一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法

2023-06-20 18:41:36

專利名稱：一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法
技術領域：
本發明涉及一種報告基因系統，尤其是涉及一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其為一種通過構建雙模態成像報告基因系統，來非入侵式監測內源microRNA表達水平的方法。背景技術：
microRNA是一類長度在22個核苷酸(nt)左右的內源性非編碼小分子單鏈RNA，能通過與靶基因mRNA的3』非翻譯區完全或不完全互補配對，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯。大量科學研究表明，microRNA在一系列的生物學過程如發育、增殖、代謝及凋亡等中都發揮著重要的調節功能。現今監測microRNA表達水平的傳統方法主要有Norhtern雜交、原位雜交、實時定量PCR或基因晶片等。然而這些監測方法不僅耗費時間和人力，更為重要的是，它們在操作過程中要求固定或裂解細胞，導致細胞死亡，因而不能在活體狀態下研究microRNA的表達水平以及監測其在生命活動中的調控作用。雖然目前也有報導活體研究microRNA表達的成像技術，但都是基於單一模態的成像技術，不能獲得完整清晰的活體的全部信息。
發明內容
本發明的目的在於提供一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其提供了 microRNA表達調控相關研究的分子成像報告基因系統，為深入研究microRNA 在組織細胞內的表達水平及其對生命活動的調控功能奠定了基礎。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為
一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其特徵在於(1) 利用人鈉/碘共同轉運體基因能夠吸收放射性碘而作為報告基因用於核素成像的特性， 將hNIS基因克隆到質粒pcDNA3. 1多克隆位點上，從而得到質粒pcDNA3. 1-hNIS ；(2) 利用螢光蟲螢光素酶可以作為報告基因用於生物發光成像的特性，將Fluc基因克隆到 pcDNA3. Ι-hNIS上，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ； (3) 利用microRNA與靶標mRNA通過鹼基互補配對的形式相互作用的特性，將與microRNA_16 完全互補配對的三段串聯重複序列克隆到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS上，從而獲得雙模態成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0在步驟(1)中，通過PCR擴增全長hNIS基因，然後克隆到pcDNA3. 1的HindIII和 EcoRI酶切位點之間，從而得到質粒pcDNA3. 1-hNIS。在步驟(2)中，通過PCR擴增全長Fluc基因，然後克隆到pcDNA3. 1-hNIS 的NheI和HindIII酶切位點之間，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得 pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。在步驟(3)中，通過化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯重複序列，然後克隆到Fluc - hNIS融合基因的下遊EcoRV和BioI之間，從而獲得雙模態成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0
在步驟(1)中，PCR擴增全長hNIS基因，凝膠電泳及膠回收PCR產物，將膠回收產物使用HindIII和EcoRI進行雙酶切，得到hNIS基因雙酶切產物；提取質粒pcDNA3. 1，使用HindIII和EcoRI進行雙酶切，然後進行膠回收，得到pcDNA3. 1膠回收產物；將hNIS基因雙酶切產物和pcDNA3. 1膠回收產物與T4 DNA連接酶和緩衝液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然後挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的質粒 pcDNA3. 1-hNISο在步驟(2)中，PCR擴增全長Fluc基因，凝膠電泳及膠回收PCR產物，將膠回收產物使用NheI和HindIII進行雙酶切，得到Fluc基因雙酶切產物；提取質粒pcDNA3. 1-hNIS， 使用NheI和HindIII進行雙酶切，然後進行膠回收，得到pcDNA3. l_hNIS膠回收產物；將 Fluc基因雙酶切產物和pcDNA3. Ι-hNIS膠回收產物與"Γ4 DNA連接酶和緩衝液混合，放在 16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然後挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的質粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。在步驟(3)中，化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯重複序列，並且合成的重複序列兩端帶有EcoRV和BioI酶切位點，然後進行雙鏈的退火反應，得到退火的雙鏈序列；提取質粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS,使用EcoRV和BioI進行雙酶切，然後進行膠回收，得到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS膠回收產物；將退火的雙鏈序列和pcDNA3. l-Fluc-hNIS 膠回收產物與T4 DNA連接酶和緩衝液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然後挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的雙模態成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下
本發明的雙模態成像報告基因，能夠對microRNA的表達水平同時進行生物發光成像和核素PET成像兩種成像模態，打破了目前對microRNA成像只有單一模態的局限，這對於採用分子影像技術在體無創監測microRNA的表達水平及闡述microRNA在生命活動中的調控機制和生物學功能具有非常重要的意義。四

圖1為雙模態成像報告基因結構模式圖
圖2為報告基因Fluc體外螢光素酶測定和報告基因hNIS體外放射性碘攝取測定結果
圖
圖3為報告基因FH-3xmirl6TS在動物體內的生物發光和核素PET雙模態成像結果圖五具體實施例方式
本發明為一種利用hNIS基因可用於核素成像和Fluc基因可用於生物發光成像的特性，將hNIS基因和Fluc基因克隆到pcDNA3. 1載體中進行融合表達，進而建立在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法。本發明採用以下技術方案
(1)利用人鈉/碘共同轉運體基因(humansodium/iodide symporter, hNIS)能夠吸收放射性碘而作為報告基因用於核素成像的特性，將hNIS基因克隆到質粒pcDNA3. 1多克隆位點上，從而得到質粒pcDNA3. 1-hNIS; (2)利用螢光蟲螢光素酶(firefly luciferase, Flue)可以作為報告基因用於生物發光成像的特性，將Fluc基因克隆到pcDNA3. 1-hNIS上， 使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ； (3)利用microRNA與靶標mRNA通過鹼基互補配對的形式相互作用的特性，將與microRNA-16完全互補配對的三段串聯重複序列(總長約70bp)克隆到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS上，從而獲得雙模態成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0實施例
1.質粒PCDNA3. Ι-hNIS的克隆
PCR擴增全長hNIS基因，凝膠電泳及膠回收PCR產物，將膠回收產物使用HindIII 和EcoRI進行雙酶切，得到hNIS基因雙酶切產物；提取質粒pcDNA3. 1，使用HindIII和 EcoRI進行雙酶切，然後進行膠回收，得到pcDNA3. 1膠回收產物；將hNIS基因雙酶切產物和pcDNA3. 1膠回收產物與T4 DNA連接酶和緩衝液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然後挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的質粒 pcDNA3. 1-hNISο2.質粒 pcDNA3. Ι-Fluc-hNIS 的克隆
PCR擴增全長Fluc基因(不含終止密碼子)，凝膠電泳及膠回收PCR產物，將膠回收產物使用NheI和HindIII進行雙酶切，得到Fluc基因雙酶切產物；提取質粒pcDNA3. 1-hNIS， 使用NheI和HindIII進行雙酶切，然後進行膠回收，得到pcDNA3. 1-hNIS膠回收產物；將 Fluc基因雙酶切產物和pcDNA3. Ι-hNIS膠回收產物與"Γ4 DNA連接酶和緩衝液混合，放在 16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然後挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的質粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。3.報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS_3xmirl6TS 的克隆
化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯重複序列(總長約70bp)，並且合成的重複序列兩端帶有EcoRV和BioI酶切位點，然後進行雙鏈的退火反應，得到退火的雙鏈序列；提取質粒pcDNA3. Ι-Fluc-hNIS,使用EcoRV和BioI進行雙酶切，然後進行膠回收，得到pcDNA3. Ι-Fluc-hNIS膠回收產物；將退火的雙鏈序列和pcDNA3. 1-Fluc-hNIS 膠回收產物與T4 DNA連接酶和緩衝液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然後挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的雙模態成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS (FH_3xmirl6TS)，參見圖 1。4.鑑定
4. 1報告基因Fluc體外螢光素酶測定(參見圖2A)
為了驗證報告基因Fluc的活性，在6孔板中培養人胃癌細胞系SGC 7901，之後將雙模態報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS (FH-3xmirl6TS)分別與 microRNA-16 (mir-16) RNA mimics及對照ctrl mimics共轉染到SGC 7901細胞中，或者只轉染 FH-3xmirl6TS質粒和對照空載質粒pcDNA3. l-Fluc-hNIS (FH)到SGC 7901細胞中，培養 48小時後，收集細胞，採用生物發光檢測儀測定細胞中的螢光素酶含量。結果參見圖2A，與對照組相比，不論是將FH-3xmirl6TS與mir_16共轉染，還是只轉染質粒FH-3xmirl6TS，細胞中的螢光素酶活性都大大降低，分別約為對照組的16%和31%。4. 2報告基因hNIS體外放射性碘攝取測定(參見圖2B)
為了測定報告基因hNIS的活性，在6孔板中培養SGC 7901細胞，之後將FH-3xmirl6TS 分別與mir-16 RNA mimics及對照ctrl mimics共轉染到SGC 7901細胞中，或者只轉染 FH-3xmirl6TS質粒和對照空載質粒pcDNA3. l-Fluc-hNIS (FH)到SGC 7901細胞中，繼續培養M小時後，吸棄培養液，用冰冷的PBS洗3次，然後每孔加入含NaiwI 74 Mq的Hanks 培養液1 ml，之後細胞繼續培養1小時後，收集細胞，使用g計數器計數測定各孔中的放射性碘含量。結果參見圖2B，與對照組相比，不論是將FH-3xmirl6TS與mir-16共轉染，還是只轉染質粒FH-3xmirl6TS，細胞中的放射性碘攝取量都明顯降低，分別約為對照組的和 72%。
4. 3報告基因FH-3xmirl6TS在動物體內的生物發光和核素PET雙模態成像(參見圖3)生物發光成像培養SGC 7901細胞，將報告基因FH-3xmirl6TS和對照質粒ΠΙ分別轉染SGC 7901細胞，24小時後，採用G418抗生素進行篩選，篩選3周後，得到穩定表達ΠΙ和FH-3xmirl6TS的SGC 7901細胞系，G418濃度為600 ug/ml。之後分別將FH禾口 FH-3xmirl6TS細胞收集、計數，調整濃度為IxlO7個細胞/ml，然後分別將這些細胞注入6 周大小的雌性BALB/c裸鼠(重量約20-25g)的左右兩腿皮下，左側為 轉染的細胞，右側為FH-3xmirl6TS轉染的細胞。M小時後，以洲異氟烷吸入麻醉小鼠，注射底物150 mg/kg 的 D-Iuciferin，採用生物發光成像系統(Xenogen IVIS Kinetic, Caliper, CA, USA)進行生物發光信號的獲取。結果參見圖3A，小鼠右側的生物發光信號比左側的信號要弱的多，表明報告基因FH-3xmirl6TS在體內受到了內源microRNA-16表達的抑制。
核素PET成像將穩定轉染了 ra和FH-3xmirl6TS的SGC 7901細胞系分別注入小鼠左右肩皮下，左側為FH-3Xmirl6TS轉染的細胞右側為Hl轉染的細胞，培養三周，使小鼠成瘤。之後通過小鼠尾靜脈注射18. 5 MBq 124I,採用2%異氟烷麻醉小鼠後，將小鼠放在microPET成像系統上進行不同位置的信號採集。結果參見圖3B，分別做了小鼠的水平面(horizontal )、冠狀面(coronal)和矢狀面(sagittal)成像，可以看到小鼠左側信號 (FH-3xmirl6TS轉染組)比右側信號(!7H轉染組)要弱的多，表明報告基因FH-3xmirl6TS在體內受到了內源microRNA-16表達的抑制。
權利要求
1.一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其特徵在於 (1)利用人鈉/碘共同轉運體基因能夠吸收放射性碘而作為報告基因用於核素成像的特性，將hNIS基因克隆到質粒pcDNA3. 1多克隆位點上，從而得到質粒pcDNA3. 1-hNIS ； (2) 利用螢光蟲螢光素酶可以作為報告基因用於生物發光成像的特性，將Fluc基因克隆到 pcDNA3. Ι-hNIS上，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ； (3) 利用microRNA與靶標mRNA通過鹼基互補配對的形式相互作用的特性，將與microRNA_16 完全互補配對的三段串聯重複序列克隆到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS上，從而獲得雙模態成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0
2.根據權利要求書所述的一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其特徵在於在步驟(1)中，通過PCR擴增全長hNIS基因，然後克隆到pcDNA3. 1的 HindIII和EcoRI酶切位點之間，從而得到質粒pcDNA3. 1-hNIS。
3.根據權利要求書所述的一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其特徵在於在步驟(2)中，通過PCR擴增全長Fluc基因，然後克隆到pcDNA3. 1-hNIS 的NheI和HindIII酶切位點之間，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得 pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。
4.根據權利要求書所述的一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其特徵在於在步驟(3)中，通過化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯重複序列，然後克隆到Fluc - hNIS融合基因的下遊EcoRV和B10I之間，從而獲得雙模態成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0
5.根據權利要求1或2所述的一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其特徵在於步驟(1)中，PCR擴增全長hNIS基因，凝膠電泳及膠回收PCR產物，將膠回收產物使用HindIII和EcoRI進行雙酶切，得到hNIS基因雙酶切產物；提取質粒pcDNA3. 1，使用 HindIII和EcoRI進行雙酶切，然後進行膠回收，得到pcDNA3. 1膠回收產物；將hNIS基因雙酶切產物和pcDNA3. 1膠回收產物與T4 DNA連接酶和緩衝液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然後挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的質粒 pcDNA3. 1-hNIS。
6.根據權利要求1或3所述的一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其特徵在於步驟(2)中，PCR擴增全長Fluc基因，凝膠電泳及膠回收PCR產物，將膠回收產物使用 NheI和HindIII進行雙酶切，得到Fluc基因雙酶切產物；提取質粒pcDNA3. 1-hNIS,使用 NheI和HindIII進行雙酶切，然後進行膠回收，得到pcDNA3. 1-hNIS膠回收產物；將Fluc基因雙酶切產物和pcDNA3. Ι-hNIS膠回收產物與T4 DNA連接酶和緩衝液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然後挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的質粒 pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ；步驟(3)中，化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯重複序列，並且合成的重複序列兩端帶有EcoRV和B10I酶切位點，然後進行雙鏈的退火反應，得到退火的雙鏈序列；提取質粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS,使用EcoRV和BioI進行雙酶切，然後進行膠回收，得到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS膠回收產物；將退火的雙鏈序列和pcDNA3. 1-Fluc-hNIS膠回收產物與jM DNA連接酶和緩衝液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然後挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的雙模態成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TSo
全文摘要
本發明涉及一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其提供了microRNA表達調控相關研究的分子成像報告基因系統，為深入研究microRNA在組織細胞內的表達水平及其對生命活動的調控功能奠定了基礎。本發明採用的技術方案為(1)利用人鈉／碘共同轉運體基因能夠吸收放射性碘而作為報告基因用於核素成像的特性，將hNIS基因克隆到質粒pcDNA3.1多克隆位點上，從而得到質粒pcDNA3.1-hNIS;(2)利用螢光蟲螢光素酶可以作為報告基因用於生物發光成像的特性，將Fluc基因克隆到pcDNA3.1-hNIS上，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得pcDNA3.1-Fluc-hNIS；(3)利用microRNA與靶標mRNA通過鹼基互補配對的形式相互作用的特性，將與microRNA-16完全互補配對的三段串聯重複序列克隆到pcDNA3.1-Fluc-hNIS上，從而獲得雙模態成像報告基因pcDNA3.1-Fluc-hNIS-3xmir16TS。
文檔編號C12N15/66GK102533834SQ201110334119
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月8日 優先權日2012年3月8日
發明者曹豐, 梁繼民, 王慎旭, 王福, 田捷 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學, 西安電子科技大學