見的ー種革蘭陰性桿菌，廣泛存在於自然界的水及土壌、醫院環境及人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，為條件致病菌。該菌在醫院環境中分布很廣且可以長期存活，極易造成危重患者的感染，因此常從被感染患者的血、 尿、膿液及呼吸道分泌物等標本中分離出，在非發酵菌中感染僅次於假單胞菌。鮑曼不動桿菌在醫院分布以I⑶病區最多，其次為呼吸內科患者。感染的病人多是老年患者、危重疾病及機體抵抗力弱的患者，以及使用各種侵入性操作和長期使用廣譜抗生素治療的患者。又因為該菌對溼熱紫外線及化學消毒劑有較強抵抗力，常規消毒只能抑制其生長而不能殺滅，而抵抗力弱或有創傷的患者可能被從醫務人員的手或消毒不徹底的醫療器械所帯有的細菌感染的機會較多。近年來，不動桿菌屬在臨床樣本中的分離率逐年提高，而鮑曼不動桿菌約佔其中的80% -90%。鮑曼不動桿菌可引起呼吸機相關肺炎、尿路感染、敗血症、創ロ感染及中樞神經系統感染等。由於鮑曼不動桿菌具有極強的環境適應能力和獲得外源性耐藥基因的能力，因而極易造成醫院內的播散流行。鮑曼不動桿菌可以通過質粒、轉座子和整合子等可移動基因元件，獲得對多種抗菌藥物的耐藥性。對I株歐洲克隆I多藥耐藥菌株的全基因組序列分析發現，在一段長約86kb的染色體片段上聚集了 45個耐藥基因，包括VEB-I、AmpC、 多種氨基糖苷類抗菌藥物修飾酶，形成了被稱為AbaRl的耐藥基因島。該耐藥基因島與假單胞菌屬、沙門菌屬和大腸埃希菌的基因片段具有同源性，證實為獲得性外來序列。在另I 株歐洲克隆II的MDRAB (ACI⑶)的染色體中亦發耐藥基因島AbaR2。鮑曼不動桿菌整合外源性基因的能力，使其具有對臨床所用抗菌藥物產生耐藥性的巨大潛力。在眾多的耐藥基因中內醯胺酶基因是鮑曼不動桿菌最主要的耐藥基因，包括超廣譜￠-內醯胺酶類(屬 A類，包括TEM-型、SHV-型、SM-型、PER-型等基因)、金屬酶類(屬B類，包括MP和VM 基因)、0XA型酶(屬D類)等。0XA-23型酶，水解青黴素和頭孢菌素、碳青黴烯，使菌株產生對亞胺培南類抗生素的耐藥性[Livermore DM, Woodford N. Carbapenemases a problem in waiting. Curr Opin Microbiol,2000,3(5) :489-495.]。多藥耐藥鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌的出現，給醫院感染控制及臨床治療帶來了極大的困難，由於感染的病人多是老年患者、危重疾病及機體抵抗力弱的患者，如不及時選擇鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌敏感的抗生素進行治療，將會危及患者的生命安全。

發明內容
為了解決上述問題，本發明公開了鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌0XA-23突變基因的實時螢光定量PCR試劑盒及其方法。本發明首先公開了鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌0XA-23突變基因的實時螢光定量 PCR試劑盒。本發明的試劑盒包括特異性引物、特異性探針、標準DNA模板以及其他常規螢光定量PCR試劑。本發明的試劑盒可採用以下方法實施根據新篩選出的D類P -內醯胺酶耐藥基因0XA-23的突變體的序列，所述突變體核苷酸序列為Sequence NO. 3,其所編碼的蛋白質胺基酸序列為Sequence NO. 7。根據 Sequence NO. 3設計探針和上、下遊引物。所述的上遊和下遊引物的序列分別見Sequence NO. 4 和 Sequence NO. 5,所述的探針序列見 Sequence NO. 6。或者包含有上述序列的向5』端延長的序列； 或者與上述序列同源性大於85 %的序列。所述探針5』端標記螢光發色基團FAM，3』端連接螢光淬滅基團BHQ。採用25 yl 反應體積,姆個反應中含12. 5 U I通用PCR反應混合物[TaqMan Universal PCR Master Mix(2X)];上、下遊引物各IOnM(上下引物序列分別為Sequence NO. 4和Sequence NO. 5)； 400nM探針(探針序列為Sequence NO. 6) ；2u I DNA模板；補無菌水至25^1。反應條件為 950C IOmin 後，以 95°C 40s 和 60°C Imin 循環 45 次。本發明採用VITEK32細菌鑑定儀及GNS448藥敏板進行藥敏試驗，檢測D類P -內醯胺酶耐藥基因0XA-23的突變體菌株對抗生素的敏感性，結果顯示，所述突變體菌株對頭孢噻肟、丁胺卡拉、氨苄西林、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酷、慶大黴素、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦耐藥，對頭孢哌酮/舒巴坦和左氧氟沙星較為敏感。本發明提供了檢測鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌0XA-23突變基因的實時螢光定量 PCR試劑盒的應用。本發明所述的螢光定量PCR試劑盒可以用於0XA-23基因突變的鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌菌株的檢測。


圖I.標準質粒各濃度對應循環參數(Ct值)。圖中曲線從左到又依次代表標準質粒濃度為 IO8Copies/ u 1> IO7Copies/ U 1> IO6Copies/ U 1> IO5Copies/ U 1> IO4Copies/ U I、 IO3Copies/ U I、IO2Copies/ U I 時的突光定量 PCR 曲線。圖2. 0XA-23突變基因與0XA-23基因序列比對圖。三角形所指的位點為突變位點。圖3. 0XA-23突變基因編碼的蛋白質胺基酸序列與0XA-23基因編碼的蛋白質胺基酸序列比對圖。三角形所指的位點為突變位點。
具體實施例方式實施例I :鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌耐藥基因0XA-23新序列的確定
4
I.菌株來源 從2009年10月至2011年5月我們收集了對抗生素高度耐藥(特別對亞胺培南耐藥)的鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌32株。所述32株標本來源於病人的痰液。2. 0XA-23引物設計本發明設計了ー對D類@ -內醯胺酶耐藥基因0XA-23的特異性引物，所述引物的序列見SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。3.0XA-23基因的擴增以上述32株鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌裂解液為模板，進行 PCR擴增，擴增體系為(25ul體系):模板DNA (細菌裂解液)2ul，引物I和2各2ul，TaqE 0. 25ul (0. 5U)，IOXBuffer 2. 5ul, dNTP 2ul，用 ddH20 補足至 25ul。PCR 儀反應條件如下預變性95°C5min循環(35個):變性94°C 30秒退火55で30秒延伸72°C 30 秒延伸72で5min4. 0XA-23基因擴增產物回收將PCR產物做瓊脂糖電泳，在紫外燈下切下目的條帶，利用QIANGEN快速膠回收試劑盒回收PCR產物。將回收的產物送上海生エ測定。5.測序結果與BLASTn比對，只發現其中I株編號為AB37的菌株0XA-23群陽性， 確定與0XA-23基因相似，其核苷酸序列見SEQ ID NO :3，蛋白質序列見SEQ ID NO :7，所述核苷酸突變位點見圖2，所述核苷酸序列所編碼的蛋白質突變位點見圖3。實施例2 :檢測0XA-23新序列的實時螢光定量PCR試劑盒製備I.引物設計與探針合成根據上述實施例I得到的SEQ ID N0:3序列。採用ABI primer Express 2. 0軟體設計探針和引物(上海基康公司合成)。上遊引物序列見SEQ ID NO :4和下遊引物序列見SEQ ID NO :5，探針序列見SEQ ID NO :6。所述探針5』端標記螢光發色基團FAM，3』端連接螢光淬滅基團BHQ。2.標準DNA模板製備採用上一步所述的上下遊引物對以上述的AB37的菌株為模板擴增出200bp片段， PCR產物純化(QIAgen,German)並連接到PGM-T克隆載體後轉化到DH5 a感受態細胞。特異引物篩選陽性克隆後提取質粒DNA，此質粒DNA即為標準DNA模板，為本領域研究人員根據設計的引物和所述模板通過分子學實驗可直接得到其序列信息，此處不再贅述。採用 NanoDrop ND-1000核酸定量儀定量質粒DNA,使標準質粒濃度範圍在IO8 102copies/ U I, 作為所述螢光定量試劑盒的標準品。3.螢光定量 PCR 反應液10mmol/L 的 dNTP、25mmol/L 的 MgCl2。4.螢光定量 PCR IOxBuffer 500mM KClUOOmM Tris-HClU % Triton X-IOO05.陰性質控標準品無菌雙蒸水。6.螢光定量PCR反應條件螢光定量PCR儀為Line-Gene K (杭州博日，中國)，25微升反應體系包括 12. 5u I 2 X TaqMan Universal PCR Master Mix (美國 ABI 公司)，上、下遊引物各 IOnM(上下引物序列分別為Sequence NO. 4和Sequence NO. 5) ;400nM探針(探針序列為Sequence NO. 6)，2 ill DNA模板、加ddH20至25微升。反應程序為95°C IOmin預變性，接45個循環 95°C 40s,60°C lmin。無菌水用於陰性對照。
實施例3體外檢測實驗I.靈敏性檢測將標準DNA模板進行10倍梯度稀釋，使標準質粒濃度範圍在IO8 IO2Copies/ U I，作為螢光定量試劑盒的標準品。螢光定量PCR反應條件，25微升反應體系12. 5 ill 2 X TaqMan Universal PCR Master Mix (美國ABI公司)，上、下遊引物各IOnM(上下引物序列分別為 Sequence NO. 4 和 Sequence NO. 5), 400nM探針(探針序列為 Sequence NO. 6), 2 U I梯度稀釋的標準DNA模板、加ddH20至25微升。反應程序為95°C IOmin預變性，接45 個循環95°C 40s,60°C lmin。無菌水用於陰性對照。檢測結果見圖1，靈敏分析顯示最小能檢測到IOOcopies/反應。本實驗批內重複3 次，批間重複3次以分析其重複性。重複性結果顯示批內CV%< 5%內，批間CV%< 10%o 說明本試劑盒具有良好的重複性。2.特異性檢測I)陰性對照菌株肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、惡臭假單胞菌、 鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌，以上菌株均來自中國微生物菌株保藏管理委員會。2)陽性對照株為本室分離的0XA-23基因突變的鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌4個克隆。3)PCR 反應體系為12. I 2 X TaqMan Universal PCR Master Mix(美國 ABI 公司)，上、下遊引物各IOnM(上下引物序列分別為Sequence NO. 4和Sequence NO. 5)，400nM 探針(探針序列為Sequence NO. 6), 2 U I各菌種DNA提取液和標準DNA質粒、加ddH20至 25微升。反應程序為95°C IOmin預變性，接45個循環95°C 40s,60°C lmin。特異性結果分析顯示，只有本室分離的0XA-23基因突變的鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌的4個克隆為陽性，其它樣品均為陰性，所以本試劑盒檢測特異性達到100%。實施例3鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌耐藥基因0XA-23新突變體菌株的藥物敏感實驗本發明採用VITEK32細菌鑑定儀及GNS448藥敏板進行藥敏試驗，檢測D類P -內醯胺酶耐藥基因0XA-23的突變體菌株對抗生素的敏感性，用銅綠假單胞菌(ATCC 27853) 及大腸埃希菌(ATCC25922)作為藥敏質控菌株，結果判斷按CLSI2000標準進行，結果如下
表
權利要求
1.ー種0XA-23突變蛋白，其序列如SEQ ID N0:7所示。
2.編碼權利要求I所述蛋白的核苷酸。
3.根據權利要求2所述的核苷酸，其特徵在幹其序列如SequenceNO. 3所示。
4.ー種檢測權利要求2或3的鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌0XA-23突變基因的實時螢光定量PCR試劑盒，包括特異性引物和特異性探針，所述特異性引物包括上遊引物和下遊引物上遊引物其序列為Sequence NO. 4，或者包含Sequence NO. 4序列的向5』端延長的序列；下遊引物其序列為Sequence NO. 5,或者包含Sequence NO. 5序列的向5』端延長的序列；所述特異性探針其序列為Sequence NO. 6,或者包含Sequence NO. 6序列的向5』或3』 端延長的序列。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒可以用於含有0XA-23突變基因的鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌引起的疾病早期抗菌藥物的選擇。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述的抗菌藥物優選左氧氟沙星。
7.權利要求2或3所述的核苷酸在製備檢測0XA-23突變的鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌菌株的試劑盒中的用途。
全文摘要
本發明公開了鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌OXA-23突變基因的螢光定量PCR試劑盒及其方法。本發明根據新篩選出的鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌D類β-內醯胺酶耐藥基因OXA-23的突變體的序列設計了特異寡核苷酸引物和探針。本發明所述的螢光定量PCR試劑盒可以用於檢測鮑曼複合醋酸鈣不動桿菌。
文檔編號C12N15/31GK102603875SQ201110442340
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者戚永孝, 梁勇, 王冬國, 王海寶 申請人:台州市立醫院