一株吡啶降解菌株A6及其生產的菌劑和應用的製作方法
2023-06-20 13:32:46
本發明涉及環境汙染微生物修復，具體涉及一株吡啶降解菌株A6及其生產的菌劑和應用。
背景技術：
工業化快速階段導致大批量使用各種各樣的人工合成化學物質，被認為是異生物質，導致環境汙染。目前工業生產每天都產生和排放大量的芳香族化合物,這其中大約有2/3都是雜環化合物。雜環化合物被廣泛應用於工業溶劑、染料、炸藥、醫藥及農藥等領域。吡啶就是其中一種典型的含氮雜環化合物。吡啶，含氮雜環化合物，可以看做苯分子中的一個(CH)被N取代的化合物，故又稱氮苯，無色或微黃色液體，有惡臭。吡啶及其同系物存在於骨焦油、煤焦油、煤氣、頁巖油、石油中。吡啶廣泛用於化工、醫藥工業以及農藥生產等行業，具有毒性大、致畸性、致癌性強和難生物降解等特點。
異生化合物的生物降解被認為是具有挑戰性的任務之一。而作為異生化合物的典型代表吡啶，由於水溶性和擴散性都較好，已成為土壤和廢水中常見的汙染物，生物降解是解決該類問題的有效方法。生物降解和物理化學降解有很大不同，它是一個自然的過程，是微生物利用有機汙染物質進行生長和自身的生理代謝過程。利用從環境中篩選的降解微生物能夠有效去除環境中雜環和苯環類等汙染物質。
吡啶對人體能產生損傷，它具有強烈刺激性，濃度較低時，可麻醉中樞神經系統，同度較高時，輕者有欣快或窒息感，繼之出現抑鬱、肌無力、嘔吐等症狀，重者意識喪失、大小便失禁、強直性痙攣、血壓下降、誤服可致死。長期吸入出現頭暈、頭痛、失眠、步態不穩及消化道功能紊亂，可發生肝腎損害，還可引起皮炎。據相關研究顯示，吡啶對男性損傷極大，長期接觸會影響精子活性進而導致男性不育症。
國內外關於吡啶降解菌的研究已屢見不鮮。主要集中在2個方面:1、代謝途徑,學者們根據對不同細菌或真菌在不同條件下(好氧、厭氧)的研究,提出了多種微生物降解吡啶途徑。2、生物強化去除作用,直接向廢水處理系統中投加吡啶高效降解菌株或固定化這些菌株細胞來實現汙染物的去除。自20世紀70年代，學者陸陸續續分離到一些吡啶降解菌，其中大部分是細菌，如假單胞菌屬、脂肪桿菌屬、芽孢桿菌屬、無色桿菌屬、黃桿菌屬、混沌紅球菌屬、節桿菌屬等。也有放線菌和真菌，如白腐真菌。但用於實際生物修復有高成效的鮮有出現，本發明 希望分離和鑑定到高效吡啶降解菌的，探尋高效降解菌的種屬關係，為吡啶汙染土壤的生物修復提供理論支持。
技術實現要素：
發明目的：針對現有技術存在的問題，發明提供一株吡啶降解菌株A6，用於降解土壤或水體環境中殘留的吡啶；本發明的另一目的是提供該吡啶降解菌生產的菌劑；該菌株製備的降解菌劑可在短時間內使土壤或水體環境中殘留的吡啶降解。
技術方案：為了實現上述目的，如本發明所述的一株吡啶降解菌株A6，經鑑定為放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國.武漢.武漢大學，郵編：430072，保藏時間為2016年10月24日，保藏編號為CCTCC NO:M 2016592。該菌株是發明人從安徽省皖北藥業股份有限公司的藥廠廢水生化處理池的活性汙泥中分離到的。降解菌株A6主要生物學特性為：革蘭氏陰性菌，在含3000mg/L的吡啶LB固體培養基上培養2-3天後，A6菌落呈圓形，邊緣整齊，呈透明至淡黃色。
本發明所述的菌株A6在降解吡啶中的應用。
作為優選，所述菌株A6在降解土壤或水體環境中吡啶的應用。
本發明所述的菌株A6在生產吡啶降解菌劑中的應用。
一種利用上述菌株A6生產的降解菌劑。
所述的降解菌劑，通過以下步驟所製成：
1)將降解菌株A6培養到對數期的試管液按0.5-1.5％體積比的接種量接種於發酵培養基中，振蕩培養至對數期，製得發酵菌種；
2)將上述製得發酵菌種按5-10％體積比的接種量接種入種子罐的培養基中，培養至對數生長期，製得種子液；
3)將種子液按8-10％體積比的接種量接入生產罐的培養基中培養；
4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:(0.8-1.5)，攪拌速度為180-250rpm，培養溫度為25-32℃，全流程培養時間為36-48小時，發酵完成後培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。
上述的降解菌劑在降解吡啶中的應用。
作為優選，所述降解菌劑在降解土壤或水體環境中吡啶的應用。
本發明試劑和儀器：
吡啶Pyridine(上海展雲化學公司)，含量≥99.5％
甘油glycerinum(醫藥集團上海化學試劑公司)，含量≥99.9％
蛋白腖Peptone(安琪生物公司)
酵母膏Yeast extract(安琪生物公司)
鹽NaCl(安琪生物公司)
硫酸銨(NH4)2SO4(上海德川生物試劑公司)
磷酸二氫鉀KH2PO4(上海德川生物試劑公司)
磷酸氫二鉀K2HPO4(上海德川生物試劑公司)
七水硫酸鎂MgSO4·7H2O(上海華臣生物公司)
瓊脂(安琪生物公司)
Agar A(安琪生物公司)
超淨工作檯(上海匯佳生物儀器)
恆溫培養箱HZQ-X100(哈爾濱東聯電子技術開發公司)
立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50FBS(哈爾濱東聯電子技術開發公司)
臺式高速離心機(上海金鵬分析儀器有限公司)
PCR儀(BIO-RAD Laboratories-Segrate(Milan)Italy)
凝膠成像分析儀(BIO-RAD Laboratories-Segrate(Milan)Italy)
分光光度計UV-2100(上海第三分析儀器廠)
微量紫外分光光度計UV-1700(島津)
培養基和培養條件：
固體基礎鹽培養基中加入大約1.5％瓊脂，121℃高壓滅菌30min。
固體LB培養基中加入大約1.5％瓊脂，121℃高壓滅菌30min。
做特性檢測時，用LB培養基，需要測試鹽濃度對菌生長的影響時，控制NaCl的量，需要測試pH時，則加入HCl或者NaOH調節酸鹼度。
發酵培養基、種子罐的培養基、生產罐的培養基配方相同，均為葡萄糖0.1wt％、NaCl1.0wt％、蛋白腖0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶劑為蒸餾水，pH7.2-7.5。
有益效果：由現有技術相比較，本發明經分離篩選獲得吡啶降解菌株A6(Rhizobium radiobacter A6)，用於降解土壤或水體環境中殘留的吡啶；該菌株製備的降解菌劑能降解吡啶，本菌劑可在短時間內使土壤殘留的吡啶的降解率達95％以上，使高濃度的吡啶廢水中吡啶降解率達98％以上，解決殘留吡啶對土壤水體環境、農作物和人體健康的危害問題。
本發明的降解菌劑可以用發酵工業通用發酵設備進行生產，具有生產成本低，使用方便，去除效果好的優點，適合治理土壤和水體環境中吡啶的汙染；本發明對於保護生態環境，保護人體的身體健康具有重要的意義。
附圖說明
圖1為菌株A6 3天降解吡啶的紫外圖譜；
圖2為菌株A6菌落照片；
圖3為菌株A6的系統進化樹；
圖4為菌株A6不同鹽濃度下的生長圖譜；
圖5為菌株A6不同pH下的生長圖譜；
圖6為菌株A6不同溫度下的生長圖譜。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
實施例1
菌株A6的分離和鑑定：
用來富集吡啶降解菌株的富集基質取自安徽省皖北藥業股份有限公司的藥廠廢水生化處理池的活性汙泥，取活性汙泥5.0g加入基礎鹽培養基中，加入50mg·L-1的吡啶，30℃，150rpm培養7d，以5％的接種量轉接到相同的培養基中，連續轉接3次，梯度稀釋富集液，取10-4-10-7稀釋度的富集液各0.1mL塗布於加有100mg·L-1吡啶的固體基礎鹽培養基平板上，30℃培養3d後，挑取長出的單菌落接種於含200mg·L-1吡啶基礎鹽培養基中，30℃，180rpm培養3d，驗證其降解菌液的降解效果。
含吡啶的基礎鹽培養基中吡啶的降解與否，可通過觀察培養液由澄清變混濁的現象進行初步判斷。
降解效果的驗證方法：採用UV-1700微量紫外分光光度計測定吡啶的質量濃度。往待測降解菌液中加入等量體積的二氯甲烷，劇烈振蕩5-10min，然後靜置直到水相和有機相完全分層，吸取上層水相，保留有機相，上層水相再一次用等體積的二氯甲烷萃取，兩次得到的有機相經無水硫酸鈉去除殘留的水分 後，於紫外-可見分光光度計上在波長200-350nm範圍內進行掃描。通過吡啶在200nm-350nm處的特徵吸收峰峰值的高低來判斷降解液中吡啶濃度的高低。
從富集液中，分離到1株吡啶降解菌，命名為A6，該菌在3d內對5000mg·L-1的吡啶的降解紫外圖譜，如圖1所示。其中處理為在基礎鹽培養基中加入終濃度為5000mg·L-1的吡啶，按1％體積比的接種量接入對數期的菌株A6菌液，對照為在基礎鹽培養基中加入終濃度為5000mg·L-1的吡啶，按1％體積比的接種量接種滅活的對數期的菌株A6菌液，結果表明，加入菌株A6的處理3d內對5000mg·L-1吡啶的降解率達到98％以上。
菌株A6在固體LB培養基上生長3d後，A6菌落呈圓形，邊緣整齊，呈透明至淡黃色，如圖2所示。
以菌株A6的基因組DNA為模板，用細菌16S rRNA基因序列通用引物進行PCR擴增，得到長度為1348bp的16S rDNA基因序列，如SEQ ID No：1所示。在EzTaxon資料庫(www.ezbiocloud.net)中進行Blast，結果表明菌株A6與根瘤菌(Rhizobium)菌株的同源性最近，與模式菌株與Rhizobium radiobacter ATCC 19358T(AJ389904)的同源性達到99.7％，建立系統發育樹如圖3所示，結合形態和生理生化特徵，將菌株a6初步鑑定為放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)，命名為放射根瘤菌A6(Rhizobium radiobacter A6)。將該菌株A6送交位於中國武漢，中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏時間為2016年10月24日，保藏編號為CCTCC NO:M 2016592。
實施例2
不同鹽濃度菌株A6生長量的分析：
取5支潔淨試管分別加入2mL LB培養液，以鹽濃度0％、1％、2％、3％、4％，探究不同鹽濃度對吡啶降解菌A6的生長影響。培養條件為30℃、150r/min恆溫搖床振蕩培養，培養24h後用分光光度計測定在600nm時培養液的光密度。結果如圖4所示，當鹽濃度在0-1％時A6可以生長，在此範圍內增加鹽濃度對菌的生長影響很小，並且在1％時達到最高峰。但隨著鹽濃度的進一步提高，A6生長均呈現下降趨勢.當鹽濃度達到4％時沒有菌生長。
不同pH菌株A6生長量的分析：
取7支潔淨試管分別加入2mL LB培養液，調節其pH使其分成4、5、6、7、8、9、10七個梯度以探究不同pH對吡啶降解菌A6的生長影響，培養條件為30℃、150r/min恆溫搖床培養，培養24h後用分光光度計測定在600nm時培養液的光密度。結果如圖5所示，A6在pH為6-9之間長勢較好，在pH為7時略有降低，但A6總體趨勢從6-8均呈現上升趨勢，在pH為8時達到峰值，當pH繼續提高 時，菌生長呈減弱趨勢，當pH到達10時，基本沒有菌的生長。
不同溫度菌株A6生長量的分析：
取5支潔淨試管分別加入2ml LB培養液，以15℃、20℃、30℃、37℃、42℃的探究不同溫度對吡啶降解菌A6的生長影響，培養條件為30℃、150r/min，上述不同溫度搖床振蕩培養，培養24h後用分光光度計測定在600nm時培養液的光密度。結果如圖6所示，A6在溫度為30-37℃之間生長旺盛，尤其30℃附近生長到達頂峰，從20℃之後兩種菌生長均呈現上升趨勢，從30℃之後呈下滑趨勢，到達42℃已無菌生長。
實施例3
菌株A6的降解菌劑的製備
1)將降解菌株A6培養到對數期的試管液按0.5％體積比的接種量接種於100mL發酵培養基中，振蕩培養至對數期，製得發酵菌種；
2)將上述製得發酵菌種按5％(v/v，以培養基體積為基準)的接種量接種入裝液量為70％(以發酵罐體積為基準，下同)的500升種子罐的培養基中培養，培養至對數生長期，製得種子液；
3)將種子液按9％(v/v，以培養基體積為基準，下同)的接種量接入裝液量為70％的生產罐的培養基中培養。
4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:1.5，攪拌速度為250rpm，培養溫度為25℃，整個工藝流程培養時間為36小時，發酵結束後菌體數量達到10億/mL以上。發酵完成後培養液出罐直接用塑料包裝桶分裝成液體劑。
實施例4
菌株A6的降解菌劑的製備
1)將降解菌株A6培養到對數期的試管液按1.5％體積比的接種量接種於100mL發酵培養基中，振蕩培養至對數期，製得發酵菌種；
2)將上述製得發酵菌種按8％(v/v，以培養基體積為基準)的接種量接種入裝液量為70％(以發酵罐體積為基準，下同)的500升種子罐的培養基中培養，培養至對數生長期，製得種子液；
3)將種子液按8％(v/v，以培養基體積為基準，下同)的接種量接入裝液量為70％的生產罐的培養基中培養。
4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0.8，攪拌速度為180rpm，培養溫度為32℃，整個工藝流程培養時間為48小時，發酵結束後菌體數量達到10億/mL以上。發酵完成後培養液出罐直接用塑料包裝桶分裝成液體 劑。
實施例5
菌株A6的降解菌劑的製備
1)將降解菌株A6培養到對數期的試管液按1％體積比的接種量接種於100mL發酵培養基中，振蕩培養至對數期，製得發酵菌種；
2)將上述製得發酵菌種按10％(v/v，以培養基體積為基準)的接種量接種入裝液量為70％(以發酵罐體積為基準，下同)的500升種子罐的培養基中培養，培養至對數生長期，製得種子液；
3)將種子液按10％(v/v，以培養基體積為基準，下同)的接種量接入裝液量為70％的生產罐的培養基中培養。
4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:1.2，攪拌速度為220rpm，培養溫度為30℃，整個工藝流程培養時間為42小時，發酵結束後菌體數量達到10億/mL以上。發酵完成後培養液出罐直接用塑料包裝桶分裝成液體劑。
試驗例1
菌株A6降解菌劑對土壤中吡啶的降解試驗：
採取菜園土作為供試土樣。將土樣過2mm篩，取一定量的吡啶溶於水中，將其均勻拌入1000g土壤中，使土壤中吡啶終濃度均為3000mg·kg-1，準備9份相同的土樣，將實施例3、4、和5製備的菌株A6降解菌劑，以5％的接種量(體積/重量)分別接入到上述1000g土壤中，每個做三個平行實驗，於30℃恆溫黑暗培養箱中培養，設不接菌的相同土壤作為對照，期間土壤的持水量保持在60％，培養5天後，利用高效液相色譜測定殘留量。測定結果為實施例3、4和5的降解菌劑在5天內對土壤中吡啶降解率分別達到96.4％、98.6％、99.5％。
試驗例2
菌株A6降解菌劑對廢水中吡啶的降解試驗：
採取藥廠廢水生化處理池中含有吡啶的廢水作為試樣，廢水中的吡啶終濃度均為5000mg·L-1。將廢水分成9份，每份廢水為5L,將實施例3、4、和5製備的菌株A6降解菌劑，以5％的接種量(體積比)分別接入到上述5L廢水中，每個做三個平行實驗，於常溫黑暗培養，設不接菌劑的相同廢水作為對照，培養5天後，利用高效液相色譜測定殘留量。測定結果為實施例3、4和5的降解菌劑在5天內對廢水中吡啶降解率分別達到98.5％、98.2％、99.3％。
SEQUENCE LISTING
安徽師範大學
一株吡啶降解菌株A6及其生產的菌劑和應用
1
1
PatentIn version 3.3
1
1348
DNA
根瘤菌屬（Rhizobium radiobacter）
1
gtcgaacgcc ccgcaagggg agtggcagac gggtgagtaa cgcgtgggaa catacccttt 60
cctgcggaat agctccggga aactggaatt aataccgcat acgccctacg ggggaaagat 120
ttatcgggga aggattggcc cgcgttggat tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa 180
ggcgacgatc catagctggt ctgagaggat gatcagccac attgggactg agacacggcc 240
caaactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa tgggcgcaag cctgatccag 300
ccatgccgcg tgagtgatga aggccttagg gttgtaaagc tctttcaccg gagaagataa 360
tgacggtatc cggagaagaa gccccggcta acttcgtgcc agcagccgcg gtaatacgaa 420
gggggctagc gttgttcgga attactgggc gtaaagcgca cgtaggcgga tatttaagtc 480
aggggtgaaa tcccagagct caactctgga actgcctttg atactgggta tcttgagtat 540
ggaagaggta agtggaattc cgagtgtaga ggtgaaattc gtagatattc ggaggaacac 600
cagtggcgaa ggcggcttac tggtccatta ctgacgctga ggtgcgaaag cgtggggagc 660
aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgttag ccgtcgggca 720
gtatactgtt cggtggcgca gctaacgcat taaacattcc gcctggggag tacggtcgca 780
agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 840
tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccagctc ttgacattcg gggtatgggc attggagacg 900
atgtccttca gttaggctgg ccccagaaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 960
gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gcccttagtt gccagcattt 1020
agttgggcac tctaagggga ctgccggtga taagccgaga ggaaggtggg gatgacgtca 1080
agtcctcatg gcccttacgg gctgggctac acacgtgcta caatggtggt gacagtgggc 1140
agcgagacag cgatgtcgag ctaatctcca aaagccatct cagttcggat tgcactctgc 1200
aactcgagtg catgaagttg gaatcgctag taatcgcaga tcagcatgct gcggtgaata 1260
cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agttggtttt acccgaaggt 1320
agtgcgctaa ccgcaaggag gcagctaa 1348